Методы молекулярной детекции способны производить большой объем нуклеиновой кислоты за счет амплификации следовых количеств, обнаруженных в образцах.Хотя это полезно для обеспечения чувствительного обнаружения, оно также создает возможность загрязнения из-за распространения амплифицирующих аэрозолей в лабораторной среде.При проведении экспериментов могут быть приняты меры, чтобы избежать загрязнения реагентов, лабораторного оборудования и рабочего пространства, поскольку такое загрязнение может давать ложноположительные (или ложноотрицательные) результаты.

Чтобы снизить вероятность заражения, необходимо постоянно соблюдать Надлежащую лабораторную практику.В частности, следует соблюдать меры предосторожности в отношении следующих моментов:

1. Обращение с реагентами
2. Организация рабочего места и оборудования
3. Рекомендации по использованию и очистке выделенного молекулярного пространства.
4. Общие рекомендации по молекулярной биологии
5. Внутренний контроль
6. Библиография

1. Обращение с реагентами

Кратковременно центрифугируйте пробирки с реагентами перед открытием, чтобы избежать образования аэрозолей.Аликвотные реагенты во избежание многократного замораживания-оттаивания и загрязнения основных запасов.Четко маркируйте и датируйте все реагенты и реакционные пробирки и ведите журналы с номерами партий и партий реагентов, используемых во всех экспериментах.Пипетируйте все реагенты и образцы, используя наконечники с фильтром.Перед покупкой рекомендуется уточнить у производителя, подходят ли наконечники с фильтром к используемой марке пипетки.

2. Организация рабочего места и оборудования

Рабочее пространство должно быть организовано так, чтобы поток работы происходил в одном направлении, от чистых зон (до ПЦР) до грязных зон (после ПЦР).Следующие общие меры предосторожности помогут снизить вероятность заражения.Имейте отдельные специально отведенные помещения или, как минимум, физически отдельные зоны для: приготовления мастер-микса, экстракции нуклеиновой кислоты и добавления матрицы ДНК, амплификации и обработки амплифицированного продукта, а также анализа продукта, например, гель-электрофореза.

В некоторых условиях иметь 4 отдельные комнаты сложно.Возможным, но менее желательным вариантом является приготовление мастермикса в изолированной зоне, например, в ламинарном боксе.В случае амплификации гнездовой ПЦР приготовление мастер-микса для второго раунда реакции должно быть подготовлено в «чистой» зоне для приготовления мастер-микса, но инокуляция первичным продуктом ПЦР должна проводиться в помещении для амплификации и, если возможно, в специальной изолированной зоне (например, в ламинарном боксе).

Для каждой комнаты/участка требуется отдельный набор пипеток с четкой маркировкой, наконечников с фильтрами, штативов для пробирок, вортексов, центрифуг (если применимо), ручек, универсальных лабораторных реагентов, лабораторных халатов и коробок с перчатками, которые останутся на соответствующих рабочих местах.При перемещении между обозначенными зонами необходимо мыть руки и менять перчатки и лабораторные халаты.Реагенты и оборудование не следует перемещать из грязной зоны в чистую.В крайнем случае, когда реагент или часть оборудования необходимо переместить назад, их необходимо сначала обеззаразить 10% раствором гипохлорита натрия, а затем протереть стерильной водой.

Примечание

10% раствор гипохлорита натрия необходимо ежедневно готовить свежим.При использовании для обеззараживания необходимо соблюдать минимальное время контакта 10 минут.
В качестве альтернативы можно использовать имеющиеся в продаже продукты, которые одобрены как дезинфицирующие средства для поверхностей, разрушающие ДНК, если местные рекомендации по безопасности не позволяют использовать гипохлорит натрия или если гипохлорит натрия не подходит для обеззараживания металлических частей оборудования.

В идеале персонал должен придерживаться принципа однонаправленного рабочего процесса и не переходить из грязных зон (после ПЦР) обратно в чистые зоны (до ПЦР) в тот же день.Однако могут быть случаи, когда это неизбежно.В таких случаях персонал должен позаботиться о том, чтобы тщательно вымыть руки, сменить перчатки, надеть специальный лабораторный халат и не выносить с собой какое-либо оборудование, например лабораторные журналы, которые они захотят снова вынести из помещения.Такие меры контроля должны быть подчеркнуты при обучении персонала молекулярным методам.

После использования рабочие места следует очистить 10% раствором гипохлорита натрия (а затем стерильной водой для удаления остатков отбеливателя), 70% этанолом или одобренным коммерчески доступным деконтаминантом, разрушающим ДНК.В идеале должны быть установлены ультрафиолетовые (УФ) лампы, чтобы обеспечить обеззараживание путем облучения.Однако использование УФ-ламп должно быть ограничено закрытыми рабочими зонами, например, защитными шкафами, чтобы ограничить воздействие УФ-излучения на лабораторный персонал.Пожалуйста, соблюдайте инструкции производителя по уходу, вентиляции и очистке УФ-ламп, чтобы обеспечить их эффективность.

При использовании 70% этанола вместо гипохлорита натрия для завершения дезактивации потребуется облучение УФ-светом.
Не очищайте вортекс и центрифугу гипохлоритом натрия;вместо этого протрите 70% этанолом и подвергните воздействию ультрафиолетового света или используйте коммерческое дезинфицирующее средство, разрушающее ДНК.В случае разливов обратитесь к производителю за дальнейшими рекомендациями по очистке.Если это разрешено инструкциями производителя, пипетки следует регулярно стерилизовать в автоклаве.Если пипетки нельзя автоклавировать, достаточно очистить их 10% раствором гипохлорита натрия (с последующим тщательным протиранием стерильной водой) или коммерческим деконтаминантом, разрушающим ДНК, с последующим воздействием УФ-излучения.

Очистка высокопроцентным гипохлоритом натрия может привести к повреждению пластика и металла пипеток, если делать это регулярно;сначала ознакомьтесь с рекомендациями производителя.Все оборудование необходимо регулярно калибровать в соответствии с графиком, рекомендованным производителем.Назначенное лицо должно отвечать за соблюдение графика калибровки, ведение подробных журналов и четкое отображение сервисных этикеток на оборудовании.

3. Рекомендации по использованию и очистке выделенного молекулярного пространства.

Предварительная ПЦР: Аликвотирование реагентов/приготовление мастер-микса: Это должно быть самое чистое из всех помещений, используемых для подготовки к молекулярным экспериментам, и в идеале это должен быть специальный бокс с ламинарным потоком, оборудованный УФ-лампой.В этой зоне нельзя работать с образцами, выделенной нуклеиновой кислотой и амплифицированными продуктами ПЦР.Реагенты для амплификации следует хранить в морозильной камере (или холодильнике, в соответствии с рекомендациями производителя) в одном и том же специально отведенном месте, в идеале рядом с ламинарным шкафом или зоной предварительной ПЦР.Перчатки следует менять каждый раз при входе в зону предварительной ПЦР или в ламинарный бокс.

Зону предварительной ПЦР или бокс с ламинарным потоком следует очищать до и после использования следующим образом: протрите все предметы в шкафу, например, пипетки, коробки для наконечников, вортексы, центрифуги, штативы для пробирок, ручки и т. д. 70% этанолом или коммерческого деконтаминанта, разрушающего ДНК, и дайте высохнуть.В случае закрытой рабочей зоны, например, в ламинарном шкафу, подвергайте колпак воздействию УФ-излучения на 30 минут.

Примечание

Не подвергайте реагенты воздействию УФ-излучения;перемещайте их в шкаф только после его очистки.При проведении ПЦР с обратной транскрипцией также может быть полезно протереть поверхности и оборудование раствором, разрушающим РНКазы при контакте.Это может помочь избежать ложноотрицательных результатов ферментативной деградации РНК.После обеззараживания и перед приготовлением мастермикса перчатки следует еще раз сменить, и тогда шкаф готов к работе.

Пре-ПЦР: Экстракция нуклеиновой кислоты/добавление матрицы:

Нуклеиновую кислоту необходимо выделять и обрабатывать во второй специально отведенной зоне с использованием отдельного набора пипеток, наконечников с фильтрами, штативов для пробирок, свежих перчаток, лабораторных халатов и другого оборудования. Эта зона также предназначена для добавления шаблона, элементов управления и линий тренда в пробирки или планшеты с мастермиксом.Во избежание загрязнения анализируемых образцов выделенных нуклеиновых кислот рекомендуется менять перчатки перед работой с положительными контролями или стандартами и использовать отдельный набор пипеток.Реагенты для ПЦР и продукты амплификации нельзя пипетировать в этой области.Образцы следует хранить в специально отведенных холодильниках или морозильных камерах в том же помещении.Рабочее пространство образца должно быть очищено так же, как и пространство мастермикса.

Пост-ПЦР: амплификация и обработка амплифицированного продукта

Это специально отведенное пространство предназначено для процессов после амплификации и должно быть физически отделено от областей, предшествующих ПЦР.Обычно он содержит термоциклеры и платформы реального времени, а в идеале должен иметь ламинарный бокс для добавления продукта ПЦР раунда 1 к реакции раунда 2, если проводится вложенная ПЦР.Реагенты для ПЦР и выделенные нуклеиновые кислоты нельзя обрабатывать в этой зоне, так как высок риск загрязнения.В этой зоне должен быть отдельный набор перчаток, лабораторных халатов, штативов для планшетов и пробирок, пипеток, наконечников с фильтром, контейнеров и другого оборудования.Перед открытием пробирки необходимо центрифугировать.Рабочее пространство образца должно быть очищено так же, как и пространство мастермикса.

Пост-ПЦР: анализ продукта

Это помещение предназначено для оборудования для обнаружения продукта, например, резервуаров для гель-электрофореза, блоков питания, УФ-трансиллюминатора и системы документирования геля.В этой зоне должны быть отдельные комплекты перчаток, лабораторных халатов, штативов для планшетов и пробирок, пипеток, наконечников с фильтром, контейнеров и другого оборудования.Никакие другие реагенты не могут быть внесены в эту зону, за исключением красителя для загрузки, молекулярного маркера и агарозного геля, а также компонентов буфера.Рабочее пространство образца должно быть очищено так же, как и пространство мастермикса.

Важная заметка

В идеале не следует входить в комнаты до ПЦР в тот же день, если работа уже была выполнена в комнатах после ПЦР.Если это совершенно неизбежно, убедитесь, что руки сначала тщательно вымыты, а в комнатах надеты специальные лабораторные халаты.Лабораторные журналы и документы нельзя брать в комнаты до ПЦР, если они использовались в комнатах после ПЦР;при необходимости возьмите дубликаты распечаток протоколов/идентификаторов образцов и т. д.

4. Общие рекомендации по молекулярной биологии

Используйте неопудренные перчатки, чтобы избежать ингибирования анализа.Правильная техника пипетирования имеет первостепенное значение для снижения контаминации.Неправильное пипетирование может привести к разбрызгиванию жидкости при дозировании и образованию аэрозолей.Рекомендации по правильному пипетированию можно найти по следующим ссылкам: руководство Гилсона по пипетированию, видеоролики о технике пипетирования Anachem, центрифугируйте пробирки перед открытием и открывайте их осторожно, чтобы избежать разбрызгивания.Закрывайте пробирки сразу после использования, чтобы избежать попадания загрязняющих веществ.

При проведении нескольких реакций подготовьте одну мастер-микс, содержащую общие реагенты (например, воду, dNTP, буфер, праймеры и фермент), чтобы свести к минимуму количество переносов реагентов и уменьшить угрозу загрязнения.Мастермикс рекомендуется поставить на лед или холодный блок.Использование фермента Hot Start может помочь уменьшить производство неспецифических продуктов.Защищайте реагенты, содержащие флуоресцентные зонды, от света во избежание деградации.

5. Внутренний контроль

Включите хорошо охарактеризованные, подтвержденные положительные и отрицательные контроли, а также контроль без шаблона во всех реакциях и многоточечную линию тренда для количественных реакций.Положительный контроль не должен быть настолько сильным, чтобы представлять риск контаминации.Включите положительные и отрицательные контроли извлечения при выполнении извлечения нуклеиновой кислоты.

Рекомендуется разместить четкие инструкции в каждой из областей, чтобы пользователи были осведомлены о правилах поведения.Диагностические лаборатории, выявляющие очень низкие уровни ДНК или РНК в клинических образцах, могут захотеть принять дополнительные меры безопасности, предусмотрев отдельные системы обработки воздуха с небольшим положительным давлением воздуха в помещениях для предварительной ПЦР и слегка отрицательным давлением воздуха в помещениях после ПЦР.

Наконец, полезно разработать план обеспечения качества (QA).Такой план должен включать списки основных и рабочих запасов реагентов, правила хранения наборов и реагентов, отчеты о результатах контроля, программы обучения персонала, алгоритмы устранения неполадок и корректирующие действия, когда это необходимо.

6. Библиография

Аслан А., Кинзельман Дж., Дрелин Э., Ананьева Т., Лавандер Дж. Глава 3: Создание лаборатории количественной ПЦР.Руководство по тестированию рекреационных вод с использованием метода количественной ПЦР USEPA 1611. Университет штата Лансинг-Мичиган.

Общественное здравоохранение Англии, NHS.Стандарты Великобритании для микробиологических исследований: Надлежащая лабораторная практика при проведении анализов молекулярной амплификации).Руководство по качеству.2013;4(4):1–15.

Миффлин Т. Создание лаборатории ПЦР.Протокол Колд-Спринг-Харб.2007;7.

Schroeder S 2013. Текущее обслуживание центрифуг: очистка, техническое обслуживание и дезинфекция центрифуг, роторов и адаптеров (Белая книга № 14).Гамбург: Эппендорф;2013.

Виана Р.В., Уоллис CL.Надлежащая клиническая лабораторная практика (GCLP) для молекулярных тестов, используемых в диагностических лабораториях, В: Акьяр I, редактор.Широкий спектр контроля качества.Риека, Хорватия: Intech;2011: 29–52.