วิธีการตรวจจับระดับโมเลกุลมีความสามารถในการผลิตกรดนิวคลีอิกปริมาณมากผ่านการขยายปริมาณร่องรอยที่พบในตัวอย่างแม้ว่าสิ่งนี้จะเป็นประโยชน์สำหรับการเปิดใช้งานการตรวจจับที่ละเอียดอ่อน แต่ก็ยังแนะนำความเป็นไปได้ของการปนเปื้อนผ่านการแพร่กระจายของละอองขยายในสภาพแวดล้อมของห้องปฏิบัติการเมื่อทำการทดลอง สามารถดำเนินมาตรการเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของรีเอเจนต์ อุปกรณ์ในห้องปฏิบัติการ และพื้นที่ม้านั่ง เนื่องจากการปนเปื้อนดังกล่าวอาจสร้างผลบวกลวง (หรือผลลบลวง)

เพื่อช่วยลดโอกาสในการปนเปื้อน ควรใช้หลักปฏิบัติที่ดีในห้องปฏิบัติการตลอดเวลาโดยเฉพาะอย่างยิ่งควรระมัดระวังในประเด็นต่อไปนี้:

1. การจัดการน้ำยา
2. การจัดพื้นที่ทำงานและอุปกรณ์
3. ใช้และทำความสะอาดคำแนะนำสำหรับพื้นที่โมเลกุลที่กำหนด
4. คำแนะนำทั่วไปทางอณูชีววิทยา
5. การควบคุมภายใน
6. บรรณานุกรม

1. การจัดการน้ำยา

ปั่นแยกหลอดรีเอเจนต์สั้นๆ ก่อนเปิดเพื่อหลีกเลี่ยงการเกิดละอองลอยแบ่งสารรีเอเจนต์เพื่อหลีกเลี่ยงการละลายน้ำแข็งหลายครั้งและการปนเปื้อนของสต็อคหลักติดฉลากและลงวันที่อย่างชัดเจนบนหลอดรีเอเจนต์และปฏิกิริยาทั้งหมด และเก็บรักษาบันทึกของล็อตรีเอเจนต์และหมายเลขแบทช์ที่ใช้ในการทดลองทั้งหมดปิเปตรีเอเจนต์และตัวอย่างทั้งหมดโดยใช้ทิปตัวกรองก่อนซื้อ ขอแนะนำให้ยืนยันกับผู้ผลิตว่าทิปตัวกรองเหมาะสมกับยี่ห้อของปิเปตที่จะใช้

2. การจัดพื้นที่ทำงานและอุปกรณ์

ควรจัดพื้นที่ทำงานเพื่อให้แน่ใจว่าการไหลของงานเกิดขึ้นในทิศทางเดียว ตั้งแต่พื้นที่สะอาด (ก่อน PCR) ไปจนถึงพื้นที่สกปรก (หลัง PCR)ข้อควรระวังทั่วไปต่อไปนี้จะช่วยลดโอกาสในการปนเปื้อนมีห้องที่กำหนดแยกต่างหากหรือในพื้นที่ขั้นต่ำที่แยกจากกัน สำหรับ: การเตรียมมาสเตอร์มิกซ์ การสกัดกรดนิวคลีอิกและการเติมแม่แบบ DNA การขยายและการจัดการผลิตภัณฑ์ที่ขยาย และการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ เช่น เจลอิเล็กโทรโฟรีซิส

ในบางสถานที่ การมีห้อง 4 ห้องแยกจากกันเป็นเรื่องยากตัวเลือกที่เป็นไปได้แต่ไม่พึงปรารถนาคือการเตรียมมาสเตอร์มิกซ์ในพื้นที่กักกัน เช่น ตู้ไหลแบบลามินาร์ในกรณีของการขยาย PCR แบบซ้อน การเตรียมมาสเตอร์มิกซ์สำหรับปฏิกิริยารอบที่สองควรเตรียมในพื้นที่ 'สะอาด' สำหรับการเตรียมมาสเตอร์มิกซ์ แต่การฉีดวัคซีนด้วยผลิตภัณฑ์ PCR หลักควรทำในห้องขยาย และถ้าเป็นไปได้ ในพื้นที่กักกันเฉพาะ (เช่น ตู้ไหลแบบราบเรียบ)

ห้อง/พื้นที่แต่ละห้องต้องการชุดปิเปตที่ติดฉลากชัดเจน ทิปตัวกรอง ชั้นวางหลอด น้ำวน เครื่องหมุนเหวี่ยง (หากเกี่ยวข้อง) ปากกา น้ำยาสำหรับห้องปฏิบัติการทั่วไป เสื้อโค้ทสำหรับห้องปฏิบัติการ และกล่องถุงมือที่จะยังคงอยู่ที่เวิร์กสเตชันของตนต้องล้างมือและเปลี่ยนถุงมือและเสื้อกาวน์เมื่อเคลื่อนย้ายระหว่างพื้นที่ที่กำหนดไม่ควรเคลื่อนย้ายน้ำยาและอุปกรณ์จากบริเวณที่สกปรกไปยังบริเวณที่สะอาดหากเกิดกรณีที่ร้ายแรงซึ่งจำเป็นต้องเคลื่อนย้ายน้ำยาหรือชิ้นส่วนของอุปกรณ์ไปด้านหลัง ก่อนอื่นต้องกำจัดการปนเปื้อนด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 10% ตามด้วยการเช็ดด้วยน้ำปราศจากเชื้อ

บันทึก

สารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 10% จะต้องทำขึ้นใหม่ทุกวันเมื่อใช้สำหรับการปนเปื้อน ควรใช้เวลาสัมผัสอย่างน้อย 10 นาที
อีกทางหนึ่ง สามารถใช้ผลิตภัณฑ์ที่มีจำหน่ายทั่วไปซึ่งผ่านการตรวจสอบแล้วว่าเป็นสารทำลายพื้นผิวที่ทำลาย DNA ได้ หากคำแนะนำด้านความปลอดภัยในท้องถิ่นไม่อนุญาตให้ใช้โซเดียมไฮโปคลอไรต์ หรือหากโซเดียมไฮโปคลอไรต์ไม่เหมาะสำหรับการปนเปื้อนชิ้นส่วนโลหะของอุปกรณ์

ตามหลักการแล้ว พนักงานควรปฏิบัติตามกระแสการทำงานแบบทิศทางเดียว และไม่ออกจากพื้นที่สกปรก (หลัง PCR) กลับไปยังพื้นที่สะอาด (ก่อน PCR) ในวันเดียวกันอย่างไรก็ตาม อาจมีบางครั้งที่สิ่งนี้หลีกเลี่ยงไม่ได้เมื่อเกิดเหตุการณ์ดังกล่าว บุคลากรต้องดูแลล้างมือให้สะอาด เปลี่ยนถุงมือ ใช้เสื้อกาวน์ห้องปฏิบัติการที่กำหนด และไม่นำอุปกรณ์ใด ๆ ที่พวกเขาต้องการนำออกจากห้องอีก เช่น หนังสือห้องปฏิบัติการควรเน้นมาตรการควบคุมดังกล่าวในการฝึกอบรมพนักงานเกี่ยวกับวิธีการระดับโมเลกุล

หลังการใช้งาน ควรทำความสะอาดพื้นที่โต๊ะด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 10% (ตามด้วยน้ำปราศจากเชื้อเพื่อขจัดสารฟอกขาวที่ตกค้าง) เอทานอล 70% หรือสารปนเปื้อนทำลายดีเอ็นเอที่มีจำหน่ายในท้องตลาดที่ผ่านการตรวจสอบแล้วตามหลักการแล้ว ควรติดตั้งหลอดอุลตร้าไวโอเลต (UV) เพื่อเปิดใช้งานการปนเปื้อนโดยการฉายรังสีอย่างไรก็ตาม ควรจำกัดการใช้หลอด UV ในพื้นที่ทำงานแบบปิด เช่น ตู้เซฟ เพื่อจำกัดการสัมผัสรังสี UV ของเจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการโปรดปฏิบัติตามคำแนะนำของผู้ผลิตสำหรับการดูแล หลอด UV การระบายอากาศ และการทำความสะอาด เพื่อให้แน่ใจว่าหลอดยังคงมีประสิทธิภาพ

หากใช้เอธานอล 70% แทนโซเดียมไฮโปคลอไรต์ จำเป็นต้องฉายรังสีด้วยแสงยูวีเพื่อขจัดการปนเปื้อนให้เสร็จสิ้น
ห้ามทำความสะอาดน้ำวนและเครื่องหมุนเหวี่ยงด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ให้เช็ดด้วยเอทานอล 70% และสัมผัสกับแสง UV หรือใช้สารปนเปื้อนที่ทำลาย DNA เชิงพาณิชย์แทนสำหรับการรั่วไหล ให้ตรวจสอบกับผู้ผลิตเพื่อขอคำแนะนำในการทำความสะอาดเพิ่มเติมหากคำแนะนำของผู้ผลิตอนุญาต ควรฆ่าเชื้อปิเปตเป็นประจำด้วยหม้อนึ่งความดันหากปิเปตไม่สามารถนึ่งฆ่าเชื้อได้ ควรทำความสะอาดปิเปตด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 10% (ตามด้วยการเช็ดด้วยน้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อ) หรือด้วยสารปนเปื้อนที่ทำลาย DNA เชิงพาณิชย์ตามด้วยการสัมผัสรังสียูวี

การทำความสะอาดด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ที่มีเปอร์เซ็นต์สูงอาจทำให้พลาสติกและโลหะของปิเปตเสียหายได้ในที่สุด หากทำเป็นประจำตรวจสอบคำแนะนำจากผู้ผลิตก่อนอุปกรณ์ทั้งหมดจำเป็นต้องได้รับการสอบเทียบอย่างสม่ำเสมอตามกำหนดเวลาที่ผู้ผลิตแนะนำบุคคลที่ได้รับมอบหมายควรรับผิดชอบในการตรวจสอบให้แน่ใจว่าตารางการสอบเทียบได้รับการปฏิบัติตาม มีการบำรุงรักษาบันทึกรายละเอียด และฉลากบริการแสดงบนอุปกรณ์อย่างชัดเจน

3. ใช้และทำความสะอาดคำแนะนำสำหรับพื้นที่โมเลกุลที่กำหนด

Pre-PCR: การเตรียมรีเอเจนต์แบบแบ่งส่วน / การเตรียมมาสเตอร์มิกซ์: ควรเป็นพื้นที่ที่สะอาดที่สุดในบรรดาพื้นที่ทั้งหมดที่ใช้ในการเตรียมการทดลองระดับโมเลกุล และควรเป็นตู้ไหลแบบราบเรียบที่กำหนดพร้อมกับแสงยูวีต้องไม่จัดการตัวอย่าง กรดนิวคลีอิกที่สกัดออกมา และผลิตภัณฑ์ PCR ที่ขยายแล้วในบริเวณนี้ควรเก็บน้ำยาขยายแอมพลิฟายเออร์ไว้ในช่องแช่แข็ง (หรือตู้เย็น ตามคำแนะนำของผู้ผลิต) ในพื้นที่เดียวกัน ถัดจากตู้ laminar flow หรือพื้นที่ pre-PCRควรเปลี่ยนถุงมือทุกครั้งเมื่อเข้าสู่บริเวณ pre-PCR หรือตู้ไหลแบบลามินาร์

ควรทำความสะอาดบริเวณ pre-PCR หรือตู้ laminar flow ก่อนและหลังการใช้งานดังต่อไปนี้: เช็ดสิ่งของทั้งหมดในตู้ เช่น ปิเปต กล่องทิป น้ำวน เครื่องหมุนเหวี่ยง ชั้นวางหลอด ปากกา ฯลฯ ด้วยเอทานอล 70% หรือ a สารปนเปื้อนที่ทำลาย DNA ในเชิงพาณิชย์และปล่อยให้แห้งในกรณีของพื้นที่ทำงานแบบปิด เช่น ตู้ลามิเนต ให้เปิดฮูดกับแสง UV เป็นเวลา 30 นาที

บันทึก

อย่าให้รีเอเจนต์สัมผัสกับแสงยูวีให้ย้ายเข้าไปในตู้เมื่อสะอาดแล้วเท่านั้นหากดำเนินการ PCR การถอดความแบบย้อนกลับ การเช็ดพื้นผิวและอุปกรณ์ด้วยสารละลายที่สลาย RNases เมื่อสัมผัสอาจเป็นประโยชน์สิ่งนี้อาจช่วยหลีกเลี่ยงผลลบลวงจากการย่อยสลายของเอ็นไซม์ของ RNAหลังการปนเปื้อนและก่อนเตรียมมาสเตอร์มิกซ์ ควรเปลี่ยนถุงมืออีกครั้ง จากนั้นตู้จะพร้อมใช้งาน

ก่อน PCR: การสกัดกรดนิวคลีอิก/การเติมแม่แบบ:

กรดนิวคลีอิกต้องถูกสกัดและจัดการในพื้นที่ที่กำหนดที่สอง โดยใช้ชุดปิเปต ทิปตัวกรอง ชั้นวางหลอด ถุงมือสด เสื้อโค้ทแล็บ และอุปกรณ์อื่นๆ พื้นที่นี้ยังมีไว้สำหรับเพิ่มแม่แบบ ตัวควบคุม และเส้นแนวโน้มให้กับ หลอดหรือแผ่นมาสเตอร์มิกซ์เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของตัวอย่างกรดนิวคลีอิกที่สกัดออกมาซึ่งกำลังวิเคราะห์ ขอแนะนำให้เปลี่ยนถุงมือก่อนจัดการกับการควบคุมหรือมาตรฐานในเชิงบวก และใช้ปิเปตชุดแยกต่างหากรีเอเจนต์ PCR และผลิตภัณฑ์ขยายต้องไม่ถูกปิเปตในบริเวณนี้ควรเก็บตัวอย่างไว้ในตู้เย็นหรือช่องแช่แข็งที่กำหนดไว้ในบริเวณเดียวกันควรทำความสะอาดพื้นที่ทำงานตัวอย่างในลักษณะเดียวกับพื้นที่มาสเตอร์มิกซ์

Post-PCR: การขยายและการจัดการผลิตภัณฑ์ที่ขยาย

พื้นที่ที่กำหนดนี้มีไว้สำหรับกระบวนการหลังการขยายสัญญาณและควรแยกออกจากพื้นที่ก่อน PCRโดยปกติจะประกอบด้วยเทอร์โมไซเกอร์และแพลตฟอร์มแบบเรียลไทม์ และควรมีตู้ไหลแบบลามินาร์สำหรับเพิ่มผลิตภัณฑ์ PCR รอบที่ 1 ลงในปฏิกิริยารอบที่ 2 หากมีการดำเนินการ PCR แบบซ้อนห้ามใช้น้ำยา PCR และกรดนิวคลีอิกที่สกัดในบริเวณนี้ เนื่องจากมีความเสี่ยงสูงที่จะเกิดการปนเปื้อนบริเวณนี้ควรมีชุดถุงมือ เสื้อกาวน์ ชั้นวางจานและท่อ ปิเปต ทิปตัวกรอง ถังและอุปกรณ์อื่นๆ แยกต่างหากหลอดต้องปั่นแยกก่อนเปิดควรทำความสะอาดพื้นที่ทำงานตัวอย่างในลักษณะเดียวกับพื้นที่มาสเตอร์มิกซ์

Post-PCR: การวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์

ห้องนี้มีไว้สำหรับอุปกรณ์ตรวจจับผลิตภัณฑ์ เช่น แท็งก์เจลอิเล็กโทรโฟรีซิส ชุดพลังงาน ทรานสลูมิเนเตอร์ UV และระบบเอกสารเกี่ยวกับเจลบริเวณนี้ควรมีชุดถุงมือ เสื้อกาวน์ ชั้นวางจานและท่อ ปิเปต ทิปตัวกรอง ถังและอุปกรณ์อื่นๆ แยกจากกันห้ามนำรีเอเจนต์อื่นเข้ามาในบริเวณนี้ ยกเว้น Loading Dye, Molecular Marker และ agarose Gel และส่วนประกอบบัฟเฟอร์ควรทำความสะอาดพื้นที่ทำงานตัวอย่างในลักษณะเดียวกับพื้นที่มาสเตอร์มิกซ์

โน๊ตสำคัญ

ตามหลักการแล้ว ไม่ควรเข้าห้อง pre-PCR ในวันเดียวกัน หากงานได้ดำเนินการไปแล้วในห้องหลัง PCRหากไม่สามารถหลีกเลี่ยงได้อย่างสมบูรณ์ ตรวจสอบให้แน่ใจว่าได้ล้างมือให้สะอาดแล้วและสวมเสื้อกาวน์สำหรับห้องปฏิบัติการเฉพาะในห้องต้องไม่นำหนังสือและเอกสารของห้องปฏิบัติการเข้าไปในห้อง pre-PCR หากมีการใช้ในห้องหลัง PCR;หากจำเป็น ให้พิมพ์โปรโตคอล/รหัสตัวอย่างซ้ำ ฯลฯ

4. คำแนะนำทั่วไปทางอณูชีววิทยา

ใช้ถุงมือแบบไม่มีแป้งเพื่อหลีกเลี่ยงการยับยั้งการทดสอบเทคนิคการปิเปตที่ถูกต้องเป็นสิ่งสำคัญยิ่งในการลดการปนเปื้อนการปิเปตที่ไม่ถูกต้องอาจส่งผลให้เกิดการกระเซ็นเมื่อจ่ายของเหลวและเกิดละอองลอยแนวทางปฏิบัติที่ดีสำหรับการปิเปตที่ถูกต้องสามารถดูได้ที่ลิงก์ต่อไปนี้: คู่มือ Gilson เกี่ยวกับการปิเปต วิดีโอเทคนิคการปิเปตของ Anachem หลอด Centrifuge ก่อนเปิด และเปิดอย่างระมัดระวังเพื่อหลีกเลี่ยงการกระเด็นปิดท่อทันทีหลังใช้งานเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อน

เมื่อทำปฏิกิริยาหลายปฏิกิริยา ให้เตรียมส่วนผสมหลักหนึ่งรายการที่มีตัวทำปฏิกิริยาทั่วไป (เช่น น้ำ dNTPs บัฟเฟอร์ ไพรเมอร์ และเอนไซม์) เพื่อลดจำนวนของการถ่ายโอนตัวทำปฏิกิริยาและลดการคุกคามของการปนเปื้อนขอแนะนำให้ตั้งค่ามาสเตอร์มิกซ์บนน้ำแข็งหรือบล็อกเย็นการใช้เอนไซม์ Hot Start อาจช่วยลดการผลิตผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงได้ปกป้องรีเอเจนต์ที่มีโพรบเรืองแสงจากแสงเพื่อหลีกเลี่ยงการเสื่อมสภาพ

5. การควบคุมภายใน

รวมการควบคุมเชิงบวกและเชิงลบที่มีลักษณะเฉพาะที่ดี ได้รับการยืนยัน พร้อมกับการควบคุมแบบไม่มีเทมเพลตในทุกปฏิกิริยา และเส้นแนวโน้มการไทเทรตแบบหลายจุดสำหรับปฏิกิริยาเชิงปริมาณการควบคุมเชิงบวกไม่ควรรุนแรงจนเสี่ยงต่อการปนเปื้อนรวมการควบคุมการสกัดในเชิงบวกและเชิงลบเมื่อทำการสกัดกรดนิวคลีอิก

ขอแนะนำให้โพสต์คำแนะนำที่ชัดเจนในแต่ละพื้นที่เพื่อให้ผู้ใช้ทราบถึงกฎการปฏิบัติห้องปฏิบัติการวินิจฉัยที่ตรวจพบระดับ DNA หรือ RNA ที่ต่ำมากในตัวอย่างทางคลินิกอาจต้องการใช้มาตรการรักษาความปลอดภัยเพิ่มเติมของการมีระบบจัดการอากาศแยกต่างหากที่มีความดันอากาศเป็นบวกเล็กน้อยในห้องก่อน PCR และความดันอากาศเป็นลบเล็กน้อยในห้องหลัง PCR

ประการสุดท้าย การพัฒนาแผนการประกันคุณภาพ (QA) นั้นมีประโยชน์แผนดังกล่าวควรรวมถึงรายการสต็อกรีเอเจนต์หลักและสต็อกการทำงาน กฎสำหรับการจัดเก็บชุดอุปกรณ์และรีเอเจนต์ การรายงานผลการควบคุม โปรแกรมการฝึกอบรมพนักงาน อัลกอริธึมการแก้ไขปัญหา และการดำเนินการแก้ไขเมื่อจำเป็น

6. บรรณานุกรม

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. บทที่ 3: การตั้งค่าห้องปฏิบัติการ qPCRเอกสารคำแนะนำสำหรับการทดสอบน้ำเพื่อการพักผ่อนหย่อนใจโดยใช้วิธี USEPA qPCR 1611 Lansing-Michigan State University

สาธารณสุขอังกฤษ, NHSมาตรฐานของสหราชอาณาจักรสำหรับการตรวจสอบทางจุลชีววิทยา: แนวปฏิบัติที่ดีในห้องปฏิบัติการเมื่อทำการทดสอบการขยายโมเลกุล)คำแนะนำด้านคุณภาพ2013;4(4):1–15.

Mifflin T. การจัดตั้งห้องปฏิบัติการ PCRโปรโตคอล Cold Spring Harb2550;7.

Schroeder S 2013. การบำรุงรักษาเครื่องหมุนเหวี่ยงเป็นประจำ: การทำความสะอาด การบำรุงรักษา และการฆ่าเชื้อเครื่องหมุนเหวี่ยง โรเตอร์ และอะแดปเตอร์ (เอกสารไวท์เปเปอร์ ฉบับที่ 14)ฮัมบูร์ก: เอพเพนดอร์ฟ;2556.

เวียนา อาร์วี วาลลิส ซีแอลGood Clinical Laboratory Practice (GCLP) สำหรับการทดสอบระดับโมเลกุลที่ใช้ในห้องปฏิบัติการวินิจฉัย ใน: Akyar I บรรณาธิการสเปกตรัมกว้างของการควบคุมคุณภาพริเยกา โครเอเชีย: Intech;2554: 29–52.