Awọn ọna wiwa molikula ni agbara lati gbejade iwọn didun nla ti acid nucleic nipasẹ imudara ti awọn iwọn wiwa ti a rii ninu awọn ayẹwo.Lakoko ti eyi jẹ anfani fun ṣiṣe iṣawari ifarabalẹ, o tun ṣafihan iṣeeṣe ti ibajẹ nipasẹ itankale awọn aerosols ampilifaya ni agbegbe yàrá yàrá.Nigbati o ba n ṣe awọn idanwo, awọn igbese le ṣee ṣe lati yago fun idoti ti awọn reagents, ohun elo yàrá ati aaye ibujoko, nitori iru idoti le ṣe agbekalẹ awọn abajade rere-rere (tabi eke-odi).

Lati ṣe iranlọwọ lati dinku iṣeeṣe ti ibajẹ, Iṣewadii yàrá ti o dara yẹ ki o ṣe adaṣe ni gbogbo igba.Ni pato, awọn iṣọra yẹ ki o ṣe nipa awọn aaye wọnyi:

1. Mimu reagents
2. Ajo ti workspace ati ẹrọ itanna
3. Lo ati imọ imọran fun aaye molikula ti a yàn
4. Imọran isedale molikula gbogbogbo
5. Awọn iṣakoso inu
6. Iwe itan

1. Mimu reagents

Ni soki centrifuge reagent tubes ṣaaju ṣiṣi lati yago fun iran ti aerosols.Aliquot reagents lati yago fun ọpọ didi-thaws ati idoti ti titunto si akojopo.Aami ni kedere ati ọjọ gbogbo reagent ati awọn tubes ifaseyin ati ṣetọju awọn akọọlẹ ti reagent pupọ ati awọn nọmba ipele ti a lo ninu gbogbo awọn idanwo.Pipette gbogbo reagents ati awọn ayẹwo lilo àlẹmọ awọn italolobo.Ṣaaju rira, o ni imọran lati jẹrisi pẹlu olupese pe awọn imọran àlẹmọ baamu ami iyasọtọ ti pipette lati ṣee lo.

2. Ajo ti workspace ati ẹrọ itanna

O yẹ ki o ṣeto aaye iṣẹ lati rii daju pe ṣiṣan iṣẹ waye ni itọsọna kan, lati awọn agbegbe mimọ (ṣaaju-PCR) si awọn agbegbe idọti (post-PCR).Awọn iṣọra gbogbogbo ti o tẹle yoo ṣe iranlọwọ lati dinku aye ti ibajẹ.Ni awọn yara ti o ya sọtọ, tabi ni awọn agbegbe lọtọ ti ara, fun: igbaradi mastermix, isediwon acid nucleic ati afikun awoṣe DNA, imudara ati mimu ọja imudara, ati itupalẹ ọja, fun apẹẹrẹ gel electrophoresis.

Ni diẹ ninu awọn eto, nini awọn yara lọtọ 4 nira.Aṣayan ti o ṣee ṣe ṣugbọn o kere si ni lati ṣe igbaradi mastermix ni agbegbe ifipamọ, fun apẹẹrẹ minisita ṣiṣan laminar kan.Ninu ọran ti imudara PCR ti itẹ-ẹiyẹ, igbaradi ti mastermix fun ifaseyin iyipo keji yẹ ki o pese silẹ ni agbegbe 'mimọ' fun igbaradi mastermix, ṣugbọn inoculation pẹlu ọja PCR akọkọ yẹ ki o ṣee ṣe ni yara imudara, ati pe ti o ba ṣeeṣe. ni agbegbe ifisilẹ iyasọtọ (fun apẹẹrẹ minisita ṣiṣan laminar).

Yara kọọkan / agbegbe nilo eto lọtọ ti awọn pipettes ti o ni aami kedere, awọn imọran àlẹmọ, awọn agbeko tube, awọn vortexes, centrifuges (ti o ba wulo), awọn aaye, awọn ohun elo laabu jeneriki, awọn aṣọ laabu ati awọn apoti ti awọn ibọwọ ti yoo wa ni awọn ibi iṣẹ oniwun wọn.Awọn ọwọ gbọdọ wa ni fo ati awọn ibọwọ ati awọn aṣọ laabu yipada nigbati o nlọ laarin awọn agbegbe ti a yan.Awọn atunbere ati ẹrọ ko yẹ ki o gbe lati agbegbe idọti si agbegbe mimọ.Ti ọran nla ba dide nibiti reagent tabi nkan ti ohun elo nilo lati gbe sẹhin, o gbọdọ kọkọ di aimọ pẹlu 10% iṣuu soda hypochlorite, atẹle nipa nu kuro pẹlu omi ifo.

Akiyesi

Ojutu iṣuu soda hypochlorite 10% gbọdọ jẹ tuntun lojoojumọ.Nigbati a ba lo fun isokuro, akoko olubasọrọ to kere ju ti iṣẹju mẹwa 10 yẹ ki o faramọ.
Ni ibomiiran, awọn ọja ti o wa ni iṣowo ti o jẹ ifọwọsi bi awọn imukuro oju ilẹ DNA le ṣee lo ti awọn iṣeduro aabo agbegbe ko ba gba laaye lilo iṣuu soda hypochlorite tabi ti iṣuu soda hypochlorite ko dara fun sisọ awọn ẹya onirin ti ohun elo kuro.

Bi o ṣe yẹ, oṣiṣẹ yẹ ki o faramọ awọn ilana ṣiṣan iṣẹ unidirectional ati pe ko lọ lati awọn agbegbe idọti (post-PCR) pada si awọn agbegbe mimọ (ṣaaju-PCR) ni ọjọ kanna.Sibẹsibẹ, awọn akoko le wa nigbati eyi ko ṣee ṣe.Nigbati iru iṣẹlẹ ba waye, oṣiṣẹ gbọdọ ṣọra lati wẹ ọwọ daradara, yi awọn ibọwọ pada, lo ẹwu laabu ti a yan ati maṣe ṣafihan eyikeyi ohun elo ti wọn yoo fẹ lati mu jade ninu yara lẹẹkansi, gẹgẹbi awọn iwe laabu.Iru awọn igbese iṣakoso yẹ ki o tẹnumọ ni ikẹkọ oṣiṣẹ lori awọn ọna molikula.

Lẹhin lilo, awọn aaye ibujoko yẹ ki o mọtoto pẹlu 10% iṣuu soda hypochlorite (atẹle nipasẹ omi ifo lati yọ biliisi ti o ku), 70% ethanol, tabi ifẹsẹmulẹ decontaminant DNA ti o wa ni iṣowo ti o wa.Bi o ṣe yẹ, awọn atupa ultra-violet (UV) yẹ ki o wa ni ibamu lati jẹ ki isọkuro nipasẹ itanna.Bibẹẹkọ, lilo awọn atupa UV yẹ ki o wa ni ihamọ si awọn agbegbe iṣẹ pipade, fun apẹẹrẹ awọn apoti ohun ọṣọ, lati le fi opin si ifihan UV oṣiṣẹ ti yàrá.Jọwọ duro nipa olupese ilana fun UV atupa itoju, fentilesonu ati ninu ni ibere lati rii daju wipe awọn atupa wa munadoko.

Ti o ba lo 70% ethanol dipo iṣuu soda hypochlorite, itanna pẹlu ina UV yoo nilo lati pari imukuro naa.
Ma ṣe nu vortex ati centrifuge pẹlu iṣuu soda hypochlorite;dipo, nu mọlẹ pẹlu 70% ethanol ki o si fi han si ina UV, tabi lo kan ti owo DNA-iparun decontaminant.Fun awọn itusilẹ, ṣayẹwo pẹlu olupese fun imọran mimọ siwaju sii.Ti awọn itọnisọna olupese ba gba laaye, awọn pipettes yẹ ki o jẹ sterilized nigbagbogbo nipasẹ autoclave.Ti pipettes ko ba le ṣe adaṣe, o yẹ lati sọ di mimọ pẹlu 10% iṣuu soda hypochlorite (atẹle nipasẹ piparẹ ni kikun pẹlu omi ti ko ni ifo) tabi pẹlu decontaminant ti n pa DNA ti iṣowo ti o tẹle pẹlu ifihan UV.

Ninu pẹlu iṣuu soda hypochlorite ti o ga ni ogorun le bajẹ bajẹ awọn pilasitik pipette ati awọn irin ti o ba ṣe ni ipilẹ deede;ṣayẹwo awọn iṣeduro lati ọdọ olupese akọkọ.Gbogbo ohun elo nilo lati ṣe iwọn deede ni ibamu si iṣeto-iṣeduro olupese.Eniyan ti o yan yẹ ki o wa ni idiyele ti idaniloju pe iṣeto isọdọtun wa ni ifaramọ, tọju awọn akọọlẹ alaye, ati awọn aami iṣẹ ti han kedere lori ohun elo.

3. Lo ati imọ imọran fun aaye molikula ti a yàn

Pre-PCR: Reagent aliquoting / mastermix igbaradi: Eyi yẹ ki o jẹ mimọ julọ ti gbogbo awọn aye ti a lo fun igbaradi ti awọn adanwo molikula ati pe o yẹ ki o jẹ minisita ṣiṣan laminar ti a yan ni ipese pẹlu ina UV.Awọn ayẹwo, acid nucleic ti a fa jade ati awọn ọja PCR ti o pọ ko gbọdọ ni ọwọ ni agbegbe yii.Awọn atunṣe imudara yẹ ki o wa ni ipamọ ninu firisa (tabi firiji, gẹgẹbi fun awọn iṣeduro olupese) ni aaye kanna ti a yan, ni pipe lẹgbẹẹ minisita ṣiṣan laminar tabi agbegbe iṣaaju PCR.Awọn ibọwọ yẹ ki o yipada ni akoko kọọkan nigbati wọn ba wọle si agbegbe iṣaaju-PCR tabi minisita ṣiṣan laminar.

Agbegbe iṣaaju PCR tabi minisita ṣiṣan laminar yẹ ki o di mimọ ṣaaju ati lẹhin lilo bi atẹle: Pa gbogbo awọn nkan kuro ninu minisita, fun apẹẹrẹ pipettes, awọn apoti sample, vortex, centrifuge, awọn agbeko tube, awọn aaye, ati bẹbẹ lọ pẹlu 70% ethanol tabi a Decontaminant ti n pa DNA ti iṣowo, ati gba laaye lati gbẹ.Ni ọran ti agbegbe iṣẹ pipade, fun apẹẹrẹ minisita ṣiṣan laminar, fi hood han si ina UV fun ọgbọn išẹju 30.

Akiyesi

Ma ṣe fi awọn reagents han si ina UV;nikan gbe wọn sinu minisita ni kete ti o ti mọ.Ti o ba n ṣe PCR transcription yiyipada, o tun le ṣe iranlọwọ lati nu awọn roboto ati ohun elo kuro pẹlu ojutu kan ti o fọ RNases lori olubasọrọ.Eyi le ṣe iranlọwọ lati yago fun awọn abajade eke-odi lati ibajẹ enzyme ti RNA.Lẹhin imukuro ati ṣaaju ki o to mura mastermix, awọn ibọwọ yẹ ki o yipada lẹẹkan si, lẹhinna minisita ti ṣetan lati lo.

Pre-PCR: Nucleic acid ayokuro/awopọ awoṣe:

Nucleic acid gbọdọ wa ni fa jade ati ki o mu ni agbegbe ti a yan ni keji, ni lilo ipinya ti awọn pipettes, awọn imọran asẹ, awọn agbeko tube, awọn ibọwọ tuntun, awọn aṣọ laabu ati awọn ohun elo miiran.Agbegbe yii tun jẹ fun afikun awoṣe, awọn iṣakoso ati awọn aṣa aṣa si mastermix Falopiani tabi farahan.Lati yago fun idoti ti awọn ayẹwo acid nucleic ti a fa jade ti a ṣe atupale, o gba ọ niyanju lati yi awọn ibọwọ pada ṣaaju mimu awọn iṣakoso to dara tabi awọn iṣedede mu ati lati lo eto pipette lọtọ.Awọn atunṣe PCR ati awọn ọja imudara ko gbọdọ jẹ paipu ni agbegbe yii.Awọn ayẹwo yẹ ki o wa ni ipamọ ni awọn firiji ti a yan tabi awọn firisa ni agbegbe kanna.Aaye ibi iṣẹ ayẹwo yẹ ki o di mimọ ni ọna kanna bi aaye mastermix.

Post-PCR: Imudara ati mimu ọja imudara

Aaye ti a yan yii jẹ fun awọn ilana imudara lẹhin ati pe o yẹ ki o jẹ lọtọ ti ara lati awọn agbegbe iṣaaju-PCR.Nigbagbogbo o ni awọn thermocyclers ati awọn iru ẹrọ akoko gidi, ati pe o yẹ ki o ni minisita ṣiṣan laminar fun fifi ọja PCR yika 1 si iṣesi 2 yika, ti o ba jẹ pe PCR ti o ni itẹ-ẹiyẹ n ṣe.Awọn reagents PCR ati acid nucleic ti a fa jade ko gbọdọ ni ọwọ ni agbegbe yii nitori eewu ti ibajẹ ga.Agbegbe yii yẹ ki o ni awọn ibọwọ lọtọ, awọn aṣọ laabu, awo ati awọn agbeko tube, awọn pipettes, awọn imọran àlẹmọ, awọn apoti ati awọn ohun elo miiran.Awọn tubes gbọdọ jẹ centrifuged ṣaaju ṣiṣi.Aaye ibi iṣẹ ayẹwo yẹ ki o di mimọ ni ọna kanna bi aaye mastermix.

Post-PCR: Ayẹwo ọja

Yara yii wa fun ohun elo wiwa ọja, fun apẹẹrẹ awọn tanki electrophoresis gel, awọn idii agbara, transilluminator UV ati eto iwe iwe gel.Agbegbe yii yẹ ki o ni awọn ibọwọ lọtọ, awọn aṣọ laabu, awo ati awọn agbeko tube, awọn pipettes, awọn imọran àlẹmọ, awọn apoti ati awọn ohun elo miiran.Ko si awọn reagents miiran ti a le mu wa si agbegbe yii, laisi awọ ikojọpọ, ami ami molikula ati gel agarose, ati awọn paati ifipamọ.Aaye iṣẹ ayẹwo yẹ ki o di mimọ ni ọna kanna bi aaye mastermix.

Akọsilẹ pataki

Bi o ṣe yẹ, awọn yara iṣaaju PCR ko yẹ ki o wọ ni ọjọ kanna ti iṣẹ ba ti ṣe tẹlẹ ni awọn yara lẹhin PCR.Ti eyi ko ba le yago fun patapata, rii daju pe a kọkọ fọ ọwọ daradara ati pe awọn ẹwu laabu kan pato ti wọ ninu awọn yara naa.Awọn iwe laabu ati awọn iwe kikọ ko gbọdọ mu sinu awọn yara iṣaaju PCR ti wọn ba ti lo ninu awọn yara lẹhin PCR;ti o ba wulo, ya àdáwòkọ sita-jade ti Ilana / ayẹwo ID, ati be be lo.

4. Imọran isedale molikula gbogbogbo

Lo awọn ibọwọ ti ko ni lulú lati yago fun idinamọ assay.Ilana pipetting ti o tọ jẹ pataki julọ si idinku ibajẹ.Pipetting ti ko tọ le ja si splashing nigbati o ba n pese awọn olomi ati ṣiṣẹda awọn aerosols.Iwa ti o dara fun pipetting ti o tọ ni a le rii ni awọn ọna asopọ wọnyi: Itọsọna Gilson si pipetting, Awọn fidio ilana pipetting Anachem, Awọn tubes Centrifuge ṣaaju ṣiṣi, ati ṣii wọn ni pẹkipẹki lati yago fun splashing.Pa awọn tubes lẹsẹkẹsẹ lẹhin lilo lati yago fun ifihan awọn contaminants.

Nigbati o ba n ṣe awọn aati lọpọlọpọ, mura mastermix kan ti o ni awọn reagents ti o wọpọ (fun apẹẹrẹ omi, dNTPs, saarin, awọn alakoko ati henensiamu) lati dinku nọmba awọn gbigbe reagent ati dinku irokeke idoti.A ṣe iṣeduro lati ṣeto mastermix lori yinyin tabi bulọọki tutu.Lilo enzymu Ibẹrẹ Gbona le ṣe iranlọwọ lati dinku iṣelọpọ awọn ọja ti kii ṣe pato.Dabobo awọn reagents ti o ni awọn iwadii fluorescent ninu ina lati yago fun ibajẹ.

5. Awọn iṣakoso inu

Ṣafikun iwa-daradara, awọn idari rere ati odi ti a fọwọsi, pẹlu iṣakoso awoṣe-awọ ni gbogbo awọn aati, ati aṣa aṣa-ojuami titrated fun awọn aati iwọn.Iṣakoso rere ko yẹ ki o lagbara tobẹẹ ti o jẹ eewu ibajẹ.Ṣafikun rere ati awọn iṣakoso isediwon odi nigba ṣiṣe isediwon acid nucleic.

O ti wa ni niyanju wipe ko o ilana wa ni Pipa ni kọọkan ninu awọn agbegbe ki awọn olumulo mọ ti awọn ofin ti iwa.Awọn ile-iṣẹ iwadii aisan ti n ṣe awari awọn ipele kekere ti DNA tabi RNA ni awọn ayẹwo ile-iwosan le fẹ lati gba iwọn aabo afikun ti nini awọn eto mimu afẹfẹ lọtọ pẹlu titẹ afẹfẹ ti o ni idaniloju diẹ ninu awọn yara iṣaaju-PCR ati titẹ afẹfẹ odi die ni awọn yara post-PCR.

Nikẹhin, idagbasoke eto idaniloju didara (QA) jẹ iranlọwọ.Iru ero yii yẹ ki o pẹlu awọn atokọ ti awọn akojopo titunto si reagent ati awọn akojopo ṣiṣẹ, awọn ofin fun titoju awọn ohun elo ati awọn reagents, ijabọ awọn abajade iṣakoso, awọn eto ikẹkọ oṣiṣẹ, awọn algoridimu laasigbotitusita, ati awọn iṣe atunṣe nigbati o nilo.

6. Iwe itan

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Chapter 3: Eto soke a qPCR yàrá.A iwe itoni fun igbeyewo ìdárayá omi lilo USEPA qPCR ọna 1611. Lansing- Michigan State University.

Ilera ti gbogbo eniyan England, NHS.Awọn iṣedede UK fun awọn iwadii microbiology: Iwa adaṣe ti o dara nigbati o n ṣe awọn igbelewọn imudara molikula).Itọsọna Didara.Ọdun 2013;4 (4):1–15.

Miffin T. Eto soke a PCR yàrá.Cold Spring Harb Protoc.Ọdun 2007;7.

Schroeder S 2013. Itọju deede ti awọn centrifuges: mimọ, itọju ati disinfection ti awọn centrifuges, awọn rotors ati awọn oluyipada (iwe funfun No. 14).Hamburg: Eppendorf;Ọdun 2013.

Nipasẹ RV, Wallis CL.Ti o dara Clinical Laboratory Practice (GCLP) fun awọn idanwo orisun molikula ti a lo ninu awọn ile-iṣẹ iwadii aisan, Ni: Akyar I, olootu.Wide sipekitira ti didara iṣakoso.Rijeka, Croatia: Imọ-ẹrọ;Ọdun 2011: 29–52.