Các phương pháp phát hiện phân tử có khả năng tạo ra một lượng lớn axit nucleic thông qua việc khuếch đại các lượng vết được tìm thấy trong các mẫu.Mặc dù điều này có lợi cho việc cho phép phát hiện nhạy cảm, nhưng nó cũng tạo ra khả năng nhiễm bẩn thông qua việc phát tán các sol khí khuếch đại trong môi trường phòng thí nghiệm.Khi tiến hành thí nghiệm, có thể thực hiện các biện pháp để tránh nhiễm bẩn thuốc thử, thiết bị phòng thí nghiệm và không gian băng ghế, vì sự nhiễm bẩn đó có thể tạo ra kết quả dương tính giả (hoặc âm tính giả).

Để giúp giảm khả năng nhiễm bẩn, Thực hành Phòng thí nghiệm Tốt nên được thực hiện mọi lúc.Cụ thể, các biện pháp phòng ngừa cần được thực hiện đối với các điểm sau:

1. Xử lý thuốc thử
2. Tổ chức không gian làm việc và trang thiết bị
3. Lời khuyên sử dụng và làm sạch cho không gian phân tử được chỉ định
4. Tư vấn chung về sinh học phân tử
5. Kiểm soát nội bộ
6. Thư mục

1. Xử lý thuốc thử

Ly tâm nhanh các ống thuốc thử trước khi mở để tránh tạo ra sol khí.Chia nhỏ thuốc thử để tránh đông-rã đông nhiều lần và nhiễm bẩn nguyên liệu gốc.Ghi nhãn rõ ràng và ghi ngày tháng cho tất cả các ống thuốc thử và ống phản ứng, đồng thời lưu giữ nhật ký lô thuốc thử và số lô được sử dụng trong tất cả các thí nghiệm.Dùng pipet hút tất cả thuốc thử và mẫu bằng đầu lọc.Trước khi mua, nên xác nhận với nhà sản xuất rằng đầu lọc phù hợp với nhãn hiệu pipet sẽ sử dụng.

2. Tổ chức không gian làm việc và trang thiết bị

Không gian làm việc nên được tổ chức để đảm bảo rằng luồng công việc diễn ra theo một hướng, từ khu vực sạch (trước PCR) đến khu vực bẩn (hậu PCR).Các biện pháp phòng ngừa chung sau đây sẽ giúp giảm nguy cơ nhiễm bẩn.Có các phòng được chỉ định riêng biệt, hoặc ít nhất là các khu vực riêng biệt về mặt vật lý, dành cho: chuẩn bị hỗn hợp chính, chiết xuất axit nucleic và bổ sung mẫu DNA, khuếch đại và xử lý sản phẩm khuếch đại, và phân tích sản phẩm, ví dụ như điện di trên gel.

Trong một số cài đặt, có 4 phòng riêng biệt là khó khăn.Một lựa chọn khả thi nhưng ít được mong đợi hơn là tiến hành chuẩn bị mastermix trong khu vực ngăn chặn, ví dụ tủ chảy tầng.Trong trường hợp khuếch đại PCR lồng nhau, việc chuẩn bị hỗn hợp chính cho phản ứng vòng thứ hai phải được chuẩn bị trong khu vực 'sạch' để chuẩn bị hỗn hợp chính, nhưng việc cấy sản phẩm PCR chính nên được thực hiện trong phòng khuếch đại, và nếu có thể trong một khu vực ngăn chặn chuyên dụng (ví dụ tủ chảy tầng).

Mỗi phòng/khu vực cần có một bộ pipet, đầu lọc, đầu lọc, giá đỡ ống, máy xoáy, máy ly tâm (nếu có) được dán nhãn rõ ràng, bút, thuốc thử chung của phòng thí nghiệm, áo khoác phòng thí nghiệm và hộp găng tay.Phải rửa tay, thay găng tay và áo khoác phòng thí nghiệm khi di chuyển giữa các khu vực được chỉ định.Thuốc thử và thiết bị không được di chuyển từ khu vực bẩn sang khu vực sạch.Nếu một trường hợp nghiêm trọng phát sinh khi thuốc thử hoặc thiết bị cần phải di chuyển về phía sau, trước tiên nó phải được khử nhiễm bằng natri hypochlorite 10%, sau đó lau sạch bằng nước vô trùng.

Ghi chú

Dung dịch natri hypoclorit 10% phải được pha mới hàng ngày.Khi được sử dụng để khử nhiễm, nên tuân thủ thời gian tiếp xúc tối thiểu là 10 phút.
Ngoài ra, có thể sử dụng các sản phẩm bán sẵn trên thị trường được xác nhận là chất khử nhiễm bề mặt phá hủy DNA nếu các khuyến nghị về an toàn tại địa phương không cho phép sử dụng natri hypochlorite hoặc nếu natri hypochlorite không phù hợp để khử nhiễm các bộ phận kim loại của thiết bị.

Lý tưởng nhất là nhân viên nên tuân thủ quy trình làm việc một chiều và không đi từ khu vực bẩn (hậu PCR) trở lại khu vực sạch (trước PCR) trong cùng một ngày.Tuy nhiên, có thể có những dịp khi điều này là không thể tránh khỏi.Khi có trường hợp như vậy, nhân viên phải cẩn thận rửa tay kỹ lưỡng, thay găng tay, sử dụng áo khoác phòng thí nghiệm được chỉ định và không mang bất kỳ thiết bị nào mà họ muốn mang ra khỏi phòng một lần nữa, chẳng hạn như sách thí nghiệm.Các biện pháp kiểm soát như vậy nên được nhấn mạnh trong đào tạo nhân viên về các phương pháp phân tử.

Sau khi sử dụng, không gian băng ghế dự bị phải được làm sạch bằng natri hypochlorite 10% (tiếp theo là nước vô trùng để loại bỏ chất tẩy trắng còn sót lại), ethanol 70% hoặc chất khử nhiễm phá hủy DNA có bán trên thị trường đã được kiểm chứng.Lý tưởng nhất là nên lắp đèn cực tím (UV) để có thể khử nhiễm bằng chiếu xạ.Tuy nhiên, nên hạn chế sử dụng đèn UV ở những khu vực làm việc kín, ví dụ như tủ an toàn, để hạn chế sự tiếp xúc với tia cực tím của nhân viên phòng thí nghiệm.Vui lòng tuân thủ các hướng dẫn của nhà sản xuất về cách chăm sóc, thông gió và vệ sinh đèn UV để đảm bảo rằng đèn vẫn hoạt động hiệu quả.

Nếu sử dụng etanol 70% thay vì natri hypoclorit, thì cần phải chiếu tia UV để hoàn tất quá trình khử nhiễm.
Không làm sạch máy xoáy và máy ly tâm bằng natri hypochlorite;thay vào đó, hãy lau sạch bằng cồn 70% và phơi dưới ánh sáng tia cực tím hoặc sử dụng chất khử nhiễm phá hủy DNA thương mại.Đối với sự cố tràn, hãy kiểm tra với nhà sản xuất để được tư vấn làm sạch thêm.Nếu hướng dẫn của nhà sản xuất cho phép, pipet phải được khử trùng thường xuyên bằng nồi hấp.Nếu không thể hấp khử trùng pipet, thì chỉ cần làm sạch chúng bằng natri hypochlorite 10% (sau đó lau kỹ bằng nước vô trùng) hoặc bằng chất khử nhiễm phá hủy DNA thương mại, sau đó tiếp xúc với tia cực tím.

Làm sạch bằng natri hypochlorite tỷ lệ cao cuối cùng có thể làm hỏng nhựa và kim loại của pipet nếu được thực hiện thường xuyên;kiểm tra các khuyến nghị từ nhà sản xuất đầu tiên.Tất cả các thiết bị cần được hiệu chuẩn thường xuyên theo lịch trình do nhà sản xuất khuyến nghị.Một người được chỉ định phải chịu trách nhiệm đảm bảo rằng lịch trình hiệu chuẩn được tuân thủ, nhật ký chi tiết được duy trì và nhãn dịch vụ được hiển thị rõ ràng trên thiết bị.

3. Lời khuyên sử dụng và làm sạch cho không gian phân tử được chỉ định

Tiền PCR: Chuẩn bị chiết tách thuốc thử/chuẩn bị hỗn hợp chính: Đây phải là không gian sạch nhất trong tất cả các không gian được sử dụng để chuẩn bị các thí nghiệm phân tử và lý tưởng nhất phải là một tủ chảy tầng được chỉ định được trang bị đèn UV.Các mẫu, axit nucleic chiết xuất và các sản phẩm PCR khuếch đại không được xử lý trong khu vực này.Thuốc thử khuếch đại nên được giữ trong tủ đông (hoặc tủ lạnh, theo khuyến nghị của nhà sản xuất) trong cùng một không gian được chỉ định, lý tưởng là bên cạnh tủ cấy laminar hoặc khu vực tiền PCR.Nên thay găng tay mỗi lần khi vào khu vực tiền PCR hoặc tủ cấy laminar flow.

Khu vực tiền PCR hoặc tủ cấy dòng chảy tầng phải được làm sạch trước và sau khi sử dụng như sau: Lau sạch tất cả các vật dụng trong tủ, ví dụ: pipet, hộp tip, vortex, máy ly tâm, giá đỡ ống, bút, v.v. bằng cồn 70% hoặc chất khử nhiễm DNA thương mại và để khô.Trong trường hợp khu vực làm việc kín, ví dụ như tủ cấy dòng chảy tầng, hãy để tủ hút dưới ánh sáng tia cực tím trong 30 phút.

Ghi chú

Không để thuốc thử tiếp xúc với tia UV;chỉ di chuyển chúng vào tủ sau khi nó sạch sẽ.Nếu thực hiện PCR phiên mã ngược, cũng có thể hữu ích nếu lau sạch các bề mặt và thiết bị bằng dung dịch phân hủy RNase khi tiếp xúc.Điều này có thể giúp tránh kết quả âm tính giả do sự phân hủy RNA của enzyme.Sau khi khử nhiễm và trước khi chuẩn bị hỗn hợp chính, nên thay găng tay một lần nữa, sau đó tủ đã sẵn sàng để sử dụng.

Trước PCR: Chiết xuất axit nucleic/thêm mẫu:

Axit nucleic phải được chiết xuất và xử lý trong khu vực được chỉ định thứ hai, sử dụng một bộ pipet, đầu lọc, giá đỡ ống, găng tay mới, áo khoác phòng thí nghiệm và các thiết bị khác. Khu vực này cũng dành cho việc bổ sung mẫu, điều khiển và đường xu hướng vào ống hoặc đĩa mastermix.Để tránh làm nhiễm bẩn các mẫu axit nucleic chiết xuất đang được phân tích, nên thay găng tay trước khi xử lý các chất chuẩn hoặc mẫu chứng dương tính và sử dụng một bộ pipet riêng.Thuốc thử PCR và các sản phẩm khuếch đại không được dùng pipet trong khu vực này.Các mẫu nên được bảo quản trong tủ lạnh hoặc tủ đông được chỉ định trong cùng một khu vực.Không gian làm việc mẫu phải được làm sạch giống như không gian mastermix.

Post-PCR: Khuếch đại và xử lý sản phẩm được khuếch đại

Không gian được chỉ định này dành cho các quy trình sau khuếch đại và phải tách biệt về mặt vật lý với các khu vực trước PCR.Nó thường chứa các bộ điều nhiệt và bệ thời gian thực, và lý tưởng nhất là phải có một tủ dòng chảy tầng để thêm sản phẩm PCR vòng 1 vào phản ứng vòng 2, nếu PCR lồng nhau đang được thực hiện.Thuốc thử PCR và axit nucleic chiết xuất không được xử lý trong khu vực này vì nguy cơ nhiễm bẩn cao.Khu vực này nên có một bộ găng tay, áo khoác phòng thí nghiệm, giá đỡ đĩa và ống, pipet, đầu lọc, thùng và các thiết bị khác riêng biệt.Các ống phải được ly tâm trước khi mở.Không gian làm việc mẫu phải được làm sạch giống như không gian mastermix.

Post-PCR: Phân tích sản phẩm

Phòng này dành cho thiết bị phát hiện sản phẩm, ví dụ như bể điện di gel, bộ nguồn, thiết bị chiếu sáng UV và hệ thống tài liệu gel.Khu vực này nên có các bộ găng tay, áo khoác phòng thí nghiệm, giá đỡ đĩa và ống, pipet, đầu lọc, thùng và các thiết bị khác riêng biệt.Không được mang thuốc thử nào khác vào khu vực này, ngoại trừ thuốc nhuộm tải, chất đánh dấu phân tử và gel agarose, và các thành phần đệm.Không gian làm việc mẫu phải được làm sạch giống như không gian mastermix.

Lưu ý quan trọng

Lý tưởng nhất là không nên vào phòng tiền PCR trong cùng một ngày nếu công việc đã được thực hiện trong phòng hậu PCR.Nếu điều này là hoàn toàn không thể tránh khỏi, hãy đảm bảo rằng tay trước tiên được rửa kỹ và mặc áo khoác phòng thí nghiệm cụ thể trong phòng.Sổ thí nghiệm và giấy tờ không được mang vào phòng tiền PCR nếu chúng đã được sử dụng trong phòng hậu PCR;nếu cần, hãy in các bản in trùng lặp của các giao thức/ID mẫu, v.v.

4. Tư vấn chung về sinh học phân tử

Sử dụng găng tay không có bột để tránh ức chế xét nghiệm.Kỹ thuật pipet đúng là tối quan trọng để giảm nhiễm bẩn.Việc sử dụng pipet không đúng cách có thể dẫn đến hiện tượng bắn tung tóe khi phân phối chất lỏng và tạo ra sol khí.Bạn có thể tìm thấy cách thực hành tốt để hút pipet đúng cách tại các liên kết sau: Hướng dẫn sử dụng pipet của Gilson, Video kỹ thuật pipet Anachem, Ống ly tâm trước khi mở và mở chúng cẩn thận để tránh bắn tung tóe.Đóng ống ngay sau khi sử dụng để tránh đưa chất gây ô nhiễm vào.

Khi thực hiện nhiều phản ứng, hãy chuẩn bị một hỗn hợp chính chứa các thuốc thử thông thường (ví dụ: nước, dNTP, dung dịch đệm, mồi và enzyme) để giảm thiểu số lần chuyển thuốc thử và giảm nguy cơ nhiễm bẩn.Nên thiết lập mastermix trên đá hoặc khối lạnh.Sử dụng enzyme Hot Start có thể giúp giảm sản xuất các sản phẩm không đặc hiệu.Bảo vệ thuốc thử có chứa đầu dò huỳnh quang khỏi ánh sáng để tránh giảm chất lượng.

5. Kiểm soát nội bộ

Bao gồm các biện pháp kiểm soát dương tính và tiêu cực được xác nhận rõ ràng, cùng với kiểm soát không có mẫu trong tất cả các phản ứng và đường xu hướng chuẩn độ đa điểm cho các phản ứng định lượng.Kiểm soát tích cực không nên mạnh đến mức gây ra nguy cơ nhiễm bẩn.Bao gồm các biện pháp kiểm soát chiết tích cực và tiêu cực khi thực hiện chiết xuất axit nucleic.

Chúng tôi khuyến nghị rằng các hướng dẫn rõ ràng được đăng trong từng khu vực để người dùng nhận thức được các quy tắc ứng xử.Các phòng thí nghiệm chẩn đoán phát hiện hàm lượng DNA hoặc RNA rất thấp trong các mẫu lâm sàng có thể muốn áp dụng biện pháp an ninh bổ sung là có các hệ thống xử lý không khí riêng biệt với áp suất không khí hơi dương trong phòng tiền PCR và áp suất không khí hơi âm trong phòng hậu PCR.

Cuối cùng, việc phát triển một kế hoạch đảm bảo chất lượng (QA) là hữu ích.Một kế hoạch như vậy phải bao gồm danh sách kho thuốc thử chính và kho dự trữ đang hoạt động, quy tắc lưu trữ bộ dụng cụ và thuốc thử, báo cáo kết quả kiểm soát, chương trình đào tạo nhân viên, thuật toán xử lý sự cố và các hành động khắc phục khi cần.

6. Thư mục

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Chương 3: Thiết lập phòng thí nghiệm qPCR.Tài liệu hướng dẫn kiểm tra nước giải trí bằng phương pháp USEPA qPCR 1611. Đại học Bang Lansing- Michigan.

Y tế công cộng Anh, NHS.Các tiêu chuẩn của Vương quốc Anh về điều tra vi sinh: Thực hành Phòng thí nghiệm Tốt khi thực hiện các xét nghiệm khuếch đại phân tử).Hướng dẫn chất lượng.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Thiết lập phòng thí nghiệm PCR.Giao thức Harb mùa xuân lạnh.2007;7.

Schroeder S 2013. Bảo dưỡng định kỳ máy ly tâm: vệ sinh, bảo dưỡng và khử trùng máy ly tâm, rôto và bộ điều hợp (Sách trắng số 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Thực hành phòng thí nghiệm lâm sàng tốt (GCLP) cho các xét nghiệm dựa trên phân tử được sử dụng trong phòng thí nghiệm chẩn đoán, Trong: Akyar I, người biên tập.Phổ rộng của kiểm soát chất lượng.Rijeka, Croatia: Intech;2011: 29–52.