Moleküler tespit yöntemleri, numunelerde bulunan eser miktarların amplifikasyonu yoluyla büyük miktarda nükleik asit üretme yeteneğine sahiptir.Bu, hassas algılamayı sağlamak için faydalı olmakla birlikte, laboratuvar ortamında amplifikasyon aerosollerinin yayılması yoluyla kontaminasyon olasılığını da beraberinde getirir.Deneyler yapılırken, reaktiflerin, laboratuvar ekipmanının ve tezgah alanının kontaminasyonunu önlemek için önlemler alınabilir, çünkü bu kontaminasyon yanlış pozitif (veya yanlış negatif) sonuçlara yol açabilir.

Kontaminasyon olasılığını azaltmaya yardımcı olmak için, İyi Laboratuvar Uygulamaları her zaman uygulanmalıdır.Özellikle, aşağıdaki noktalara ilişkin önlemler alınmalıdır:

1. Reaktifleri kullanma
2. Çalışma alanı ve ekipmanın organizasyonu
3. Belirlenen moleküler alan için kullanım ve temizlik tavsiyesi
4. Genel moleküler biyoloji tavsiyesi
5. Dahili kontroller
6. Kaynakça

1. Reaktifleri kullanma

Aerosol oluşumunu önlemek için reaktif tüplerini açmadan önce kısaca santrifüjleyin.Birden fazla donma-çözülme ve ana stokların kontaminasyonunu önlemek için reaktifleri bölün.Tüm reaktif ve reaksiyon tüplerini açık bir şekilde etiketleyin ve tarih atın ve tüm deneylerde kullanılan reaktif lotu ve parti numaralarının günlüklerini tutun.Filtre uçlarını kullanarak tüm reaktifleri ve numuneleri pipetleyin.Satın almadan önce, filtre uçlarının kullanılacak pipet markasına uygun olduğunun üretici ile teyit edilmesi tavsiye edilir.

2. Çalışma alanı ve ekipmanın organizasyonu

Çalışma alanı, iş akışının temiz alanlardan (PCR öncesi) kirli alanlara (PCR sonrası) doğru tek yönde gerçekleşmesini sağlayacak şekilde düzenlenmelidir.Aşağıdaki genel önlemler kontaminasyon olasılığını azaltmaya yardımcı olacaktır.Ana karışım hazırlama, nükleik asit ekstraksiyonu ve DNA şablonu ekleme, amplifikasyon ve amplifiye ürünün işlenmesi ve ürün analizi, örneğin jel elektroforezi için ayrı belirlenmiş odalara veya en azından fiziksel olarak ayrı alanlara sahip olun.

Bazı ortamlarda 4 ayrı odaya sahip olmak zordur.Muhtemel fakat daha az arzu edilen bir seçenek, ana karışım hazırlığının bir muhafaza alanında, örneğin bir laminer akış kabininde yapılmasıdır.Nested PCR amplifikasyonu durumunda, ikinci tur reaksiyon için ana karışımın hazırlanması, ana karışımın hazırlanması için 'temiz' alanda hazırlanmalıdır, ancak birincil PCR ürünü ile aşılama, amplifikasyon odasında yapılmalı ve mümkünse ayrılmış bir muhafaza alanında (örneğin, bir laminer akış kabini).

Her oda/alan, ilgili iş istasyonlarında kalacak ayrı bir açıkça etiketlenmiş pipetler, filtre uçları, tüp rafları, vorteksler, santrifüjler (ilgiliyse), kalemler, jenerik laboratuvar reaktifleri, laboratuvar önlükleri ve eldiven kutularından oluşan ayrı bir sete ihtiyaç duyar.Belirlenen alanlar arasında hareket edilirken eller yıkanmalı ve eldivenler ve laboratuvar önlükleri değiştirilmelidir.Reaktifler ve ekipman kirli bir alandan temiz bir alana taşınmamalıdır.Bir reaktif veya ekipman parçasının geriye doğru taşınması gereken aşırı bir durum ortaya çıkarsa, önce %10 sodyum hipoklorit ile dekontamine edilmeli, ardından steril su ile silinmelidir.

Not

%10'luk sodyum hipoklorit solüsyonu her gün taze olarak hazırlanmalıdır.Dekontaminasyon için kullanıldığında minimum 10 dakikalık temas süresine uyulmalıdır.
Alternatif olarak, yerel güvenlik tavsiyeleri sodyum hipoklorit kullanımına izin vermiyorsa veya sodyum hipoklorit ekipmanın metal parçalarını dekontamine etmek için uygun değilse, DNA'yı yok eden yüzey dekontaminantları olarak onaylanan ticari olarak temin edilebilen ürünler kullanılabilir.

İdeal olarak, personel tek yönlü iş akışı ahlakına uymalı ve aynı gün kirli alanlardan (PCR sonrası) temiz alanlara (PCR öncesi) gitmemelidir.Ancak bunun kaçınılmaz olduğu durumlar da olabilir.Böyle bir durum ortaya çıktığında personel, ellerini iyice yıkamaya, eldivenlerini değiştirmeye, belirlenen laboratuvar önlüğünü kullanmaya ve laboratuvar kitapları gibi odadan çıkarmak isteyecekleri herhangi bir ekipmanı tekrar odadan çıkarmamaya özen göstermelidir.Moleküler yöntemlerle ilgili personel eğitiminde bu tür kontrol önlemleri vurgulanmalıdır.

Kullanımdan sonra tezgah alanları %10 sodyum hipoklorit (ardından kalan ağartıcıyı çıkarmak için steril su), %70 etanol veya ticari olarak temin edilebilen onaylanmış bir DNA yok edici dekontaminant ile temizlenmelidir.İdeal olarak, ışınlama yoluyla dekontaminasyonu sağlamak için ultraviyole (UV) lambalar takılmalıdır.Bununla birlikte, laboratuvar personelinin UV maruziyetini sınırlamak için UV lambalarının kullanımı, güvenlik kabinleri gibi kapalı çalışma alanlarıyla sınırlandırılmalıdır.Lambaların etkili kalmasını sağlamak için lütfen UV lambası bakımı, havalandırması ve temizliği ile ilgili üretici talimatlarına uyun.

Sodyum hipoklorit yerine %70 etanol kullanılıyorsa, dekontaminasyonu tamamlamak için UV ışığı ile ışınlama gerekecektir.
Vorteks ve santrifüjü sodyum hipoklorit ile temizlemeyin;bunun yerine %70 etanol ile silin ve UV ışığına maruz bırakın veya ticari bir DNA yok edici dekontaminant kullanın.Dökülmeler için, daha fazla temizlik tavsiyesi için üreticiye danışın.Üretici talimatları izin veriyorsa, pipetler rutin olarak otoklav ile sterilize edilmelidir.Pipetler otoklavlanamıyorsa, %10 sodyum hipoklorit (ardından steril su ile kapsamlı bir silme) veya ticari bir DNA yok edici dekontaminant ile temizlemek ve ardından UV'ye maruz bırakmak yeterli olmalıdır.

Yüksek yüzdeli sodyum hipoklorit ile temizlik, düzenli olarak yapılırsa sonunda pipet plastiklerine ve metallerine zarar verebilir;önce üreticinin önerilerini kontrol edin.Tüm ekipmanın, üretici tarafından önerilen programa göre düzenli olarak kalibre edilmesi gerekir.Kalibrasyon planına uyulmasını, ayrıntılı günlüklerin tutulmasını ve servis etiketlerinin ekipman üzerinde net bir şekilde görüntülenmesini sağlamaktan sorumlu bir kişi atanmalıdır.

3. Belirlenen moleküler alan için kullanım ve temizlik tavsiyesi

Pre-PCR: Reaktif alikotlama / ana karışım hazırlama: Bu, moleküler deneylerin hazırlanması için kullanılan tüm alanların en temizi olmalı ve ideal olarak UV ışığı ile donatılmış, belirlenmiş bir laminer akış kabini olmalıdır.Numuneler, ekstre edilmiş nükleik asit ve amplifiye PCR ürünleri bu alanda kullanılmamalıdır.Amplifikasyon reaktifleri, bir dondurucuda (veya üretici tavsiyelerine göre buzdolabında) aynı belirlenmiş alanda, ideal olarak laminer akış kabini veya ön PCR alanının yanında tutulmalıdır.Eldivenler, PCR öncesi alana veya laminar akış kabinine her girildiğinde değiştirilmelidir.

Pre-PCR alanı veya laminer akış kabini kullanımdan önce ve sonra aşağıdaki şekilde temizlenmelidir: Kabindeki tüm öğeleri, örneğin pipetler, uç kutuları, vorteks, santrifüj, tüp rafları, kalemler vb. ticari DNA'yı yok eden dekontaminant ve kurumaya bırakın.Laminar akış kabini gibi kapalı bir çalışma alanında, davlumbazı 30 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın.

Not

Reaktifleri UV ışığına maruz bırakmayın;bunları yalnızca temizlendikten sonra kabine taşıyın.Ters transkripsiyon PCR gerçekleştiriliyorsa, temas halinde RNazları parçalayan bir solüsyonla yüzeylerin ve ekipmanın silinmesi de yararlı olabilir.Bu, RNA'nın enzim bozunmasından kaynaklanan yanlış negatif sonuçların önlenmesine yardımcı olabilir.Dekontaminasyon sonrasında ve mastermix hazırlanmadan önce eldivenler bir kez daha değiştirilerek kabin kullanıma hazır hale gelir.

Pre-PCR: Nükleik asit ekstraksiyonu/şablon ekleme:

Nükleik asit, ayrı bir pipet seti, filtre uçları, tüp rafları, taze eldivenler, laboratuvar önlükleri ve diğer ekipman kullanılarak ikinci bir belirlenmiş alanda ekstrakte edilmeli ve işlenmelidir. Bu alan aynı zamanda şablon, kontroller ve trend çizgilerinin mastermix tüpleri veya plakaları.Analiz edilmekte olan ekstrakte nükleik asit örneklerinin kontaminasyonunu önlemek için, pozitif kontroller veya standartlar kullanılmadan önce eldivenlerin değiştirilmesi ve ayrı bir pipet seti kullanılması önerilir.PCR reaktifleri ve amplifiye ürünler bu alanda pipetlenmemelidir.Numuneler, aynı alanda belirlenmiş buzdolaplarında veya dondurucularda saklanmalıdır.Örnek çalışma alanı, mastermix alanıyla aynı şekilde temizlenmelidir.

PCR Sonrası: Amplifikasyon ve amplifiye edilmiş ürünün işlenmesi

Bu belirlenmiş alan amplifikasyon sonrası süreçler içindir ve PCR öncesi alanlardan fiziksel olarak ayrı olmalıdır.Genellikle termo döngüleyiciler ve gerçek zamanlı platformlar içerir ve ideal olarak, eğer yuvalanmış PCR gerçekleştiriliyorsa, 1. tur PCR ürününü 2. tur reaksiyonuna eklemek için bir laminar akış kabinine sahip olmalıdır.Kontaminasyon riski yüksek olduğundan, PCR reaktifleri ve ekstrakte edilmiş nükleik asit bu alanda kullanılmamalıdır.Bu alanda ayrı bir eldiven seti, laboratuvar önlüğü, plaka ve tüp rafları, pipetler, filtre uçları, kutular ve diğer ekipmanlar bulunmalıdır.Tüpler açılmadan önce santrifüj edilmelidir.Örnek çalışma alanı, mastermix alanıyla aynı şekilde temizlenmelidir.

PCR Sonrası: Ürün analizi

Bu oda, örneğin jel elektroforez tankları, güç kaynakları, UV transillüminatörü ve jel dokümantasyon sistemi gibi ürün saptama ekipmanı içindir.Bu alanda ayrı eldiven setleri, laboratuvar önlükleri, plaka ve tüp rafları, pipetler, filtre uçları, kutular ve diğer ekipmanlar bulunmalıdır.Bu alana yükleme boyası, moleküler işaretleyici ve agaroz jel ve tampon bileşenleri dışında başka hiçbir reaktif getirilemez.Örnek çalışma alanı, mastermix alanıyla aynı şekilde temizlenmelidir.

Önemli Not

İdeal olarak, PCR sonrası odalarda çalışma yapılmışsa, PCR öncesi odalara aynı gün girilmemelidir.Bu tamamen kaçınılmazsa, önce ellerin iyice yıkandığından ve odalarda özel laboratuvar önlüklerinin giyildiğinden emin olun.Laboratuvar kitapları ve evrakları, PCR sonrası odalarda kullanılmışsa, PCR öncesi odalara alınmamalıdır;gerekirse, protokollerin/numune kimliklerinin vb. çift çıktılarını alın.

4. Genel moleküler biyoloji tavsiyesi

Tahlil inhibisyonunu önlemek için pudrasız eldiven kullanın.Doğru pipetleme tekniği kontaminasyonu azaltmak için çok önemlidir.Yanlış pipetleme, sıvıları dağıtırken sıçramaya ve aerosollerin oluşmasına neden olabilir.Doğru pipetleme için iyi uygulamalar aşağıdaki bağlantılarda bulunabilir: Gilson pipetleme kılavuzu, Anachem pipetleme tekniği videoları, Tüpleri açmadan önce santrifüjleyin ve sıçramasını önlemek için dikkatlice açın.Kirleticilerin girmesini önlemek için kullanımdan hemen sonra tüpleri kapatın.

Birden fazla reaksiyon gerçekleştirirken, reaktif transfer sayısını en aza indirmek ve kontaminasyon tehdidini azaltmak için ortak reaktifler (örn. su, dNTP'ler, tampon, primerler ve enzim) içeren bir ana karışım hazırlayın.Ana karışımın buz veya soğuk bir blok üzerine kurulması tavsiye edilir.Bir Hot Start enziminin kullanılması, spesifik olmayan ürünlerin üretimini azaltmaya yardımcı olabilir.Bozunmayı önlemek için floresan probları içeren reaktifleri ışıktan koruyun.

5. Dahili kontroller

İyi karakterize edilmiş, onaylanmış pozitif ve negatif kontrollerin yanı sıra tüm reaksiyonlarda şablonsuz kontrol ve kantitatif reaksiyonlar için çok noktalı titre edilmiş bir eğilim çizgisi içerir.Pozitif kontrol, kontaminasyon riski oluşturacak kadar güçlü olmamalıdır.Nükleik asit ekstraksiyonu gerçekleştirirken pozitif ve negatif ekstraksiyon kontrollerini dahil edin.

Kullanıcıların davranış kurallarından haberdar olması için her alana net talimatların asılması önerilir.Klinik numunelerde çok düşük seviyelerde DNA veya RNA saptayan teşhis laboratuvarları, PCR öncesi odalarda biraz pozitif hava basıncı ve PCR sonrası odalarda biraz negatif hava basıncı olan ayrı hava işleme sistemlerine sahip olmak gibi ek bir güvenlik önlemi almak isteyebilir.

Son olarak, bir kalite güvence (QA) planı geliştirmek faydalıdır.Böyle bir plan, reaktif ana stoklarının ve çalışma stoklarının listelerini, kitleri ve reaktifleri saklama kurallarını, kontrol sonuçlarının raporlanmasını, personel eğitim programlarını, sorun giderme algoritmalarını ve gerektiğinde düzeltici eylemleri içermelidir.

6. Kaynakça

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Bölüm 3: Bir qPCR laboratuvarı kurmak.USEPA qPCR yöntemi 1611 kullanılarak rekreasyonel suların test edilmesi için bir kılavuz belge. Lansing- Michigan Eyalet Üniversitesi.

Halk Sağlığı İngiltere, NHS.Mikrobiyoloji araştırmaları için Birleşik Krallık standartları: Moleküler amplifikasyon tahlilleri yapılırken İyi Laboratuvar Uygulaması).Kaliteli Rehberlik.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. PCR laboratuvarı kurmak.Soğuk Kaynak Harb Protokolü.2007;7.

Schroeder S 2013. Santrifüjlerin rutin bakımı: santrifüjlerin, rotorların ve adaptörlerin temizlenmesi, bakımı ve dezenfeksiyonu (Beyaz kağıt No. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Tanı laboratuvarlarında kullanılan moleküler tabanlı testler için İyi Klinik Laboratuvar Uygulaması (GCLP), İçinde: Akyar I, editör.Geniş kalite kontrol yelpazesi.Rijeka, Hırvatistan: Intech;2011: 29–52.