Усулҳои муайянкунии молекулавӣ қобилияти тавлиди миқдори зиёди кислотаи нуклеинро тавассути тақвияти миқдори микроэлементҳо дар намунаҳо доранд.Гарчанде ки ин барои имкон додани муайянкунии ҳассос муфид аст, он инчунин имкони ифлосшавӣ тавассути паҳншавии аэрозолҳои пурқувватро дар муҳити лабораторӣ фароҳам меорад.Ҳангоми гузаронидани таҷрибаҳо барои пешгирӣ кардани ифлосшавии реагентҳо, таҷҳизоти лабораторӣ ва фазои курсӣ чораҳо андешидан мумкин аст, зеро чунин ифлосшавӣ метавонад натиҷаҳои бардурӯғи мусбат (ё бардурӯғ-манфӣ) ба вуҷуд орад.

Барои кам кардани эҳтимолияти ифлосшавӣ, бояд ҳамеша таҷрибаи хуби лабораторӣ истифода шавад.Махсусан, дар мавриди нуктаҳои зерин бояд чораҳои эҳтиётӣ андешида шаванд:

1. Муомилоти реагентҳо
2. Ташкили чои кор ва тачхизот
3. Маслиҳат оид ба истифода ва тозакунӣ барои фазои молекулавии таъиншуда
4. Маслиҳати умумии биологияи молекулавӣ
5. Назорати дохилӣ
6. Библиография

1. Муомилоти реагентҳо

Пеш аз кушодан қубурҳои реагентро ба таври мухтасар центрифуга кунед, то аз тавлиди аэрозолҳо канорагирӣ кунед.Аликвот реагентҳо барои пешгирӣ кардани яхбандии сершумор ва ифлосшавии захираҳои асосӣ.Ҳама найҳои реактив ва реаксияро аниқ нишонгузорӣ кунед ва санаи таърихи худро гузоред ва сабтҳои лот ва рақамҳои партияи дар ҳама таҷрибаҳо истифодашударо нигоҳ доред.Ҳама реактивҳо ва намунаҳоро бо истифода аз маслиҳатҳои филтр пипетка кунед.Пеш аз харид кардан, тавсия дода мешавад, ки бо истеҳсолкунанда тасдиқ кунед, ки маслиҳатҳои филтр ба бренди пипеткаи истифодашаванда мувофиқат мекунанд.

2. Ташкили чои кор ва тачхизот

Ҷойҳои корӣ бояд ташкил карда шаванд, ки ҷараёни кор дар як самт, аз минтақаҳои тоза (пеш аз PCR) то минтақаҳои ифлос (пас аз PCR) сурат гирад.Тадбирҳои умумии зерин барои кам кардани эҳтимолияти ифлосшавӣ кӯмак хоҳанд кард.Барои: тайёр кардани миксер, истихроҷи кислотаи нуклеинӣ ва илова кардани қолаби ДНК, амплификация ва коркарди маҳсулоти пурқувватшуда ва таҳлили маҳсулот, масалан, электрофорези гел, утоқҳои ҷудогона ё ҳадди аққал минтақаҳои аз ҷиҳати ҷисмонӣ ҷудогона дошта бошед.

Дар баъзе ҷойҳо, доштани 4 ҳуҷраи алоҳида душвор аст.Варианти имконпазир, вале камтар матлуб ин аст, ки тайёр кардани мастермикс дар минтақаи нигоҳдорӣ, масалан, шкафи ҷараёни ламинарӣ.Дар ҳолати амплификацияи лонавии ПЗР, омода кардани мастермикс барои реаксияи даври дуюм бояд дар минтақаи "тоза" барои омода кардани мастермикс омода карда шавад, аммо эмкунӣ бо маҳсулоти ибтидоии ПТР бояд дар утоқи амплификация анҷом дода шавад ва агар имконпазир бошад. дар як минтақаи махсусгардонидашуда (масалан, кабинети ҷараёни ламинарӣ).

Ҳар як ҳуҷра/минтақа ба маҷмӯи алоҳидаи пипеткаҳои равшан нишондодашуда, маслиҳатҳои филтрҳо, рафҳои қубурҳо, гирдобиҳо, центрифугаҳо (агар зарур бошад), қаламҳо, реагентҳои умумии лабораторӣ, куртаҳои лабораторӣ ва қуттиҳои дастпӯшакҳо ниёз доранд, ки дар истгоҳҳои кории худ боқӣ хоҳанд монд.Ҳангоми ҳаракат дар байни ҷойҳои таъиншуда дастҳо бояд шуста шаванд ва дастпӯшҳо ва куртаҳои лабораторӣ иваз карда шаванд.Реактивхо ва тачхизот набояд аз чои ифлос ба майдони тоза кучонда шаванд.Агар ҳолати фавқулоддае ба миён ояд, ки реагент ё порчаи таҷҳизот бояд ба ақиб кӯчонида шавад, он бояд аввал бо гипохлорити натрийи 10% безарар карда шавад ва пас аз он бо оби стерилизатсия пок карда шавад.

Шарҳ

Маҳлули гипохлорити натрийи 10% бояд ҳар рӯз тару тоза омода карда шавад.Ҳангоми истифода барои безараргардонӣ, ҳадди аққали тамос бояд 10 дақиқа риоя карда шавад.
Ба таври алтернативӣ, маҳсулоти дар тиҷорат дастрас буда, ки ҳамчун деконтаминантҳои сатҳи ДНК-ро вайронкунанда тасдиқ шудаанд, метавонанд истифода шаванд, агар тавсияҳои бехатарии маҳаллӣ истифодаи гипохлориди натрийро иҷозат надиҳанд ё гипохлориди натрий барои безараргардонии қисмҳои металлии таҷҳизот мувофиқ набошад.

Идеалӣ, кормандон бояд ба одоби якҷонибаи ҷараёни кор риоя кунанд ва дар ҳамон рӯз аз минтақаҳои ифлос (пас аз PCR) ба минтақаҳои тоза (пеш аз PCR) барнагарданд.Бо вуҷуди ин, ҳолатҳое мешаванд, ки ин ногузир аст.Ҳангоми ба миён омадани чунин ҳолат, кормандон бояд эҳтиёт шаванд, ки дастҳоро бодиққат бишӯянд, дастпӯшакҳоро иваз кунанд, либоси лаборатории таъиншударо истифода баранд ва ҳеҷ гуна таҷҳизотеро, ки мехоҳанд аз ҳуҷра берун кунанд, ҷорӣ накунанд, ба монанди китобҳои лабораторӣ.Чунин тадбирҳои мубориза бояд дар омӯзиши кормандон оид ба усулҳои молекулавӣ таъкид карда шаванд.

Пас аз истифода, ҷойҳои нишастгоҳ бояд бо 10% гипохлориди натрий (пас аз оби стерилизатсияшуда барои тоза кардани шустагар боқимонда), 70% этанол ё деконтаминантҳои тасдиқшудаи дар тиҷорат дастраси нобудкунандаи ДНК тоза карда шаванд.Идеалӣ, лампаҳои ултрабунафш (УВ) бояд насб карда шаванд, то безараргардонӣ тавассути шуоъ имкон диҳанд.Бо вуҷуди ин, истифодаи лампаҳои ултрабунафш бояд дар ҷойҳои кории пӯшида, масалан, шкафҳои бехатарӣ, бо мақсади маҳдуд кардани таъсири ултрабунафш ба кормандони лаборатория маҳдуд карда шавад.Лутфан дастурҳои истеҳсолкунандаро оид ба нигоҳубин, вентилятсия ва тоза кардани лампаҳои ултрабунафш риоя кунед, то ки лампаҳо самаранок боқӣ монанд.

Агар ба ҷои гипохлориди натрий 70% этанол истифода шавад, барои анҷом додани безараргардонӣ шуоъ бо нурҳои ултрабунафш лозим мешавад.
Гирдобро бо гипохлориди натрий тоза накунед ва центрифуга кунед;ба ҷои он, бо 70% этанол пок кунед ва ба нури ултрабунафш гузоред ё деконтаминантҳои тиҷоратии ДНК-ро вайрон кунед.Барои резиши он, барои маслиҳати минбаъдаи тозакунӣ аз истеҳсолкунанда муроҷиат кунед.Агар дастурҳои истеҳсолкунанда иҷозат диҳанд, пипеткаҳо бояд мунтазам тавассути автоклав стерилизатсия карда шаванд.Агар пипеткаҳоро автоклав кардан ғайриимкон бошад, бояд онҳоро бо гипохлорити натрийи 10% (пас аз он бо оби стерилизатсияи ҳаматарафа пок кунед) ё бо деконтаминантҳои тиҷоратӣ нобудкунандаи ДНК ва пас аз таъсири ултрабунафш тоза кунед.

Тоза кардан бо гипохлорити натрийи баланд дар ниҳоят метавонад ба пластикаи пипеткаҳо ва металлҳо зарар расонад, агар мунтазам анҷом дода шавад;аввал тавсияҳои истеҳсолкунандаро тафтиш кунед.Ҳама таҷҳизот бояд мувофиқи ҷадвали тавсиякардаи истеҳсолкунанда мунтазам калибровка карда шаванд.Шахси таъиншуда бояд масъул бошад, ки ҷадвали калибрченкунӣ риоя карда шавад, сабтҳои муфассал нигоҳ дошта шаванд ва нишонҳои хидматрасонӣ дар таҷҳизот равшан нишон дода шаванд.

3. Маслиҳат оид ба истифода ва тозакунӣ барои фазои молекулавии таъиншуда

Пеш аз PCR: Аликвотҳои реактивӣ / омодасозии мастермикс: Ин бояд тозатарин ҳама ҷойҳое бошад, ки барои омодасозии таҷрибаҳои молекулавӣ истифода мешавад ва идеалӣ бояд як шкафи таъиншудаи ламинарӣ бошад, ки бо нури ултрабунафш муҷаҳҳаз шудааст.Намунаҳо, кислотаи нуклеинҳои истихроҷшуда ва маҳсулоти пурқувватшудаи ПТР набояд дар ин минтақа коркард карда шаванд.Реагентҳои амплификация бояд дар яхдон (ё яхдон, мувофиқи тавсияҳои истеҳсолкунанда) дар ҳамон фазои таъиншуда, беҳтарин дар паҳлӯи кабинети ҷараёни ламинарӣ ё минтақаи пеш аз PCR нигоҳ дошта шаванд.Дастпӯшакҳо бояд ҳар дафъа ҳангоми ворид шудан ба минтақаи пеш аз PCR ё кабинети ҷараёни ламинарӣ иваз карда шаванд.

Минтақаи пеш аз PCR ё шкафи ҷараёни ламинарӣ бояд пеш аз истифода ва баъд аз истифода ба таври зерин тоза карда шавад: Ҳама ашёи дар дохили кабинет бударо, масалан пипеткаҳо, қуттиҳои нӯгиҳо, гирдоб, центрифуга, рафҳои қубурҳо, қаламҳо ва ғайраро бо 70% этанол ё Деконтаминантҳои тиҷоратии ДНК-ро вайрон мекунанд ва хушк карданро иҷозат диҳед.Дар ҳолати майдони кори пӯшида, масалан, шкафи ҷараёни ламинарӣ, капотро дар давоми 30 дақиқа дар зери нури ултрабунафш қарор диҳед.

Шарҳ

Реагентҳоро ба нурҳои ултрабунафш нагузоред;онҳоро танҳо пас аз тоза шудан ба кабинет интиқол диҳед.Агар ПТР транскрипсияи баръакс иҷро карда шавад, он метавонад инчунин тоза кардани сатҳҳо ва таҷҳизот бо маҳлуле муфид бошад, ки RNases-ро ҳангоми тамос вайрон мекунад.Ин метавонад барои пешгирӣ кардани натиҷаҳои манфии бардурӯғ аз таназзули ферментҳои РНК кӯмак кунад.Пас аз безараргардонӣ ва пеш аз тайёр кардани омехта дастпӯшакҳо бояд бори дигар иваз карда шаванд ва пас аз он шкаф барои истифода омода аст.

Пеш аз PCR: истихроҷи кислотаи нуклеинӣ/Иловаи шаблон:

Кислотаи нуклеинӣ бояд дар ҷои дуюми таъиншуда бо истифода аз маҷмӯи алоҳидаи пипеткаҳо, нӯги филтрҳо, рафҳои қубурҳо, дастпӯшҳои тару тоза, куртаҳои лабораторӣ ва таҷҳизоти дигар истихроҷ ва коркард карда шавад. қубурҳо ё плитаҳои mastermix.Барои пешгирӣ кардани ифлосшавии намунаҳои кислотаи нуклеинӣ, ки мавриди таҳлил қарор доранд, тавсия дода мешавад, ки пеш аз коркарди назорати мусбӣ ё стандартҳо дастпӯшакҳоро иваз кунед ва маҷмӯи алоҳидаи пипеткаҳоро истифода баред.Дар ин минтақа реагентҳои ПТР ва маҳсулоти пурқувватшуда набояд пипета карда шаванд.Намунаҳо бояд дар яхдон ё яхдонҳои таъиншуда дар ҳамон минтақа нигоҳ дошта шаванд.Майдони кории намуна бояд ҳамон тавре ки фазои мастермикс тоза карда шавад.

Post-PCR: Амплификация ва коркарди маҳсулоти пурқувватшуда

Ин фазои таъиншуда барои равандҳои пас аз амплификация аст ва бояд аз минтақаҳои пеш аз PCR аз ҷиҳати ҷисмонӣ ҷудо бошад.Он одатан термосиклҳо ва платформаҳои вақти воқеӣ дорад ва идеалӣ бояд як шкафи ҷараёни ламинарӣ барои илова кардани маҳсулоти даври 1 ПТР ба реаксияи даври 2 дошта бошад, агар PCR лона анҷом дода шавад.Дар ин минтақа реагентҳои ПТР ва кислотаи нуклеинӣ истихроҷ карда намешаванд, зеро хатари олудашавӣ зиёд аст.Ин майдон бояд маҷмӯи алоҳидаи дастпӯшакҳо, куртаҳои лабораторӣ, стеллажҳо ва қубурҳо, пипеткаҳо, маслиҳатҳои филтрҳо, зарфҳо ва дигар таҷҳизот дошта бошад.Пеш аз кушодан қубурҳо бояд центрифуга карда шаванд.Майдони кории намуна бояд ҳамон тавре ки фазои мастермикс тоза карда шавад.

Post-PCR: Таҳлили маҳсулот

Ин ҳуҷра барои таҷҳизоти муайянкунии маҳсулот, масалан, зарфҳои электрофорези гелӣ, бастаҳои барқ, трансиллюминатори ултрабунафш ва системаи ҳуҷҷатгузории гел мебошад.Ин майдон бояд маҷмӯи алоҳидаи дастпӯшакҳо, куртаҳои лабораторӣ, рафҳои табақ ва қубурҳо, пипеткаҳо, маслиҳатҳои филтрҳо, зарфҳо ва дигар таҷҳизот дошта бошад.Ба ин минтақа дигар реагентҳоро ворид кардан мумкин нест, ба истиснои рангҳои боркунӣ, маркери молекулавӣ ва гели агарозӣ ва ҷузъҳои буферӣ.Майдони кории намуна бояд ҳамон тавре ки фазои мастермикс тоза карда шавад.

Қайдҳои муҳим

Идеалӣ, ба утоқҳои пеш аз PCR набояд дар ҳамон рӯз ворид карда шаванд, агар кор дар утоқҳои пас аз PCR анҷом дода шуда бошад.Агар ин комилан ногузир бошад, боварӣ ҳосил кунед, ки дастҳо аввал бодиққат шуста мешаванд ва дар ҳуҷраҳо куртаҳои махсуси лабораторӣ пӯшида мешаванд.Китобҳои лабораторӣ ва ҳуҷҷатҳо набояд ба утоқҳои пеш аз ПТР бурда шаванд, агар онҳо дар утоқҳои пас аз ПТР истифода шуда бошанд;агар лозим бошад, нусхаҳои нусхаи чопи протоколҳо/идентификаторҳои намунавӣ ва ғайраро гиред.

4. Маслиҳати умумии биологияи молекулавӣ

Барои пешгирӣ кардани ҷилавгирӣ аз таҳлил дастпӯшакҳои бе хокаро истифода баред.Техникаи дурусти пиптинг барои кам кардани ифлосшавӣ муҳим аст.Пиптинги нодуруст метавонад ба пошидани пошидани моеъҳо ва эҷоди аэрозолҳо оварда расонад.Таҷрибаи хуби пиптинги дурустро дар истиноди зерин пайдо кардан мумкин аст: Дастури Гилсон оид ба пиптинг, видеоҳои техникаи пиптинги Анахем, Қубурҳоро пеш аз кушодан центрифуга кунед ва онҳоро бодиққат кушоед, то пошидан пешгирӣ карда шавад.Пас аз истифода қубурҳоро фавран пӯшед, то воридшавии ифлоскунандаҳоро пешгирӣ кунед.

Ҳангоми анҷом додани реаксияҳои сершумор, як мастермиксро бо реагентҳои умумӣ (масалан, об, dNTPs, буфер, праймерҳо ва фермент) омода кунед, то шумораи интиқоли реагентҳоро ба ҳадди ақалл кам кунад ва хатари ифлосшавиро кам кунад.Тавсия дода мешавад, ки мастермиксро дар ях ё блоки хунук насб кунед.Истифодаи ферментҳои Hot Start метавонад ба кам кардани истеҳсоли маҳсулоти ғайримуқаррарӣ мусоидат кунад.Реагентҳои дорои зондҳои флуоресцентиро аз рӯшноӣ муҳофизат кунед, то вайроншавиро пешгирӣ кунед.

5. Назорати дохилӣ

Назорати хуб тавсифшуда, тасдиқшудаи мусбӣ ва манфиро дар якҷоягӣ бо назорати бе шаблон дар ҳама реаксияҳо ва хати тамоюли титршудаи бисёрнуқта барои реаксияҳои миқдорӣ дохил кунед.Назорати мусбӣ набояд он қадар қавӣ бошад, ки хатари ифлосшавӣ дорад.Ҳангоми иҷрои истихроҷи кислотаи нуклеинӣ назорати истихроҷи мусбат ва манфиро дохил кунед.

Тавсия дода мешавад, ки дар ҳар як минтақа дастурҳои равшан овехта шаванд, то корбарон аз қоидаҳои рафтор огоҳ бошанд.Лабораторияҳои ташхисӣ, ки сатҳи хеле пасти ДНК ё РНК-ро дар намунаҳои клиникӣ муайян мекунанд, метавонанд мехоҳанд чораи иловагии амниятро қабул кунанд, ки системаҳои алоҳидаи коркарди ҳаво бо фишори каме мусбати ҳаво дар утоқҳои пеш аз PCR ва фишори ҳаво каме манфии утоқҳои пас аз PCR доранд.

Ниҳоят, таҳияи нақшаи кафолати сифат (QA) муфид аст.Чунин нақша бояд рӯйхати захираҳои асосии реактивҳо ва захираҳои корӣ, қоидаҳои нигоҳдории маҷмӯаҳо ва реактивҳо, гузориш додани натиҷаҳои назорат, барномаҳои омӯзиши кормандон, алгоритмҳои бартараф кардани мушкилот ва чораҳои ислоҳиро дар ҳолати зарурӣ дар бар гирад.

6. Библиография

Аслан А, Кинзелман Ҷ, Дрелин Е, Ананьева Т, Лавандер Ҷ. Боби 3: Ташкили лабораторияи qPCR.Ҳуҷҷати роҳнамо барои санҷиши обҳои фароғатӣ бо истифода аз усули USEPA qPCR 1611. Донишгоҳи давлатии Лансинг-Мичиган.

Тандурустии ҷамъиятии Англия, NHS.Стандартҳои Британияи Кабир оид ба таҳқиқоти микробиология: Таҷрибаи хуби лабораторӣ ҳангоми гузаронидани таҳлилҳои амплификацияи молекулавӣ).Роҳнамои сифат.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Ташкили лабораторияи PCR.Protoc Harb баҳори сард.2007; 7.

Schroeder S 2013. Нигоҳдории мунтазами центрифугаҳо: тозакунӣ, нигоҳдорӣ ва безараргардонии сентрифугаҳо, роторҳо ва адаптерҳо (Коғази сафед № 14).Гамбург: Эпендорф;2013.

Viana RV, Wallis CL.Амалияи хуби лаборатории клиникӣ (GCLP) барои озмоишҳои молекулавӣ, ки дар лабораторияҳои ташхис истифода мешаванд, дар: Акяр I, муҳаррир.доираи васеи назорати сифат.Риека, Хорватия: Intech;2011: 29–52.