سالماتی پتہ لگانے کے طریقوں میں نمونوں میں پائے جانے والے ٹریس کی مقدار کو بڑھانے کے ذریعے نیوکلک ایسڈ کی ایک بڑی مقدار پیدا کرنے کی صلاحیت ہوتی ہے۔اگرچہ یہ حساس پتہ لگانے کے لیے فائدہ مند ہے، لیکن یہ لیبارٹری کے ماحول میں ایمپلیفیکیشن ایروسول کے پھیلاؤ کے ذریعے آلودگی کے امکان کو بھی متعارف کراتا ہے۔تجربات کرتے وقت، ری ایجنٹس، لیبارٹری کے آلات اور بینچ کی جگہ کی آلودگی سے بچنے کے لیے اقدامات کیے جا سکتے ہیں، کیونکہ اس طرح کی آلودگی غلط مثبت (یا غلط-منفی) نتائج پیدا کر سکتی ہے۔

آلودگی کے امکانات کو کم کرنے میں مدد کے لیے، اچھی لیبارٹری پریکٹس کو ہر وقت استعمال کیا جانا چاہیے۔خاص طور پر درج ذیل نکات کے حوالے سے احتیاطی تدابیر اختیار کی جانی چاہئیں۔

1. ہینڈلنگ ری ایجنٹس
2. کام کی جگہ اور سامان کی تنظیم
3. مخصوص سالماتی جگہ کے لیے استعمال اور صفائی کا مشورہ
4. عمومی سالماتی حیاتیات کا مشورہ
5. اندرونی کنٹرولز
6. کتابیات

1. ہینڈلنگ ری ایجنٹس

ایروسول کی نسل سے بچنے کے لیے کھولنے سے پہلے مختصراً سینٹری فیوج ریجنٹ ٹیوبیں لگائیں۔متعدد منجمد پگھلنے اور ماسٹر اسٹاک کی آلودگی سے بچنے کے لیے ایلی کوٹ ری ایجنٹس۔واضح طور پر تمام ری ایجنٹ اور ری ایکشن ٹیوبوں کو لیبل اور ڈیٹ کریں اور تمام تجربات میں استعمال ہونے والے ریجنٹ لاٹ اور بیچ نمبرز کے لاگز کو برقرار رکھیں۔فلٹر ٹپس کا استعمال کرتے ہوئے تمام ری ایجنٹس اور نمونوں کو پائپیٹ کریں۔خریداری سے پہلے، مینوفیکچرر کے ساتھ اس بات کی تصدیق کرنے کا مشورہ دیا جاتا ہے کہ فلٹر ٹپس استعمال کیے جانے والے پپیٹ کے برانڈ کے مطابق ہیں۔

2. کام کی جگہ اور سامان کی تنظیم

کام کی جگہ کو اس بات کو یقینی بنانے کے لیے منظم کیا جانا چاہیے کہ کام کا بہاؤ ایک سمت میں ہو، صاف علاقوں (پری پی سی آر) سے گندے علاقوں (پی سی آر کے بعد) تک۔مندرجہ ذیل عمومی احتیاطیں آلودگی کے امکانات کو کم کرنے میں مدد کریں گی۔الگ الگ نامزد کمرے، یا کم از کم جسمانی طور پر الگ الگ علاقے، کے لیے: ماسٹر مکس کی تیاری، نیوکلک ایسڈ نکالنے اور ڈی این اے ٹیمپلیٹ کا اضافہ، ایمپلیفائیڈ پروڈکٹ کی پرورش اور ہینڈلنگ، اور مصنوعات کا تجزیہ، جیسے جیل الیکٹروفورسس۔

کچھ ترتیبات میں، 4 علیحدہ کمرے رکھنا مشکل ہے۔ایک ممکنہ لیکن کم مطلوبہ آپشن یہ ہے کہ کنٹینمنٹ ایریا میں ماسٹر مکس کی تیاری کی جائے، مثلاً لیمینر فلو کیبنٹ۔نیسٹڈ پی سی آر ایمپلیفیکیشن کی صورت میں، دوسرے راؤنڈ ری ایکشن کے لیے ماسٹر مکس کی تیاری ماسٹر مکس کی تیاری کے لیے 'کلین' ایریا میں کی جانی چاہیے، لیکن پرائمری پی سی آر پروڈکٹ کے ساتھ ٹیکہ ایمپلیفیکیشن روم میں کیا جانا چاہیے، اور اگر ممکن ہو تو۔ ایک وقف کنٹینمنٹ ایریا میں (مثلاً لیمینر فلو کیبنٹ)۔

ہر کمرے/علاقے کو واضح طور پر لیبل لگے ہوئے پائپٹس، فلٹر ٹپس، ٹیوب ریک، ورٹیکسز، سینٹری فیوجز (اگر متعلقہ ہوں)، قلم، عام لیب ریجنٹس، لیب کوٹ اور دستانے کے ڈبوں کی ضرورت ہوتی ہے جو ان کے متعلقہ ورک سٹیشن پر رہیں گے۔مقررہ جگہوں کے درمیان حرکت کرتے وقت ہاتھ دھوئے جائیں اور دستانے اور لیب کوٹ کو تبدیل کیا جائے۔ریجنٹس اور آلات کو گندے علاقے سے صاف جگہ پر منتقل نہیں کیا جانا چاہیے۔اگر کوئی انتہائی صورت پیدا ہوتی ہے جہاں کسی ری ایجنٹ یا سامان کے ٹکڑے کو پیچھے کی طرف منتقل کرنے کی ضرورت ہوتی ہے، تو اسے پہلے 10% سوڈیم ہائپوکلورائٹ سے آلودگی سے پاک کیا جانا چاہیے، اس کے بعد جراثیم سے پاک پانی سے صاف کرنا چاہیے۔

نوٹ

10% سوڈیم ہائپوکلورائٹ محلول روزانہ تازہ بنانا چاہیے۔جب آلودگی سے پاک کرنے کے لیے استعمال کیا جائے تو کم از کم 10 منٹ کے رابطے کے وقت کی پابندی کی جانی چاہیے۔
متبادل طور پر، تجارتی طور پر دستیاب پروڈکٹس جو ڈی این اے کو تباہ کرنے والے سطح کے جراثیم کش کے طور پر تصدیق شدہ ہیں استعمال کی جا سکتی ہیں اگر مقامی حفاظتی سفارشات سوڈیم ہائپوکلورائٹ کے استعمال کی اجازت نہیں دیتی ہیں یا اگر سوڈیم ہائپوکلورائٹ آلات کے دھاتی حصوں کو آلودگی سے پاک کرنے کے لیے موزوں نہیں ہے۔

مثالی طور پر، عملے کو یک طرفہ کام کے بہاؤ کی اخلاقیات کی پابندی کرنی چاہیے اور اسی دن گندے علاقوں (پی سی آر کے بعد) سے صاف علاقوں (پری پی سی آر) میں واپس نہیں جانا چاہیے۔تاہم، ایسے مواقع ہوسکتے ہیں جب یہ ناگزیر ہو۔جب ایسا موقع پیدا ہوتا ہے تو، اہلکاروں کو احتیاط سے ہاتھ دھونے، دستانے تبدیل کرنے، نامزد لیب کوٹ استعمال کرنے اور کسی بھی ایسے سامان کو متعارف نہیں کرانا چاہیے جو وہ دوبارہ کمرے سے باہر لے جانا چاہیں، جیسے کہ لیب کی کتابیں۔مالیکیولر طریقوں پر عملے کی تربیت میں اس طرح کے کنٹرول کے اقدامات پر زور دیا جانا چاہئے۔

استعمال کے بعد، بینچ کی جگہوں کو 10% سوڈیم ہائپوکلورائٹ (بقیہ بلیچ کو ہٹانے کے لیے جراثیم سے پاک پانی)، 70% ایتھنول، یا تجارتی طور پر دستیاب ڈی این اے کو تباہ کرنے والے ڈیکونٹامینٹ سے صاف کیا جانا چاہیے۔مثالی طور پر، الٹرا وائلٹ (UV) لیمپ کو شعاع ریزی کے ذریعے آلودگی سے پاک کرنے کے لیے نصب کیا جانا چاہیے۔تاہم، UV لیمپ کا استعمال بند کام کرنے والے علاقوں تک محدود ہونا چاہیے، مثلاً حفاظتی الماریاں، تاکہ لیبارٹری کے عملے کے UV کی نمائش کو محدود کیا جا سکے۔براہ کرم UV لیمپ کی دیکھ بھال، وینٹیلیشن اور صفائی کے لیے مینوفیکچرر کی ہدایات کی پابندی کریں تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ لیمپ موثر رہیں۔

اگر سوڈیم ہائپوکلورائٹ کی بجائے 70% ایتھنول استعمال کرتے ہیں، تو آلودگی کو مکمل کرنے کے لیے UV روشنی کے ساتھ شعاع ریزی کی ضرورت ہوگی۔
بنور اور سنٹری فیوج کو سوڈیم ہائپوکلورائٹ سے صاف نہ کریں۔اس کے بجائے، 70٪ ایتھنول کے ساتھ صاف کریں اور UV لائٹ کو بے نقاب کریں، یا تجارتی DNA کو تباہ کرنے والے ڈیکونٹامینٹ کا استعمال کریں۔پھیلنے کے لیے، مزید صفائی کے مشورے کے لیے مینوفیکچرر سے رجوع کریں۔اگر مینوفیکچرر کی ہدایات اس کی اجازت دیتی ہیں، تو پائپٹس کو معمول کے مطابق آٹوکلیو کے ذریعے جراثیم سے پاک کیا جانا چاہیے۔اگر پائپیٹس کو آٹوکلیو نہیں کیا جا سکتا ہے، تو انہیں 10% سوڈیم ہائپوکلورائٹ (جس کے بعد جراثیم سے پاک پانی سے اچھی طرح صاف کیا جاتا ہے) یا تجارتی DNA کو تباہ کرنے والے ڈیکونٹامینٹ سے صاف کرنا کافی ہے جس کے بعد UV کی نمائش ہوتی ہے۔

اعلی فیصد سوڈیم ہائپوکلورائٹ کے ساتھ صفائی کرنے سے بالآخر پائپیٹ پلاسٹک اور دھاتوں کو نقصان پہنچ سکتا ہے اگر باقاعدگی سے کیا جائے؛پہلے مینوفیکچرر سے سفارشات چیک کریں۔تمام آلات کو مینوفیکچرر کے تجویز کردہ شیڈول کے مطابق باقاعدگی سے کیلیبریٹ کرنے کی ضرورت ہے۔ایک نامزد شخص کو اس بات کو یقینی بنانے کا انچارج ہونا چاہئے کہ کیلیبریشن شیڈول پر عمل کیا گیا ہے، تفصیلی لاگز کو برقرار رکھا گیا ہے، اور سروس لیبل آلات پر واضح طور پر آویزاں ہیں۔

3. مخصوص سالماتی جگہ کے لیے استعمال اور صفائی کا مشورہ

پری پی سی آر: ریجنٹ ایلی کوٹنگ / ماسٹر مکس تیاری: یہ مالیکیولر تجربات کی تیاری کے لیے استعمال ہونے والی تمام خالی جگہوں میں سب سے صاف ہونا چاہیے اور مثالی طور پر یووی لائٹ سے لیس لیمینر فلو کیبنٹ ہونا چاہیے۔نمونے، نکالے گئے نیوکلک ایسڈ اور ایمپلیفائیڈ پی سی آر مصنوعات کو اس علاقے میں ہینڈل نہیں کیا جانا چاہیے۔ایمپلیفیکیشن ریجنٹس کو فریزر (یا فرج، مینوفیکچرر کی سفارشات کے مطابق) میں اسی مخصوص جگہ پر رکھنا چاہیے، مثالی طور پر لیمینر فلو کیبنٹ یا پری پی سی آر ایریا کے ساتھ۔پری پی سی آر ایریا یا لیمینر فلو کیبنٹ میں داخل ہونے پر ہر بار دستانے تبدیل کیے جائیں۔

پری پی سی آر ایریا یا لیمینر فلو کیبنٹ کو استعمال سے پہلے اور بعد میں اس طرح صاف کرنا چاہیے: کابینہ میں موجود تمام اشیاء کو صاف کریں، جیسے کہ پائپیٹ، ٹپ باکس، وورٹیکس، سینٹری فیوج، ٹیوب ریک، قلم وغیرہ کو 70 فیصد ایتھنول کے ساتھ صاف کریں۔ کمرشل ڈی این اے کو تباہ کرنے والا جراثیم کش، اور خشک ہونے دیں۔بند کام کرنے والے علاقے کی صورت میں، مثلاً لیمینر فلو کیبنٹ، ہڈ کو 30 منٹ کے لیے UV لائٹ کے سامنے رکھیں۔

نوٹ

ری ایجنٹس کو UV روشنی کے سامنے نہ لائیں؛صرف صاف ہونے کے بعد انہیں کابینہ میں منتقل کریں۔اگر ریورس ٹرانسکرپشن PCR انجام دے رہے ہیں، تو یہ سطحوں اور آلات کو کسی ایسے محلول کے ساتھ صاف کرنے میں بھی مددگار ثابت ہو سکتا ہے جو رابطے پر RNases کو توڑ دے۔یہ آر این اے کے انزائم انحطاط سے جھوٹے-منفی نتائج سے بچنے میں مدد کر سکتا ہے۔آلودگی سے پاک ہونے کے بعد اور ماسٹر مکس کی تیاری سے پہلے، دستانے ایک بار پھر تبدیل کیے جائیں، اور پھر کابینہ استعمال کے لیے تیار ہے۔

پری پی سی آر: نیوکلک ایسڈ نکالنا/ٹیمپلیٹ کا اضافہ:

نیوکلک ایسڈ کو ایک دوسرے نامزد علاقے میں نکالا اور ہینڈل کیا جانا چاہیے، پائپیٹ، فلٹر ٹپس، ٹیوب ریک، تازہ دستانے، لیب کوٹ اور دیگر آلات کا استعمال کرتے ہوئے۔ ماسٹر مکس ٹیوبیں یا پلیٹیں۔نکالے گئے نیوکلک ایسڈ کے نمونوں کی آلودگی سے بچنے کے لیے جن کا تجزیہ کیا جا رہا ہے، یہ سفارش کی جاتی ہے کہ مثبت کنٹرولز یا معیارات کو سنبھالنے سے پہلے دستانے تبدیل کیے جائیں اور پائپیٹ کا الگ سیٹ استعمال کریں۔پی سی آر ریجنٹس اور ایمپلیفائیڈ مصنوعات کو اس علاقے میں پائپ نہیں لگانا چاہیے۔نمونے اسی علاقے میں مقرر کردہ فرج یا فریزر میں محفوظ کیے جائیں۔نمونے کے کام کی جگہ کو ماسٹر مکس کی جگہ کی طرح صاف کیا جانا چاہیے۔

پوسٹ پی سی آر: ایمپلیفیکیشن اور ایمپلیفائیڈ پروڈکٹ کو سنبھالنا

یہ نامزد جگہ پوسٹ ایمپلیفیکیشن کے عمل کے لیے ہے اور اسے PCR سے پہلے والے علاقوں سے جسمانی طور پر الگ ہونا چاہیے۔اس میں عام طور پر تھرمو سائکلرز اور ریئل ٹائم پلیٹ فارم ہوتے ہیں، اور مثالی طور پر راؤنڈ 1 پی سی آر پروڈکٹ کو راؤنڈ 2 ری ایکشن میں شامل کرنے کے لیے لیمینر فلو کیبنٹ ہونا چاہیے، اگر نیسٹڈ پی سی آر کیا جا رہا ہے۔پی سی آر ریجنٹس اور نکالے گئے نیوکلک ایسڈ کو اس علاقے میں ہینڈل نہیں کرنا چاہیے کیونکہ آلودگی کا خطرہ زیادہ ہے۔اس علاقے میں دستانے، لیب کوٹ، پلیٹ اور ٹیوب ریک، پائپیٹ، فلٹر ٹپس، ڈبے اور دیگر سامان کا الگ سیٹ ہونا چاہیے۔نلیاں کھولنے سے پہلے سینٹرفیوج ہونی چاہئیں۔نمونے کے کام کی جگہ کو ماسٹر مکس کی جگہ کی طرح صاف کیا جانا چاہیے۔

پوسٹ پی سی آر: پروڈکٹ کا تجزیہ

یہ کمرہ پروڈکٹ کا پتہ لگانے کے آلات کے لیے ہے، جیسے جیل الیکٹروفورسس ٹینک، پاور پیک، یووی ٹرانسیلومیٹر اور جیل دستاویزی نظام۔اس علاقے میں دستانے، لیب کوٹ، پلیٹ اور ٹیوب ریک، پائپیٹ، فلٹر ٹپس، ڈبے اور دیگر سامان کے الگ سیٹ ہونے چاہئیں۔لوڈنگ ڈائی، مالیکیولر مارکر اور ایگروز جیل، اور بفر کے اجزاء کو چھوڑ کر، اس علاقے میں کوئی اور ری ایجنٹ نہیں لایا جا سکتا ہے۔نمونے کے کام کی جگہ کو ماسٹر مکس کی جگہ کی طرح صاف کیا جانا چاہیے۔

اہم نوٹ

مثالی طور پر، اگر پی سی آر کے بعد کے کمروں میں پہلے سے کام ہو چکا ہے تو اسی دن پری پی سی آر کمروں میں داخل نہیں ہونا چاہیے۔اگر یہ مکمل طور پر ناگزیر ہے، تو یقینی بنائیں کہ پہلے ہاتھ اچھی طرح دھوئے جائیں اور کمروں میں مخصوص لیب کوٹ پہنے جائیں۔لیب کی کتابیں اور کاغذی کارروائی کو پی سی آر سے پہلے کے کمروں میں نہیں لے جانا چاہیے اگر وہ پی سی آر کے بعد کے کمروں میں استعمال کیے گئے ہوں۔اگر ضروری ہو تو، پروٹوکول/سیمپل آئی ڈی وغیرہ کے ڈپلیکیٹ پرنٹ آؤٹ لے لیں۔

4. عمومی سالماتی حیاتیات کا مشورہ

پرکھ کی روک تھام سے بچنے کے لیے پاؤڈر سے پاک دستانے استعمال کریں۔آلودگی کو کم کرنے کے لیے پائپنگ کی درست تکنیک سب سے اہم ہے۔غلط پائپٹنگ کے نتیجے میں مائعات کی تقسیم اور ایروسول کی تخلیق کے دوران چھڑکاؤ ہو سکتا ہے۔صحیح پائپٹنگ کے لیے اچھی پریکٹس درج ذیل لنکس پر مل سکتی ہے: پائپٹنگ کے لیے گلسن گائیڈ، ایناچیم پائپٹنگ ٹیکنیک ویڈیوز، سینٹرفیوج ٹیوبیں کھولنے سے پہلے، اور چھڑکنے سے بچنے کے لیے انہیں احتیاط سے کھولیں۔آلودگیوں کے تعارف سے بچنے کے لیے استعمال کے فوراً بعد ٹیوبیں بند کر دیں۔

متعدد رد عمل انجام دیتے وقت، ایک ماسٹر مکس تیار کریں جس میں عام ری ایجنٹس ہوں (مثلاً پانی، ڈی این ٹی پی، بفر، پرائمر اور انزائم) تاکہ ری ایجنٹ کی منتقلی کی تعداد کو کم سے کم کیا جا سکے اور آلودگی کے خطرے کو کم کیا جا سکے۔ماسٹر مکس کو برف یا کولڈ بلاک پر لگانے کی سفارش کی جاتی ہے۔ہاٹ سٹارٹ انزائم کا استعمال غیر مخصوص مصنوعات کی پیداوار کو کم کرنے میں مدد کر سکتا ہے۔انحطاط سے بچنے کے لیے فلوروسینٹ پروبس پر مشتمل ریجنٹس کو روشنی سے بچائیں۔

5. اندرونی کنٹرولز

تمام ری ایکشنز میں بغیر ٹیمپلیٹ کنٹرول کے ساتھ اچھی خصوصیات والے، تصدیق شدہ مثبت اور منفی کنٹرولز، اور مقداری رد عمل کے لیے ایک ملٹی پوائنٹ ٹائٹریٹڈ ٹرینڈ لائن شامل کریں۔مثبت کنٹرول اتنا مضبوط نہیں ہونا چاہیے کہ اس سے آلودگی کا خطرہ ہو۔نیوکلک ایسڈ نکالتے وقت مثبت اور منفی نکالنے کے کنٹرول شامل کریں۔

یہ سفارش کی جاتی ہے کہ ہر ایک علاقے میں واضح ہدایات شائع کی جائیں تاکہ صارفین قواعد و ضوابط سے واقف ہوں۔کلینیکل نمونوں میں ڈی این اے یا آر این اے کی بہت کم سطح کا پتہ لگانے والی تشخیصی لیبز پری پی سی آر کمروں میں ہوا کا تھوڑا سا مثبت دباؤ اور پی سی آر کے بعد کے کمروں میں ہوا کا تھوڑا سا منفی دباؤ کے ساتھ علیحدہ ایئر ہینڈلنگ سسٹم رکھنے کے اضافی حفاظتی اقدام کو اپنانا چاہتی ہیں۔

آخر میں، کوالٹی ایشورنس (QA) پلان تیار کرنا مددگار ہے۔اس طرح کے منصوبے میں ریجنٹ ماسٹر اسٹاکس اور ورکنگ اسٹاکس کی فہرستیں، کٹس اور ری ایجنٹس کو ذخیرہ کرنے کے قواعد، کنٹرول کے نتائج کی رپورٹنگ، عملے کے تربیتی پروگرام، ٹربل شوٹنگ الگورتھم، اور ضرورت پڑنے پر اصلاحی اقدامات شامل ہونے چاہئیں۔

6. کتابیات

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. باب 3: ایک qPCR لیبارٹری کا قیام۔یو ایس ای پی اے کیو پی سی آر طریقہ 1611 کا استعمال کرتے ہوئے تفریحی پانی کی جانچ کے لیے رہنمائی دستاویز۔ لانسنگ- مشی گن اسٹیٹ یونیورسٹی۔

پبلک ہیلتھ انگلینڈ، این ایچ ایس۔مائیکرو بایولوجی تحقیقات کے لیے برطانیہ کے معیارات: مالیکیولر ایمپلیفیکیشن اسیسز انجام دیتے وقت اچھی لیبارٹری پریکٹس)۔کوالٹی گائیڈنس۔2013؛4(4):1–15۔

Mifflin T. PCR لیبارٹری کا قیام۔کولڈ اسپرنگ ہارب پروٹوک۔2007؛ 7۔

Schroeder S 2013. سینٹری فیوجز کی معمول کی دیکھ بھال: سینٹری فیوجز، روٹرز اور اڈاپٹرز کی صفائی، دیکھ بھال اور جراثیم کشی (وائٹ پیپر نمبر 14)۔ہیمبرگ: ایپنڈورف؛2013.

ویانا آر وی، والس سی ایل۔تشخیصی لیبارٹریوں میں استعمال ہونے والے مالیکیولر بیسڈ ٹیسٹوں کے لیے اچھی کلینیکل لیبارٹری پریکٹس (GCLP)، میں: اکیار I، ایڈیٹر۔کوالٹی کنٹرول کا وسیع سپیکٹرا۔ریجیکا، کروشیا: انٹیک؛2011: 29–52۔