Ang mga molecular detection method ay may kakayahang gumawa ng malaking volume ng nucleic acid sa pamamagitan ng amplification ng trace quantity na matatagpuan sa mga sample.Bagama't ito ay kapaki-pakinabang para sa pagpapagana ng sensitibong pagtuklas, ipinakikilala rin nito ang posibilidad ng kontaminasyon sa pamamagitan ng pagkalat ng mga amplification aerosol sa kapaligiran ng laboratoryo.Kapag nagsasagawa ng mga eksperimento, maaaring magsagawa ng mga hakbang upang maiwasan ang kontaminasyon ng mga reagents, kagamitan sa laboratoryo at bench space, dahil ang naturang kontaminasyon ay maaaring makabuo ng false-positive (o false-negative) na resulta.

Upang makatulong na mabawasan ang posibilidad ng kontaminasyon, ang Good Laboratory Practice ay dapat gawin sa lahat ng oras.Sa partikular, ang mga pag-iingat ay dapat gawin tungkol sa mga sumusunod na punto:

1. Paghawak ng mga reagents
2. Organisasyon ng workspace at kagamitan
3. Paggamit at paglilinis ng payo para sa itinalagang molecular space
4. Pangkalahatang payo sa molecular biology
5. Mga panloob na kontrol
6. Bibliograpiya

1. Paghawak ng mga reagents

Saglit na i-centrifuge ang mga tubo ng reagent bago buksan upang maiwasan ang pagbuo ng mga aerosol.Aliquot reagents upang maiwasan ang maramihang freeze-thaws at ang kontaminasyon ng master stocks.Malinaw na lagyan ng label at lagyan ng petsa ang lahat ng reagent at reaction tubes at panatilihin ang mga log ng reagent lot at batch number na ginamit sa lahat ng eksperimento.Pipette ang lahat ng reagents at sample gamit ang mga tip sa filter.Bago bumili, ipinapayong kumpirmahin sa tagagawa na ang mga tip sa filter ay angkop sa tatak ng pipette na gagamitin.

2. Organisasyon ng workspace at kagamitan

Dapat ayusin ang workspace upang matiyak na ang daloy ng trabaho ay nangyayari sa isang direksyon, mula sa malinis na lugar (pre-PCR) hanggang sa maruruming lugar (post-PCR).Ang mga sumusunod na pangkalahatang pag-iingat ay makakatulong upang mabawasan ang pagkakataon ng kontaminasyon.Magkaroon ng hiwalay na mga itinalagang silid, o sa pinakamababang pisikal na hiwalay na mga lugar, para sa: paghahanda ng mastermix, pagkuha ng nucleic acid at pagdaragdag ng template ng DNA, pagpapalakas at paghawak ng amplified na produkto, at pagsusuri ng produkto, hal. gel electrophoresis.

Sa ilang setting, mahirap magkaroon ng 4 na magkakahiwalay na kwarto.Ang isang posible ngunit hindi gaanong kanais-nais na opsyon ay gawin ang paghahanda ng mastermix sa isang containment area, hal. isang laminar flow cabinet.Sa kaso ng nested PCR amplification, ang paghahanda ng mastermix para sa pangalawang round na reaksyon ay dapat ihanda sa 'malinis' na lugar para sa paghahanda ng mastermix, ngunit ang inoculation na may pangunahing produkto ng PCR ay dapat gawin sa amplification room, at kung maaari sa isang nakalaang containment area (hal. isang laminar flow cabinet).

Ang bawat silid/lugar ay nangangailangan ng isang hiwalay na hanay ng mga pipette na malinaw na may label, mga tip sa filter, mga tube rack, mga vortex, mga centrifuges (kung may kaugnayan), mga panulat, mga generic na lab reagents, mga lab coat at mga kahon ng guwantes na mananatili sa kani-kanilang mga workstation.Dapat hugasan ang mga kamay at palitan ang mga guwantes at lab coat kapag lumilipat sa pagitan ng mga itinalagang lugar.Ang mga reagents at kagamitan ay hindi dapat ilipat mula sa isang maruming lugar patungo sa isang malinis na lugar.Kung sakaling magkaroon ng matinding kaso kung saan ang isang reagent o piraso ng kagamitan ay kailangang ilipat pabalik, dapat muna itong ma-decontaminate ng 10% sodium hypochlorite, na sinusundan ng isang punasan ng sterile na tubig.

Tandaan

Ang 10% sodium hypochlorite solution ay dapat gawin sariwa araw-araw.Kapag ginamit para sa decontamination, ang pinakamababang oras ng pakikipag-ugnayan na 10 minuto ay dapat sundin.
Bilang kahalili, ang mga produktong available sa komersyo na napatunayan bilang mga decontaminant sa ibabaw na sumisira sa DNA ay maaaring gamitin kung hindi pinapayagan ng mga lokal na rekomendasyon sa kaligtasan ang paggamit ng sodium hypochlorite o kung ang sodium hypochlorite ay hindi angkop para sa pag-decontaminate sa mga metal na bahagi ng kagamitan.

Sa isip, ang mga kawani ay dapat sumunod sa unidirectional work flow etos at hindi bumalik mula sa maruruming lugar (post-PCR) pabalik sa malinis na lugar (pre-PCR) sa parehong araw.Gayunpaman, maaaring may mga pagkakataon na hindi ito maiiwasan.Kapag lumitaw ang ganoong okasyon, dapat mag-ingat ang mga tauhan na maghugas ng kamay, magpalit ng guwantes, gumamit ng itinalagang lab coat at huwag magpakilala ng anumang kagamitan na gusto nilang ilabas muli sa silid, tulad ng mga lab book.Ang ganitong mga hakbang sa pagkontrol ay dapat bigyang-diin sa pagsasanay ng mga kawani sa mga pamamaraang molekular.

Pagkatapos gamitin, ang mga bench space ay dapat linisin ng 10% sodium hypochlorite (sinusundan ng sterile na tubig para maalis ang natitirang bleach), 70% ethanol, o isang validated na pangkomersyong available na DNA-destroying decontaminant.Sa isip, ang mga ultra-violet (UV) na lamp ay dapat na nilagyan upang paganahin ang decontamination sa pamamagitan ng pag-iilaw.Gayunpaman, ang paggamit ng mga UV lamp ay dapat na limitado sa mga saradong lugar ng trabaho, hal. mga safety cabinet, upang limitahan ang pagkakalantad ng UV ng kawani ng laboratoryo.Mangyaring sumunod sa mga tagubilin ng tagagawa para sa pangangalaga sa UV lamp, bentilasyon at paglilinis upang matiyak na mananatiling epektibo ang mga lamp.

Kung gumagamit ng 70% ethanol sa halip na sodium hypochlorite, kakailanganin ang pag-iilaw gamit ang UV light para makumpleto ang decontamination.
Huwag linisin ang vortex at centrifuge na may sodium hypochlorite;sa halip, punasan gamit ang 70% ethanol at ilantad sa UV light, o gumamit ng komersyal na decontaminant na sumisira sa DNA.Para sa mga spill, suriin sa tagagawa para sa karagdagang payo sa paglilinis.Kung pinahihintulutan ito ng mga tagubilin ng tagagawa, ang mga pipette ay dapat na regular na isterilisado sa pamamagitan ng autoclave.Kung hindi ma-autoclave ang mga pipette, sapat na itong linisin ang mga ito ng 10% sodium hypochlorite (susundan ng masusing pagpahid ng sterile na tubig) o gamit ang isang komersyal na decontaminant na sumisira sa DNA na sinusundan ng pagkakalantad sa UV.

Ang paglilinis na may mataas na porsyento ng sodium hypochlorite ay maaaring makapinsala sa mga pipette na plastik at metal kung regular na ginagawa;suriin muna ang mga rekomendasyon mula sa tagagawa.Ang lahat ng kagamitan ay kailangang i-calibrate nang regular ayon sa iskedyul na inirerekomenda ng tagagawa.Ang isang itinalagang tao ay dapat na namamahala sa pagtiyak na ang iskedyul ng pagkakalibrate ay sinusunod, ang mga detalyadong log ay pinananatili, at ang mga label ng serbisyo ay malinaw na ipinapakita sa kagamitan.

3. Paggamit at paglilinis ng payo para sa itinalagang molecular space

Pre-PCR: Paghahanda ng reagent aliquoting / mastermix: Ito dapat ang pinakamalinis sa lahat ng puwang na ginagamit para sa paghahanda ng mga molekular na eksperimento at dapat ay isang nakatalagang laminar flow cabinet na nilagyan ng UV light.Ang mga sample, kinuhang nucleic acid at amplified PCR na mga produkto ay hindi dapat hawakan sa lugar na ito.Ang mga amplification reagents ay dapat na itago sa isang freezer (o refrigerator, ayon sa mga rekomendasyon ng tagagawa) sa parehong itinalagang espasyo, perpektong nasa tabi ng laminar flow cabinet o pre-PCR area.Ang mga guwantes ay dapat palitan sa bawat oras sa pagpasok sa pre-PCR area o laminar flow cabinet.

Ang lugar ng pre-PCR o laminar flow cabinet ay dapat linisin bago at pagkatapos gamitin tulad ng sumusunod: Punasan ang lahat ng mga bagay sa cabinet, hal. pipette, tip box, vortex, centrifuge, tube rack, pen, atbp. gamit ang 70% ethanol o a komersyal na decontaminant na sumisira sa DNA, at hayaang matuyo.Sa kaso ng isang saradong lugar ng trabaho, hal. isang laminar flow cabinet, ilantad ang hood sa UV light sa loob ng 30 minuto.

Tandaan

Huwag ilantad ang mga reagents sa UV light;ilipat lamang ang mga ito sa cabinet kapag malinis na ito.Kung nagsasagawa ng reverse transcription PCR, maaaring makatulong din na punasan ang mga ibabaw at kagamitan gamit ang solusyon na sumisira sa mga RNases kapag nakikipag-ugnayan.Maaaring makatulong ito upang maiwasan ang mga maling negatibong resulta mula sa pagkasira ng enzyme ng RNA.Pagkatapos ng decontamination at bago ihanda ang mastermix, dapat palitan muli ang mga guwantes, at pagkatapos ay handa nang gamitin ang cabinet.

Pre-PCR: Pagkuha ng nucleic acid/pagdaragdag ng template:

Ang nucleic acid ay dapat makuha at hawakan sa isang pangalawang itinalagang lugar, gamit ang isang hiwalay na hanay ng mga pipette, mga tip sa filter, tube rack, sariwang guwantes, mga lab coat at iba pang kagamitan. Ang lugar na ito ay para din sa pagdaragdag ng template, mga kontrol at mga trendline sa mastermix tubes o plates.Upang maiwasan ang kontaminasyon ng mga nakuhang sample ng nucleic acid na sinusuri, inirerekomendang magpalit ng guwantes bago humawak ng mga positibong kontrol o pamantayan at gumamit ng hiwalay na hanay ng mga pipette.Ang mga PCR reagents at amplified na produkto ay hindi dapat i-pipet sa lugar na ito.Ang mga sample ay dapat na nakaimbak sa mga itinalagang refrigerator o freezer sa parehong lugar.Ang sample na workspace ay dapat linisin sa parehong paraan tulad ng mastermix space.

Post-PCR: Pagpapalakas at paghawak ng pinalakas na produkto

Ang itinalagang puwang na ito ay para sa mga proseso ng post-amplification at dapat na pisikal na hiwalay sa mga lugar bago ang PCR.Karaniwan itong naglalaman ng mga thermocyclers at real-time na mga platform, at dapat ay mayroong laminar flow cabinet para sa pagdaragdag ng round 1 PCR na produkto sa round 2 na reaksyon, kung ang nested PCR ay isinasagawa.Ang mga PCR reagents at na-extract na nucleic acid ay hindi dapat hawakan sa lugar na ito dahil mataas ang panganib ng kontaminasyon.Ang lugar na ito ay dapat magkaroon ng hiwalay na hanay ng mga guwantes, lab coat, plate at tube rack, pipette, filter tip, bin at iba pang kagamitan.Ang mga tubo ay dapat na sentripugado bago buksan.Ang sample na workspace ay dapat linisin sa parehong paraan tulad ng mastermix space.

Post-PCR: Pagsusuri ng produkto

Ang silid na ito ay para sa mga kagamitan sa pag-detect ng produkto, hal. gel electrophoresis tank, power pack, UV transilluminator at ang gel documentation system.Ang lugar na ito ay dapat na may magkahiwalay na hanay ng mga guwantes, lab coat, plate at tube rack, pipette, filter tip, bin at iba pang kagamitan.Walang ibang reagents ang maaaring dalhin sa lugar na ito, hindi kasama ang loading dye, molecular marker at agarose gel, at buffer components.Ang sample na workspace ay dapat linisin sa parehong paraan tulad ng mastermix space.

Mahalagang paalaala

Sa isip, ang mga pre-PCR room ay hindi dapat ipasok sa parehong araw kung ang trabaho ay naisagawa na sa post-PCR rooms.Kung ito ay ganap na hindi maiiwasan, siguraduhin na ang mga kamay ay unang hinugasan ng maigi at ang mga partikular na lab coat ay isinusuot sa mga silid.Ang mga lab book at papeles ay hindi dapat dalhin sa pre-PCR rooms kung sila ay ginamit sa post-PCR rooms;kung kinakailangan, kumuha ng mga duplicate na print-out ng mga protocol/sample ID, atbp.

4. Pangkalahatang payo sa molecular biology

Gumamit ng mga guwantes na walang pulbos upang maiwasan ang pagsugpo sa assay.Ang tamang pamamaraan ng pipetting ay pinakamahalaga sa pagbabawas ng kontaminasyon.Ang maling pipetting ay maaaring magresulta sa pag-splash kapag naglalabas ng mga likido at ang paglikha ng mga aerosol.Matatagpuan ang magandang kasanayan para sa tamang pipetting sa mga sumusunod na link: Gilson guide to pipetting, Anachem pipetting technique videos, Centrifuge tubes bago buksan, at maingat na buksan ang mga ito upang maiwasan ang splashing.Isara kaagad ang mga tubo pagkatapos gamitin upang maiwasan ang pagpasok ng mga kontaminant.

Kapag nagsasagawa ng maraming reaksyon, maghanda ng isang mastermix na naglalaman ng mga karaniwang reagents (hal. tubig, dNTP, buffer, primer at enzyme) upang mabawasan ang bilang ng mga paglilipat ng reagent at mabawasan ang banta ng kontaminasyon.Inirerekomenda na i-set up ang mastermix sa yelo o isang malamig na bloke.Ang paggamit ng isang Hot Start enzyme ay maaaring makatulong upang mabawasan ang produksyon ng mga hindi partikular na produkto.Protektahan ang mga reagents na naglalaman ng fluorescent probe mula sa liwanag upang maiwasan ang pagkasira.

5. Mga panloob na kontrol

Isama ang well-characterized, nakumpirma na positibo at negatibong mga kontrol, kasama ang isang walang-template na kontrol sa lahat ng mga reaksyon, at isang multi-point na titrated na trendline para sa mga quantitative na reaksyon.Ang positibong kontrol ay hindi dapat masyadong malakas na ito ay nagdudulot ng panganib sa kontaminasyon.Isama ang positibo at negatibong mga kontrol sa pagkuha kapag nagsasagawa ng nucleic acid extraction.

Inirerekomenda na ang mga malinaw na tagubilin ay mai-post sa bawat isa sa mga lugar upang malaman ng mga gumagamit ang mga tuntunin ng pag-uugali.Ang mga diagnostic lab na nakakatuklas ng napakababang antas ng DNA o RNA sa mga klinikal na sample ay maaaring gustong magpatibay ng karagdagang panukalang panseguridad ng pagkakaroon ng magkahiwalay na air handling system na may bahagyang positibong air pressure sa mga pre-PCR room at bahagyang negatibong air pressure sa post-PCR room.

Panghuli, ang pagbuo ng isang quality assurance (QA) na plano ay nakakatulong.Ang nasabing plano ay dapat magsama ng mga listahan ng mga reagent master stock at working stock, mga panuntunan para sa pag-iimbak ng mga kit at reagents, pag-uulat ng mga resulta ng kontrol, mga programa sa pagsasanay ng staff, mga algorithm sa pag-troubleshoot, at mga remedial na aksyon kung kinakailangan.

6. Bibliograpiya

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kabanata 3: Pag-set up ng qPCR laboratory.Isang gabay na dokumento para sa pagsubok ng mga recreational water gamit ang USEPA qPCR method 1611. Lansing- Michigan State University.

Public Health England, NHS.Mga pamantayan sa UK para sa mga pagsisiyasat sa microbiology: Magandang Pagsasanay sa Laboratory kapag nagsasagawa ng mga molecular amplification assays).Gabay sa Kalidad.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Pag-set up ng PCR laboratory.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Nakagawiang pagpapanatili ng mga centrifuges: paglilinis, pagpapanatili at pagdidisimpekta ng mga centrifuges, rotor at adapter (White paper No. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) para sa molecular based na mga pagsubok na ginagamit sa diagnostic laboratories, Sa: Akyar I, editor.Malawak na spectra ng kontrol sa kalidad.Rijeka, Croatia: Intech;2011: 29–52.