分子检测方法能够通过放大样品中发现的痕量来产生大量核酸。虽然这有利于实现灵敏检测，但它也引入了通过扩增气溶胶在实验室环境中传播而造成污染的可能性。在进行实验时，可以采取措施避免试剂、实验室设备和工作台空间受到污染，因为这种污染可能会产生假阳性（或假阴性）结果。

为帮助减少污染的可能性，应始终执行良好实验室规范。具体应注意以下几点：

1. 处理试剂
2.工作空间和设备的组织
3.指定分子空间的使用及清洗建议
4. 一般分子生物学建议
5、内部控制
6. 参考书目

1. 处理试剂

打开前短暂离心试剂管以避免产生气溶胶。等分试剂以避免多次冻融和主库存的污染。清楚地标记所有试剂和反应管并注明日期，并保存所有实验中使用的试剂批号和批号的日志。使用过滤吸头吸取所有试剂和样品。购买前，建议与制造商确认过滤器吸头是否适合所用移液器的品牌。

2.工作空间和设备的组织

工作区应进行组织，以确保工作流发生在一个方向，从清洁区域（PCR 前）到脏区（PCR 后）。以下一般预防措施将有助于减少污染的机会。有独立的指定房间，或至少物理上独立的区域，用于：mastermix 制备、核酸提取和 DNA 模板添加、扩增和扩增产物的处理，以及产物分析，例如凝胶电泳。

在某些情况下，拥有 4 个独立的房间很困难。一个可能但不太理想的选择是在密闭区域（例如层流柜）中进行预混液制备。在巢式 PCR 扩增的情况下，第二轮反应的 mastermix 的制备应在 mastermix 制备的“清洁”区域制备，但初级 PCR 产物的接种应在扩增室进行，如果可能的话在专门的隔离区（例如层流柜）。

每个房间/区域都需要一套单独的标签清晰的移液器、滤嘴、试管架、涡流器、离心机（如果相关）、笔、通用实验室试剂、实验室外套和手套盒，它们将留在各自的工作站。在指定区域之间移动时，必须洗手并更换手套和实验室外套。试剂和设备不应从脏区转移到清洁区。如果出现需要向后移动试剂或设备的极端情况，则必须首先用 10% 的次氯酸钠进行净化，然后用无菌水擦拭。

笔记

10% 的次氯酸钠溶液必须每天新鲜配制。用于去污时，应遵守至少 10 分钟的接触时间。
或者，如果当地安全建议不允许使用次氯酸钠或次氯酸钠不适合对设备的金属部件进行去污，则可以使用经验证可破坏 DNA 的表面去污剂的市售产品。

理想情况下，工作人员应遵守单向工作流程精神，而不是在同一天从脏区（PCR 后）返回清洁区（PCR 前）。但是，有时这是不可避免的。出现这种情况时，工作人员必须注意彻底洗手、更换手套、穿指定的实验服，并且不要再带任何他们想带出房间的设备，例如实验书。在分子方法的员工培训中应强调此类控制措施。

使用后，应使用 10% 次氯酸钠（然后用无菌水去除残留的漂白剂）、70% 乙醇或经过验证的市售 DNA 破坏去污剂清洁工作台空间。理想情况下，应安装紫外线 (UV) 灯，以便通过辐照进行去污。然而，紫外线灯的使用应限制在封闭的工作区域，例如安全柜，以限制实验室工作人员的紫外线照射。请遵守制造商关于 UV 灯保养、通风和清洁的说明，以确保灯保持有效。

如果使用 70% 乙醇代替次氯酸钠，则需要用紫外线照射才能完成去污。
不要用次氯酸钠清洗涡旋和离心机；相反，用 70% 的乙醇擦拭并暴露在紫外线下，或使用市售的 DNA 破坏去污剂。对于溢出物，请咨询制造商以获得进一步的清洁建议。如果制造商说明允许，移液器应定期用高压灭菌器消毒。如果移液器不能高压灭菌，用 10% 的次氯酸钠（然后用无菌水彻底擦拭）或用商业 DNA 破坏去污剂清洗它们就足够了，然后用紫外线照射。

如果定期使用高浓度次氯酸钠进行清洁，最终可能会损坏移液器的塑料和金属；首先检查制造商的建议。所有设备都需要根据制造商推荐的时间表定期校准。指定人员应负责确保遵守校准计划，维护详细的日志，并在设备上清楚地显示服务标签。

3.指定分子空间的使用及清洗建议

PCR 前：试剂等分/混合液准备：这应该是所有用于准备分子实验的空间中最干净的，理想情况下应该是配备紫外线灯的指定层流柜。不得在此区域处理样品、提取的核酸和扩增的 PCR 产物。扩增试剂应保存在同一指定空间的冰箱（或冰箱，根据制造商的建议）中，最好靠近层流柜或 PCR 前区域。每次进入 PCR 前区或层流柜时应更换手套。

PCR 前区或层流柜在使用前后应按如下方式清洁： 用 70% 乙醇或酒精擦拭柜内的所有物品，例如移液器、吸头盒、涡流器、离心机、管架、笔等。商业 DNA 破坏去污剂，并使其干燥。在封闭的工作区域（例如层流柜）的情况下，将通风柜暴露在紫外线下 30 分钟。

笔记

不要将试剂暴露在紫外线下；清洁后才将它们移入机柜。如果进行逆转录 PCR，用接触时分解 RNase 的溶液擦拭表面和设备也可能会有帮助。这可能有助于避免 RNA 酶降解的假阴性结果。去污后、配制 mastermix 前，应再次更换手套，然后柜子即可使用。

PCR 前：核酸提取/模板添加：

核酸必须在第二个指定区域提取和处理，使用一套单独的移液器、过滤器吸头、试管架、新鲜手套、实验室外套和其他设备。该区域还用于添加模板、控件和趋势线到mastermix 管或板。为避免正在分析的提取核酸样品受到污染，建议在处理阳性对照或标准品之前更换手套，并使用一套单独的移液器。不得在此区域吸取 PCR 试剂和扩增产物。样品应存放在同一区域的指定冰箱或冰柜中。样品工作区应以与主混合空间相同的方式清洁。

PCR 后：扩增产物的扩增和处理

该指定空间用于扩增后过程，应与 PCR 前区域在物理上分开。它通常包含热循环仪和实时平台，理想情况下应该有一个层流柜，用于将第 1 轮 PCR 产物添加到第 2 轮反应中（如果正在执行嵌套 PCR）。由于污染风险很高，因此不得在此区域处理 PCR 试剂和提取的核酸。这个区域应该有一套单独的手套、实验室外套、板和管架、移液器、过滤器吸头、垃圾箱和其他设备。试管在打开前必须离心。样品工作区应以与主混合空间相同的方式清洁。

PCR 后：产物分析

这个房间用于产品检测设备，例如凝胶电泳槽、电源组、紫外线透照仪和凝胶文件系统。这个区域应该有单独的手套、实验室外套、板和管架、移液器、过滤器吸头、垃圾箱和其他设备。除上样染料、分子标记物和琼脂糖凝胶、缓冲液成分外，其他试剂不得带入此区域。样品工作区应以与主混合空间相同的方式清洁。

重要的提示

理想情况下，如果工作已经在 PCR 后室进行，则不应在同一天进入 PCR 前室。如果这是完全不可避免的，请确保首先彻底清洗双手，并在房间内穿着特定的实验室外套。如果已经在 PCR 后室使用过，则不得将实验室书籍和文书带入 PCR 前室；如有必要，重复打印协议/样本 ID 等。

4. 一般分子生物学建议

使用无粉手套以避免测定抑制。正确的移液技术对于减少污染至关重要。不正确的移液会导致在分配液体时飞溅并产生气溶胶。可以在以下链接中找到正确移液的良好做法：Gilson 移液指南、Anachem 移液技术视频、打开前离心管，并小心打开它们以避免飞溅。使用后立即关闭管子以避免引入污染物。

进行多个反应时，准备一份包含常用试剂（例如水、dNTP、缓冲液、引物和酶）的 mastermix，以尽量减少试剂转移次数并降低污染威胁。建议在冰上或冷块上设置 mastermix。使用热启动酶可能有助于减少非特异性产物的产生。保护含有荧光探针的试剂避光以避免降解。

5、内部控制

包括特征明确、确认的阳性和阴性对照，以及所有反应中的无模板对照，以及用于定量反应的多点滴定趋势线。阳性对照不应该太强以至于造成污染风险。进行核酸提取时包括阳性和阴性提取对照。

建议在每个区域张贴明确的说明，以便用户了解行为规则。在临床样本中检测到极低水平 DNA 或 RNA 的诊断实验室可能希望采用额外的安全措施，即在 PCR 前室使用单独的空气处理系统，空气压力略为正，而在 PCR 后房间空气压力略为负。

最后，制定质量保证 (QA) 计划很有帮助。此类计划应包括试剂主库存和工作库存清单、试剂盒和试剂的储存规则、控制结果报告、员工培训计划、故障排除算法以及需要时的补救措施。

6. 参考书目

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