Molekulyar aniqlash usullari namunalarda topilgan iz miqdorini kuchaytirish orqali katta hajmdagi nuklein kislota ishlab chiqarish qobiliyatiga ega.Bu nozik aniqlashni ta'minlash uchun foydali bo'lsa-da, laboratoriya muhitida kuchaytiruvchi aerozollarning tarqalishi orqali ifloslanish ehtimolini ham keltirib chiqaradi.Tajribalarni o'tkazishda reagentlar, laboratoriya jihozlari va dastgoh maydoni ifloslanishiga yo'l qo'ymaslik choralarini ko'rish mumkin, chunki bunday ifloslanish noto'g'ri-musbat (yoki noto'g'ri-salbiy) natijalarga olib kelishi mumkin.

Kontaminatsiya ehtimolini kamaytirishga yordam berish uchun har doim yaxshi laboratoriya amaliyotini qo'llash kerak.Xususan, quyidagi holatlarga nisbatan ehtiyot choralarini ko'rish kerak:

1. Reaktivlar bilan ishlash
2. Ish joyini va jihozlarni tashkil qilish
3. Belgilangan molekulyar bo'shliq uchun foydalanish va tozalash bo'yicha maslahat
4. Umumiy molekulyar biologiya maslahati
5. Ichki nazorat
6. Bibliografiya

1. Reaktivlar bilan ishlash

Aerozollar paydo bo'lishiga yo'l qo'ymaslik uchun reaktiv naychalarini ochishdan oldin qisqa vaqt davomida santrifüj qiling.Ko'p muzlatish-eritish va asosiy zahiralarning ifloslanishini oldini olish uchun reagentlar alikotlari.Barcha reagent va reaksiya trubkalarini aniq belgilang va sanasini yozing hamda barcha tajribalarda ishlatiladigan reagent partiyasi va partiya raqamlari jurnallarini saqlang.Filtr uchlari yordamida barcha reagentlar va namunalarni pipetka bilan torting.Sotib olishdan oldin, ishlab chiqaruvchi bilan filtr uchlari ishlatiladigan pipetka markasiga mos kelishini tasdiqlash tavsiya etiladi.

2. Ish joyini va jihozlarni tashkil qilish

Ish joyini tashkil qilish kerakki, ish oqimi bir yo'nalishda, toza joylardan (pre-PCR) iflos joylarga (PCRdan keyingi) sodir bo'lishini ta'minlash kerak.Quyidagi umumiy ehtiyot choralari kontaminatsiya ehtimolini kamaytirishga yordam beradi.Alohida ajratilgan xonalarga yoki hech bo'lmaganda jismoniy jihatdan alohida joylarga ega bo'ling: mastermiks tayyorlash, nuklein kislota ekstraktsiyasi va DNK shablonini qo'shish, kuchaytirilgan mahsulotni kuchaytirish va qayta ishlash va mahsulotni tahlil qilish, masalan, gel elektroforezi.

Ba'zi sharoitlarda 4 ta alohida xonaga ega bo'lish qiyin.Mumkin bo'lgan, ammo kamroq ma'qul bo'lgan variant - laminar oqim shkafi kabi, asosiy aralashmani saqlash joyida tayyorlash.Ichki PCR kuchaytirilishida, ikkinchi tur reaktsiyasi uchun mastermiksni tayyorlash mastermiksni tayyorlash uchun "toza" maydonda tayyorlanishi kerak, lekin birlamchi PCR mahsuloti bilan emlash kuchaytiruvchi xonada va iloji bo'lsa, amalga oshirilishi kerak. maxsus saqlash joyida (masalan, laminar oqim shkafi).

Har bir xonaga/hududga aniq yorliqli pipetkalar, filtr uchlari, trubkalar, vortekslar, sentrifugalar (agar kerak bo'lsa), ruchkalar, umumiy laboratoriya reagentlari, laboratoriya xalatlari va qo'lqop qutilari kerak bo'ladi, ular tegishli ish stantsiyalarida qoladi.Belgilangan joylar o'rtasida harakatlanayotganda qo'llarni yuvish va qo'lqop va laboratoriya xalatlarini almashtirish kerak.Reaktivlar va jihozlar iflos joydan toza joyga ko'chirilmasligi kerak.Agar reaktiv yoki uskunani orqaga siljitish kerak bo'lgan ekstremal holat yuzaga kelsa, avval uni 10% natriy gipoxlorit bilan zararsizlantirish, so'ngra steril suv bilan artib olish kerak.

Eslatma

10% natriy gipoxlorit eritmasi har kuni yangi bo'lishi kerak.Zararsizlantirish uchun foydalanilganda, kamida 10 minutlik aloqa vaqtiga rioya qilish kerak.
Shu bilan bir qatorda, agar mahalliy xavfsizlik bo'yicha tavsiyalar natriy gipoxloritdan foydalanishga ruxsat bermasa yoki natriy gipoxlorit uskunaning metall qismlarini zararsizlantirish uchun mos bo'lmasa, DNKni yo'q qiluvchi sirt dekontaminantlari sifatida tasdiqlangan, tijoratda mavjud bo'lgan mahsulotlardan foydalanish mumkin.

Ideal holda, xodimlar bir yo'nalishli ish oqimining axloqiga rioya qilishlari va shu kuni iflos joylardan (PCRdan keyingi) toza joylarga (PCRdan oldingi) qaytmasliklari kerak.Biroq, buning oldini olish mumkin bo'lmagan holatlar bo'lishi mumkin.Bunday vaziyat yuzaga kelganda, xodimlar qo'llarini yaxshilab yuvishlari, qo'lqoplarni almashtirishlari, belgilangan laboratoriya xalatini ishlatishlari va xonadan olib chiqmoqchi bo'lgan asbob-uskunalarni, masalan, laboratoriya kitoblarini olib kirmasliklari kerak.Xodimlarni molekulyar usullar bo'yicha o'qitishda bunday nazorat choralariga alohida e'tibor qaratish lozim.

Ishlatilgandan so'ng, dastgoh bo'shliqlari 10% natriy gipoxlorit (keyin qoldiq oqartirgichni olib tashlash uchun steril suv), 70% etanol yoki tasdiqlangan DNKni yo'q qiluvchi dekontaminant bilan tozalanishi kerak.Ideal holda, nurlanish orqali zararsizlantirishni ta'minlash uchun ultrabinafsha (UV) lampalar o'rnatilishi kerak.Biroq, laboratoriya xodimlarining UV ta'sirini cheklash uchun UV lampalaridan foydalanish yopiq ish joylarida, masalan, xavfsizlik shkaflari bilan cheklanishi kerak.Iltimos, lampalarning samarali ishlashini ta'minlash uchun UV chiroqlarini parvarish qilish, shamollatish va tozalash bo'yicha ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga rioya qiling.

Agar natriy gipoxlorit o'rniga 70% etanol ishlatilsa, zararsizlantirishni yakunlash uchun UV nurlari bilan nurlanish kerak bo'ladi.
Vorteksni tozalamang va natriy gipoxlorit bilan santrifüj qiling;Buning o'rniga 70% etanol bilan artib oling va UV nuriga ta'sir qiling yoki DNKni yo'q qiluvchi tijorat dekontaminantidan foydalaning.To'kilgan bo'lsa, qo'shimcha tozalash bo'yicha maslahat olish uchun ishlab chiqaruvchiga murojaat qiling.Agar ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga ruxsat berilsa, pipetkalar muntazam ravishda avtoklavda sterilizatsiya qilinishi kerak.Agar pipetkalarni avtoklavlash imkoni bo'lmasa, ularni 10% natriy gipoxlorit bilan (keyin steril suv bilan yaxshilab artib oling) yoki DNKni yo'q qiluvchi tijorat dekontaminant bilan, so'ngra UV ta'sirida tozalash kifoya.

Yuqori foizli natriy gipoxlorit bilan tozalash muntazam ravishda amalga oshirilsa, oxir-oqibat pipetka plastmassalari va metallarga zarar etkazishi mumkin;avval ishlab chiqaruvchining tavsiyalarini tekshiring.Barcha jihozlar ishlab chiqaruvchi tomonidan tavsiya etilgan jadvalga muvofiq muntazam ravishda kalibrlanishi kerak.Belgilangan shaxs kalibrlash jadvaliga rioya qilinishini, batafsil jurnallarning yuritilishini va uskunada xizmat ko'rsatish belgilarining aniq ko'rsatilishini ta'minlash uchun mas'ul bo'lishi kerak.

3. Belgilangan molekulyar bo'shliq uchun foydalanish va tozalash bo'yicha maslahat

Pre-PCR: Reagent alikotatsiyasi / mastermiks tayyorlash: Bu molekulyar tajribalarni tayyorlash uchun ishlatiladigan barcha bo'shliqlar ichida eng toza bo'lishi kerak va ideal holda UV nuri bilan jihozlangan maxsus laminar oqim shkafi bo'lishi kerak.Namunalar, ekstraksiya qilingan nuklein kislota va kuchaytirilgan PCR mahsulotlari bu sohada ishlatilmasligi kerak.Kuchaytiruvchi reagentlar muzlatgichda (yoki muzlatgichda, ishlab chiqaruvchi tavsiyalariga ko'ra) bir xil belgilangan joyda, ideal holda laminar oqim shkafi yoki PCR oldi zonasi yonida saqlanishi kerak.Qo'lqoplarni har safar PCRdan oldingi hududga yoki laminar oqim shkafiga kirganingizda o'zgartirish kerak.

Pre-PCR maydoni yoki laminar oqim shkafi foydalanishdan oldin va keyin quyidagi tarzda tozalanishi kerak: Shkafdagi barcha narsalarni, masalan, pipetkalar, uchli qutilar, vorteks, sentrifuga, kolba tokchalari, ruchkalar va hokazolarni 70% etanol yoki tijorat DNKni yo'q qiluvchi dekontaminant va quritishga ruxsat bering.Yopiq ish joyida, masalan, laminar oqim shkafi, kaputni 30 daqiqa davomida UV nuriga ta'sir qiling.

Eslatma

Reagentlarni UV nuriga ta'sir qilmang;faqat toza bo'lgandan keyin ularni kabinetga ko'chiring.Agar teskari transkripsiyali PCR amalga oshirilsa, kontaktda RNazalarni buzadigan eritma bilan yuzalar va jihozlarni artib tashlash ham foydali bo'lishi mumkin.Bu RNK fermenti degradatsiyasidan noto'g'ri-salbiy natijalarni oldini olishga yordam beradi.Zararsizlantirishdan so'ng va mastermiksni tayyorlashdan oldin, qo'lqoplarni yana bir marta almashtirish kerak, shundan so'ng shkaf foydalanishga tayyor.

Pre-PCR: Nuklein kislota ekstraktsiyasi/shablonni qo'shish:

Nuklein kislota alohida pipetkalar, filtr uchlari, trubka tokchalari, yangi qoʻlqoplar, laboratoriya xalatlari va boshqa jihozlardan foydalangan holda ikkinchi belgilangan joyda olinishi va ishlov berilishi kerak. mastermix quvurlari yoki plitalari.Tahlil qilinayotgan ekstraksiyalangan nuklein kislota namunalarining ifloslanishiga yo'l qo'ymaslik uchun ijobiy nazorat yoki standartlar bilan ishlashdan oldin qo'lqoplarni almashtirish va alohida pipetkalar to'plamidan foydalanish tavsiya etiladi.PCR reagentlari va kuchaytirilgan mahsulotlarni bu sohada pipetka bilan o'tkazmaslik kerak.Namunalar bir xil hududdagi maxsus muzlatgichlarda yoki muzlatgichlarda saqlanishi kerak.Namuna ish joyini mastermiks maydoni bilan bir xil tarzda tozalash kerak.

Post-PCR: kuchaytirilgan mahsulotni kuchaytirish va ishlov berish

Bu belgilangan joy post-amplifikasyon jarayonlari uchun mo'ljallangan va PCRdan oldingi maydonlardan jismoniy jihatdan alohida bo'lishi kerak.U odatda termosikllar va real vaqt platformalarini o'z ichiga oladi va ideal holda, ichki PCR amalga oshirilayotgan bo'lsa, 2-raund reaktsiyasiga 1-raund PCR mahsulotini qo'shish uchun laminar oqim shkafi bo'lishi kerak.PCR reagentlari va ekstraksiya qilingan nuklein kislota bilan bu sohada ishlamaslik kerak, chunki ifloslanish xavfi yuqori.Bu maydonda alohida qo'lqoplar, laboratoriya xalatlari, plastinka va naychali tokchalar, pipetkalar, filtr uchlari, qutilar va boshqa jihozlar bo'lishi kerak.Quvurlarni ochishdan oldin santrifüj qilish kerak.Namuna ish joyini mastermiks maydoni bilan bir xil tarzda tozalash kerak.

Post-PCR: Mahsulot tahlili

Bu xona mahsulotni aniqlash uskunalari, masalan, gel elektroforez tanklari, quvvat paketlari, UV transilluminatori va jel hujjatlashtirish tizimi uchun mo'ljallangan.Bu maydonda alohida qo'lqop to'plamlari, laboratoriya xalatlari, plastinka va naychali tokchalar, pipetkalar, filtr uchlari, qutilar va boshqa jihozlar bo'lishi kerak.Bu hududga yuklovchi bo'yoq, molekulyar marker va agaroz jeli va bufer komponentlaridan tashqari boshqa reagentlarni olib bo'lmaydi.Namuna ish joyini mastermiks maydoni bilan bir xil tarzda tozalash kerak.

Muhim eslatma

Ideal holda, agar PCRdan keyingi xonalarda ish allaqachon bajarilgan bo'lsa, o'sha kuni PCRdan oldingi xonalarga kirmaslik kerak.Agar bu butunlay muqarrar bo'lsa, avval qo'llarni yaxshilab yuvib tashlang va xonalarda maxsus laboratoriya xalatlarini kiyishingiz kerak.Laboratoriya daftarlari va hujjatlar, agar ular PCRdan keyingi xonalarda ishlatilgan bo'lsa, PZRdan oldingi xonalarga kiritilmasligi kerak;agar kerak bo'lsa, protokollar/namuna identifikatorlari va hokazolarning ikki nusxasini chop eting.

4. Umumiy molekulyar biologiya maslahati

Tahlilni inhibe qilmaslik uchun kukunsiz qo'lqoplardan foydalaning.To'g'ri pipetlash texnikasi ifloslanishni kamaytirish uchun juda muhimdir.Noto'g'ri pipetlash suyuqliklarni tarqatishda sachrashga va aerozollarning paydo bo'lishiga olib kelishi mumkin.To'g'ri pipetlash bo'yicha yaxshi amaliyotni quyidagi havolalarda topish mumkin: Gilson pipetlash bo'yicha qo'llanma, Anachem pipetting texnikasi videolari, Ochishdan oldin santrifüj naychalarini oching va sachramasligi uchun ularni ehtiyotkorlik bilan oching.Foydalanishdan keyin ifloslantiruvchi moddalarni kiritmaslik uchun quvurlarni darhol yoping.

Bir nechta reaktsiyalarni amalga oshirayotganda, reagentlarni o'tkazish sonini kamaytirish va ifloslanish xavfini kamaytirish uchun umumiy reagentlar (masalan, suv, dNTPlar, bufer, primerlar va fermentlar) bo'lgan bitta mastermiks tayyorlang.Mastermixni muz yoki sovuq blokda o'rnatish tavsiya etiladi.Hot Start fermentidan foydalanish o'ziga xos bo'lmagan mahsulotlar ishlab chiqarishni kamaytirishga yordam beradi.Buzilishning oldini olish uchun lyuminestsent problari bo'lgan reagentlarni yorug'likdan saqlang.

5. Ichki nazorat

Yaxshi tavsiflangan, tasdiqlangan ijobiy va salbiy nazoratni, shuningdek, barcha reaksiyalarda shablonsiz nazoratni va miqdoriy reaksiyalar uchun koʻp nuqtali titrlangan trend chizigʻini qoʻshing.Ijobiy nazorat ifloslanish xavfini tug'diradigan darajada kuchli bo'lmasligi kerak.Nuklein kislota ekstraktsiyasini amalga oshirishda musbat va salbiy ekstraktsiya nazoratini kiriting.

Foydalanuvchilarning xulq-atvor qoidalaridan xabardor bo'lishlari uchun har bir sohada aniq ko'rsatmalar joylashtirilishi tavsiya etiladi.Klinik namunalarda DNK yoki RNKning juda past darajasini aniqlaydigan diagnostika laboratoriyalari PCRdan oldingi xonalarda bir oz musbat havo bosimi va PCRdan keyingi xonalarda bir oz manfiy havo bosimi bilan alohida havoni boshqarish tizimlariga ega bo'lish kabi qo'shimcha xavfsizlik choralarini qo'llashni xohlashlari mumkin.

Nihoyat, sifat kafolati (QA) rejasini ishlab chiqish foydalidir.Bunday reja reaktivlar asosiy zahiralari va ishchi zahiralari ro'yxatini, to'plamlar va reagentlarni saqlash qoidalarini, nazorat natijalari to'g'risida hisobot berishni, xodimlarni o'qitish dasturlarini, nosozliklarni bartaraf etish algoritmlarini va kerak bo'lganda ularni bartaraf etish choralarini o'z ichiga olishi kerak.

6. Bibliografiya

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. 3-bob: qPCR laboratoriyasini o'rnatish.USEPA qPCR usuli yordamida rekreatsion suvlarni sinovdan o'tkazish uchun qo'llanma 1611. Lansing-Michigan State University.

Jamoat salomatligi Angliya, NHS.Mikrobiologiya tadqiqotlari uchun Buyuk Britaniya standartlari: molekulyar kuchaytirish tahlillarini o'tkazishda yaxshi laboratoriya amaliyoti).Sifat yo'riqnomasi.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. PCR laboratoriyasini o'rnatish.Sovuq bahor Harb protokoli.2007;7.

Schroeder S 2013. Santrifugalarni muntazam parvarishlash: santrifugalarni, rotorlarni va adapterlarni tozalash, texnik xizmat ko'rsatish va dezinfeksiya qilish (Oq qog'oz № 14).Gamburg: Eppendorf;2013 yil.

Viana RV, Uollis CL.Diagnostika laboratoriyalarida qo'llaniladigan molekulyar asoslangan testlar uchun yaxshi klinik laboratoriya amaliyoti (GCLP), In: Akyar I, muharrir.Sifat nazoratining keng spektri.Riyeka, Xorvatiya: Intech;2011: 29–52.