Методи молекулярного виявлення мають здатність виробляти великий об’єм нуклеїнової кислоти шляхом ампліфікації слідових кількостей, виявлених у зразках.Хоча це корисно для забезпечення чутливого виявлення, це також створює ймовірність забруднення через поширення аерозолів підсилення в лабораторному середовищі.Під час проведення експериментів можна вжити заходів, щоб уникнути забруднення реагентів, лабораторного обладнання та простору стенда, оскільки таке забруднення може призвести до хибнопозитивних (або хибнонегативних) результатів.

Щоб зменшити ймовірність зараження, слід завжди дотримуватися належної лабораторної практики.Зокрема, слід вжити заходів щодо таких моментів:

1. Поводження з реагентами
2. Організація робочого простору та обладнання
3. Поради щодо використання та очищення для визначеного молекулярного простору
4. Загальні поради з молекулярної біології
5. Внутрішній контроль
6. Бібліографія

1. Поводження з реагентами

Коротко відцентрифугуйте пробірки з реагентами перед відкриттям, щоб уникнути утворення аерозолів.Аліквотні реагенти, щоб уникнути багаторазового заморожування-розморожування та забруднення основних запасів.Чітко маркуйте та датуйте всі пробірки з реагентами та реакційними пробірками та ведіть журнали номерів партій реагентів, які використовувалися в усіх експериментах.Прокапайте всі реагенти та зразки за допомогою фільтрів.Перед покупкою бажано уточнити у виробника, що наконечники фільтра відповідають марці піпетки, яка буде використовуватися.

2. Організація робочого простору та обладнання

Робочий простір має бути організовано таким чином, щоб робота проходила в одному напрямку, від чистих зон (до ПЛР) до брудних зон (після ПЛР).Наступні загальні запобіжні заходи допоможуть зменшити ймовірність зараження.Майте окремі призначені приміщення або принаймні фізично окремі зони для: приготування основної суміші, екстракції нуклеїнової кислоти та додавання матриці ДНК, ампліфікації та обробки ампліфікованого продукту та аналізу продукту, наприклад, гель-електрофорезу.

У деяких ситуаціях важко мати 4 окремі кімнати.Можливим, але менш бажаним варіантом є приготування основної суміші в закритій зоні, наприклад, у камері з ламінарним потоком.У разі гніздової ПЛР-ампліфікації приготування основної суміші для реакції другого раунду слід готувати в «чистій» зоні для приготування основної суміші, але інокуляцію первинним продуктом ПЛР слід проводити в кімнаті для ампліфікації та, якщо можливо, у спеціальній зоні утримання (наприклад, камері з ламінарним потоком).

Для кожної кімнати/зони потрібен окремий набір піпеток з чіткими мітками, наконечників для фільтрів, штативів для пробірок, вортексів, центрифуг (якщо доречно), ручок, загальних лабораторних реагентів, лабораторних халатів і коробок з рукавичками, які залишатимуться на робочих місцях.Руки необхідно мити, а рукавички та халати міняти під час пересування між визначеними зонами.Реагенти та обладнання не можна переносити з брудної зони в чисту.У екстремальному випадку, коли реагент або частину обладнання потрібно перемістити назад, їх потрібно спочатку знезаразити 10% гіпохлоритом натрію, а потім протерти стерильною водою.

Примітка

10% розчин гіпохлориту натрію необхідно щодня доводити свіжим.При використанні для дезактивації слід дотримуватися мінімального часу контакту 10 хвилин.
Крім того, комерційно доступні продукти, перевірені як засоби для дезактивації поверхні, що руйнують ДНК, можна використовувати, якщо місцеві рекомендації з безпеки не дозволяють використовувати гіпохлорит натрію або якщо гіпохлорит натрію не підходить для дезактивації металевих частин обладнання.

В ідеалі персонал повинен дотримуватися принципів односпрямованого робочого процесу і не повертатися з брудних зон (після ПЛР) назад до чистих (перед ПЛР) того самого дня.Однак можуть бути випадки, коли цього не уникнути.Коли виникає така нагода, персонал повинен подбати про те, щоб ретельно вимити руки, змінити рукавички, використовувати призначений лабораторний халат і не вносити будь-яке обладнання, яке вони захочуть знову винести з кімнати, наприклад, лабораторні книги.На такі заходи контролю слід звернути увагу під час навчання персоналу молекулярним методам.

Після використання робочі місця слід очистити 10% гіпохлоритом натрію (а потім стерильною водою для видалення залишків відбілювача), 70% етанолом або перевіреним комерційно доступним деконтамінантом, що руйнує ДНК.В ідеалі мають бути встановлені ультрафіолетові (УФ) лампи, щоб забезпечити знезараження шляхом опромінення.Однак використання ультрафіолетових ламп має бути обмежене закритими робочими зонами, наприклад, шафами безпеки, щоб обмежити вплив ультрафіолету на персонал лабораторії.Будь ласка, дотримуйтесь інструкцій виробника щодо догляду, вентиляції та чищення УФ-ламп, щоб забезпечити ефективність ламп.

Якщо замість гіпохлориту натрію використовується 70% етанол, для завершення дезактивації знадобиться опромінення ультрафіолетовим світлом.
Не очищайте вортекс і центрифугу гіпохлоритом натрію;натомість протріть 70% етанолом і піддайте ультрафіолетовому світлу або скористайтеся комерційним деконтамінантом, що руйнує ДНК.У разі розливів зверніться до виробника, щоб отримати додаткові поради щодо очищення.Якщо інструкції виробника це дозволяють, піпетки слід регулярно стерилізувати в автоклаві.Якщо піпетки не можна обробити в автоклаві, достатньо очистити їх 10% гіпохлоритом натрію (з подальшим ретельним протиранням стерильною водою) або комерційним дезактивуючим засобом, що руйнує ДНК, з подальшим опроміненням УФ-променями.

Очищення високовідсотковим гіпохлоритом натрію може зрештою пошкодити пластик піпетки та метал, якщо проводити його регулярно;спочатку перевірте рекомендації виробника.Все обладнання необхідно регулярно калібрувати згідно з графіком, рекомендованим виробником.Призначена особа повинна відповідати за дотримання графіку калібрування, ведення детальних журналів і чітке розміщення сервісних етикеток на обладнанні.

3. Поради щодо використання та очищення для визначеного молекулярного простору

Попередня ПЛР: аліквотування реагентів/підготовка основної суміші: це має бути найчистіше з усіх приміщень, що використовуються для підготовки молекулярних експериментів, і в ідеалі має бути призначена шафа з ламінарним потоком, обладнана ультрафіолетовим світлом.Зразки, екстраговані нуклеїнові кислоти та ампліфіковані продукти ПЛР заборонено обробляти в цій зоні.Реагенти для ампліфікації слід зберігати в морозильній камері (або холодильнику, згідно з рекомендаціями виробника) у тому самому призначеному місці, в ідеалі поряд з камерою ламінарного потоку або зоною попередньої ПЛР.Рукавички слід міняти кожного разу при вході в зону попередньої ПЛР або ламінарну камеру.

Зону попередньої ПЛР або камеру з ламінарним потоком слід очистити до та після використання таким чином: протріть усі предмети в шафі, наприклад піпетки, коробки для наконечників, вортекс, центрифуги, штативи для пробірок, ручки тощо 70% етанолом або комерційний дезактивуючий засіб, що руйнує ДНК, і дайте висохнути.У випадку закритої робочої зони, наприклад, камери з ламінарним потоком, виставте витяжку на УФ-проміння на 30 хвилин.

Примітка

Не піддавайте реагенти впливу УФ-променів;перемістіть їх у шафу лише після того, як вона буде чиста.Якщо виконується ПЛР зі зворотною транскрипцією, також може бути корисним протерти поверхні та обладнання розчином, який руйнує РНКази при контакті.Це може допомогти уникнути хибнонегативних результатів ферментативної деградації РНК.Після дезактивації та перед приготуванням майстер-міксу слід ще раз змінити рукавички, після чого шафа готова до використання.

Попередня ПЛР: екстракція нуклеїнової кислоти/додавання шаблону:

Нуклеїнову кислоту необхідно екстрагувати та обробляти у другій призначеній зоні, використовуючи окремий набір піпеток, наконечників фільтрів, штативів для пробірок, свіжих рукавичок, лабораторних халатів та іншого обладнання. Ця зона також призначена для додавання шаблону, елементів керування та ліній тенденції до пробірки або пластини Mastermix.Щоб уникнути забруднення екстрагованих зразків нуклеїнових кислот, які аналізуються, рекомендується міняти рукавички перед тим, як працювати з позитивними контролями або стандартами, і використовувати окремий набір піпеток.ПЛР-реагенти та ампліфіковані продукти не можна вводити піпеткою в цю зону.Зразки слід зберігати у спеціально відведених холодильниках або морозильниках у тому самому місці.Робочу область зразка слід очистити так само, як і простір Mastermix.

Після ПЛР: ампліфікація та обробка ампліфікованого продукту

Цей простір призначений для процесів після ампліфікації та має бути фізично відокремлений від зон перед ПЛР.Зазвичай він містить термоциклери та платформи реального часу, і в ідеалі має мати камеру з ламінарним потоком для додавання продукту ПЛР 1 до реакції 2 раунду, якщо виконується вкладена ПЛР.У цій зоні не можна працювати з ПЛР-реагентами та екстрагованою нуклеїновою кислотою, оскільки ризик зараження високий.У цій зоні має бути окремий комплект рукавичок, лабораторних халатів, підставок для планшетів і пробірок, піпеток, наконечників для фільтрів, бункерів та іншого обладнання.Перед відкриттям пробірки необхідно центрифугувати.Робочу область зразка слід очистити так само, як і простір Mastermix.

Після ПЛР: аналіз продукту

Це приміщення призначене для обладнання для виявлення продукту, наприклад резервуарів для електрофорезу гелю, блоків живлення, УФ-просвітлювача та системи документування гелю.У цій зоні повинні бути окремі набори рукавичок, лабораторних халатів, підставок для пластин і пробірок, піпеток, наконечників для фільтрів, бункерів та іншого обладнання.Жодні інші реагенти не можна вносити в цю зону, за винятком барвника для завантаження, молекулярного маркера та агарозного гелю та буферних компонентів.Робочу область зразка слід очистити так само, як і простір Mastermix.

Важливе зауваження

В ідеалі не варто заходити в кімнати до ПЛР в той же день, якщо в кімнатах після ПЛР вже була проведена робота.Якщо цього зовсім не уникнути, переконайтеся, що спочатку ретельно вимито руки, а в кімнатах одягнені спеціальні лабораторні халати.Лабораторні книжки та документи не можна проносити в кімнати до ПЛР, якщо вони використовувалися в кімнатах після ПЛР;при необхідності зробити дублікати роздруківок протоколів/ідентифікаторів зразків тощо.

4. Загальні поради з молекулярної біології

Щоб уникнути пригнічення аналізу, використовуйте рукавички без пудри.Правильна техніка дозування є найважливішою для зменшення забруднення.Неправильне дозування може призвести до бризок під час дозування рідини та утворення аерозолів.Корисні методи правильного дозування можна знайти за такими посиланнями: Посібник Gilson щодо дозування, відео про техніку дозування Anachem, Центрифужні пробірки перед відкриттям і обережно відкривайте їх, щоб уникнути бризок.Закрийте пробірки одразу після використання, щоб уникнути потрапляння забруднень.

Під час проведення кількох реакцій приготуйте одну майстер-мікс, що містить звичайні реагенти (наприклад, воду, dNTP, буфер, праймери та фермент), щоб мінімізувати кількість передач реагентів і зменшити загрозу забруднення.Рекомендується розміщувати майстер-мікс на льоду або холодному брилі.Використання ферменту Hot Start може допомогти зменшити виробництво неспецифічних продуктів.Захищайте реагенти, що містять флуоресцентні зонди, від світла, щоб уникнути розкладання.

5. Внутрішній контроль

Включайте добре охарактеризовані, підтверджені позитивні та негативні контролі разом із контролем без шаблону в усіх реакціях, а також багатоточкову лінію тренду для кількісних реакцій.Позитивний контроль не повинен бути настільки сильним, щоб створити ризик зараження.Включіть позитивний і негативний контролі екстракції під час екстракції нуклеїнової кислоти.

Рекомендується розмістити чіткі інструкції в кожній із зон, щоб користувачі були в курсі правил поведінки.Діагностичні лабораторії, які виявляють дуже низькі рівні ДНК або РНК у клінічних зразках, можуть захотіти прийняти додатковий захід безпеки, щоб мати окремі системи обробки повітря з трохи позитивним тиском повітря в кімнатах до ПЛР і злегка негативним тиском повітря в кімнатах після ПЛР.

Нарешті, корисно розробити план забезпечення якості (QA).Такий план має включати списки основних і робочих запасів реагентів, правила зберігання наборів і реагентів, звітування про результати контролю, програми навчання персоналу, алгоритми усунення несправностей і заходи з усунення несправностей, якщо це необхідно.

6. Бібліографія

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Розділ 3: Створення лабораторії qPCR.Керівний документ для тестування рекреаційних вод за допомогою методу USEPA qPCR 1611. Університет штату Лансінг-Мічіган.

Public Health England, NHS.Стандарти Великобританії для мікробіологічних досліджень: належна лабораторна практика при виконанні аналізів молекулярної ампліфікації).Керівництво з якості.2013;4(4):1–15.

Міффлін Т. Створення ПЛР-лабораторії.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Регулярне технічне обслуговування центрифуг: очищення, технічне обслуговування та дезінфекція центрифуг, роторів і адаптерів (White paper № 14).Гамбург: Eppendorf;2013 рік.

Viana RV, Wallis CL.Належна клінічна лабораторна практика (GCLP) для молекулярних тестів, що використовуються в діагностичних лабораторіях, в: Akyar I, редактор.Широкий спектр контролю якості.Рієка, Хорватія: Intech;2011: 29–52.