Mbinu za kugundua molekuli zina uwezo wa kutoa kiasi kikubwa cha asidi nucleic kupitia upanuzi wa kiasi cha ufuatiliaji kinachopatikana katika sampuli.Ingawa hii ni ya manufaa kwa kuwezesha ugunduzi nyeti, pia inaleta uwezekano wa uchafuzi kupitia uenezaji wa erosoli za ukuzaji katika mazingira ya maabara.Wakati wa kufanya majaribio, hatua zinaweza kuchukuliwa ili kuzuia uchafuzi wa vitendanishi, vifaa vya maabara na nafasi ya benchi, kwani uchafuzi huo unaweza kutoa matokeo chanya (au ya uwongo-hasi).

Ili kusaidia kupunguza uwezekano wa uchafuzi, Mazoezi Bora ya Maabara yanapaswa kutekelezwa kila wakati.Hasa, tahadhari zinapaswa kuchukuliwa kuhusu pointi zifuatazo:

1. Kushughulikia vitendanishi
2. Shirika la nafasi ya kazi na vifaa
3. Tumia na kusafisha ushauri kwa nafasi ya molekuli iliyochaguliwa
4. Ushauri wa jumla wa biolojia ya molekuli
5. Udhibiti wa ndani
6. Bibliografia

1. Kushughulikia vitendanishi

Kwa ufupi mirija ya vitendanishi vya centrifuge kabla ya kufunguka ili kuzuia kutolewa kwa erosoli.Vitendanishi vya Aliquot ili kuzuia kuganda kwa wingi na uchafuzi wa hifadhi kuu.Weka bayana lebo na tarehe mirija yote ya vitendanishi na athari na udumishe kumbukumbu za kitendanishi na nambari za bechi zinazotumika katika majaribio yote.Pipette vitendanishi vyote na sampuli kwa kutumia vidokezo vya chujio.Kabla ya kununua, ni vyema kuthibitisha na mtengenezaji kwamba vidokezo vya chujio vinafaa brand ya pipette kutumika.

2. Shirika la nafasi ya kazi na vifaa

Nafasi ya kazi inapaswa kupangwa ili kuhakikisha kwamba mtiririko wa kazi hutokea kwa mwelekeo mmoja, kutoka kwa maeneo safi (kabla ya PCR) hadi maeneo machafu (baada ya PCR).Tahadhari zifuatazo za jumla zitasaidia kupunguza uwezekano wa kuambukizwa.Kuwa na vyumba tofauti vilivyotengwa, au kwa angalau maeneo tofauti ya kimwili, kwa ajili ya: maandalizi ya mchanganyiko mkuu, uchimbaji wa asidi ya nukleiki na kuongeza kiolezo cha DNA, ukuzaji na utunzaji wa bidhaa iliyoimarishwa, na uchanganuzi wa bidhaa, kwa mfano, electrophoresis ya gel.

Katika baadhi ya mipangilio, kuwa na vyumba 4 tofauti ni vigumu.Chaguo linalowezekana lakini lisilohitajika sana ni kufanya maandalizi ya mchanganyiko katika eneo la kontena, kwa mfano, baraza la mawaziri la mtiririko wa lamina.Kwa upande wa ukuzaji wa kiota cha PCR, utayarishaji wa mchanganyiko kwa ajili ya mmenyuko wa mzunguko wa pili unapaswa kutayarishwa katika eneo 'safi' kwa ajili ya maandalizi ya mastermix, lakini chanjo na bidhaa ya msingi ya PCR inapaswa kufanywa katika chumba cha kukuza, na ikiwezekana. katika sehemu maalum ya kuzuia (kwa mfano, kabati la mtiririko wa lamina).

Kila chumba/eneo linahitaji seti tofauti ya mabomba yaliyo na lebo, vidokezo vya chujio, rafu za mirija, vortexes, centrifuges (ikiwa inafaa), kalamu, vitendanishi vya kawaida vya maabara, makoti ya maabara na sanduku za glavu ambazo zitabaki kwenye vituo vyao vya kazi.Mikono lazima ioshwe na glavu na kanzu za maabara zibadilishwe wakati wa kusonga kati ya maeneo yaliyotengwa.Vitendanishi na vifaa havipaswi kuhamishwa kutoka eneo chafu hadi eneo safi.Iwapo hali mbaya itatokea ambapo kitendanishi au kipande cha kifaa kinahitaji kusogezwa nyuma, lazima kwanza kisafishwe na hipokloriti ya sodiamu 10%, ikifuatiwa na kufuta kwa maji safi.

Kumbuka

Suluhisho la 10% la hipokloriti ya sodiamu lazima liwe safi kila siku.Inapotumika kwa uchafuzi, muda wa mawasiliano wa angalau dakika 10 unapaswa kuzingatiwa.
Vinginevyo, bidhaa zinazopatikana kibiashara ambazo zimeidhinishwa kuwa vichafuzi vya uso vinavyoharibu DNA vinaweza kutumika ikiwa mapendekezo ya usalama wa ndani hayaruhusu matumizi ya hipokloriti ya sodiamu au ikiwa hipokloriti ya sodiamu haifai kwa kuchafua sehemu za metali za kifaa.

Kimsingi, wafanyakazi wanapaswa kuzingatia kanuni za mtiririko wa kazi zisizoelekezwa kwa pande zote na wasiondoke katika maeneo machafu (baada ya PCR) kurudi kwenye maeneo safi (kabla ya PCR) siku hiyo hiyo.Hata hivyo, kunaweza kuwa na matukio ambapo hii haiwezi kuepukika.Tukio kama hilo linapotokea, wafanyikazi lazima wawe waangalifu kunawa mikono vizuri, kubadilisha glavu, kutumia koti maalum la maabara na kutoanzisha kifaa chochote ambacho watataka kuchukua tena kutoka kwa chumba, kama vile vitabu vya maabara.Hatua hizo za udhibiti zinapaswa kusisitizwa katika mafunzo ya wafanyakazi juu ya mbinu za molekuli.

Baada ya matumizi, nafasi za benchi zinapaswa kusafishwa kwa 10% ya hipokloriti ya sodiamu (ikifuatiwa na maji tasa ili kuondoa bleach iliyobaki), 70% ya ethanoli, au kiondoa uchafuzi cha kuharibu DNA kilichothibitishwa kibiashara.Kimsingi, taa za ultraviolet (UV) zinapaswa kufungwa ili kuwezesha kutokomeza uchafuzi kwa njia ya miale.Hata hivyo, matumizi ya taa za UV zinapaswa kuzuiwa kwa maeneo yaliyofungwa ya kufanyia kazi, kwa mfano makabati ya usalama, ili kupunguza mionzi ya mionzi ya ultraviolet ya wafanyakazi wa maabara.Tafadhali zingatia maagizo ya mtengenezaji kwa huduma ya taa ya UV, uingizaji hewa na kusafisha ili kuhakikisha kuwa taa zinabaki kuwa na ufanisi.

Iwapo unatumia 70% ya ethanoli badala ya hipokloriti ya sodiamu, miale yenye mwanga wa UV itahitajika ili kumaliza uchafuzi huo.
Usifute vortex na centrifuge na hypochlorite ya sodiamu;badala yake, futa kwa 70% ya ethanoli na uweke mwanga wa UV, au tumia dawa ya kibiashara inayoharibu DNA.Kwa kumwagika, wasiliana na mtengenezaji kwa ushauri zaidi wa kusafisha.Ikiwa maagizo ya mtengenezaji yanaruhusu, pipettes inapaswa kusafishwa mara kwa mara na autoclave.Iwapo mabomba hayawezi kujifunga kiotomatiki, itatosha kuwasafisha kwa hipokloriti ya sodiamu 10% (ikifuatiwa na upanguaji kabisa kwa maji safi) au kwa kiondoa uchafuzi cha kibiashara kinachoharibu DNA na kufuatiwa na mionzi ya UV.

Kusafisha kwa asilimia kubwa ya hipokloriti ya sodiamu inaweza hatimaye kuharibu plastiki ya pipette na metali ikiwa inafanywa mara kwa mara;angalia mapendekezo kutoka kwa mtengenezaji kwanza.Vifaa vyote vinahitaji kusawazishwa mara kwa mara kulingana na ratiba iliyopendekezwa na mtengenezaji.Mtu aliyeteuliwa anapaswa kuwa na jukumu la kuhakikisha kuwa ratiba ya urekebishaji inazingatiwa, kumbukumbu za kina zinadumishwa, na lebo za huduma zinaonyeshwa wazi kwenye kifaa.

3. Tumia na kusafisha ushauri kwa nafasi ya molekuli iliyochaguliwa

Pre-PCR: Kitendanishi aliquoting / mastermix maandalizi: Hii inapaswa kuwa safi zaidi ya nafasi zote kutumika kwa ajili ya maandalizi ya majaribio ya molekuli na inafaa kuwa kabati maalum laminar mtiririko na vifaa na UV mwanga.Sampuli, asidi nucleic iliyotolewa na bidhaa za PCR zilizokuzwa hazipaswi kushughulikiwa katika eneo hili.Vitendanishi vya ukuzaji vinapaswa kuhifadhiwa kwenye friji (au jokofu, kulingana na mapendekezo ya mtengenezaji) katika nafasi iliyochaguliwa sawa, karibu na kabati ya mtiririko wa lamina au eneo la kabla ya PCR.Kinga zinapaswa kubadilishwa kila wakati unapoingia kwenye eneo la kabla ya PCR au kabati ya mtiririko wa lamina.

Sehemu ya kabla ya PCR au kabati ya mtiririko wa laminar inapaswa kusafishwa kabla na baada ya matumizi kama ifuatavyo: Futa vitu vyote kwenye kabati, kwa mfano, bomba, sanduku za vidokezo, vortex, centrifuge, racks za bomba, kalamu, n.k. kwa 70% ya ethanol au dawa ya kuharibu DNA ya kibiashara, na kuruhusu kukauka.Katika kesi ya eneo lililofungwa la kufanya kazi, kwa mfano, baraza la mawaziri la mtiririko wa lamina, weka kofia kwenye mwanga wa UV kwa dakika 30.

Kumbuka

Usifunue vitendanishi kwa mwanga wa UV;zihamishe tu kwenye baraza la mawaziri mara likiwa safi.Ikiwa unatekeleza PCR ya unukuzi wa kinyume, inaweza pia kusaidia kufuta nyuso na vifaa kwa myeyusho unaovunja RNases unapogusana.Hii inaweza kusaidia kuzuia matokeo hasi ya uwongo kutoka kwa uharibifu wa enzyme ya RNA.Baada ya uchafuzi na kabla ya kuandaa mastermix, glavu zinapaswa kubadilishwa tena, na kisha baraza la mawaziri liko tayari kutumika.

Kabla ya PCR: Uchimbaji wa asidi ya nyuklia/ongezeko la kiolezo:

Asidi ya nyuklia inapaswa kutolewa na kushughulikiwa katika eneo la pili lililotengwa, kwa kutumia seti tofauti ya bomba, vidokezo vya chujio, rafu za bomba, glavu safi, makoti ya maabara na vifaa vingine. mastermix zilizopo au sahani.Ili kuepuka uchafuzi wa sampuli za asidi ya nucleic zilizotolewa ambazo zinachambuliwa, inashauriwa kubadili glavu kabla ya kushughulikia udhibiti mzuri au viwango na kutumia seti tofauti ya pipettes.Vitendanishi vya PCR na bidhaa zilizoimarishwa hazipaswi kupigwa bomba katika eneo hili.Sampuli zinapaswa kuhifadhiwa kwenye friji au friji maalum katika eneo moja.Sampuli ya nafasi ya kazi inapaswa kusafishwa kwa njia sawa na nafasi ya mastermix.

Baada ya PCR: Ukuzaji na utunzaji wa bidhaa iliyokuzwa

Nafasi hii iliyoteuliwa ni ya michakato ya baada ya ukuzaji na inapaswa kuwa tofauti na maeneo ya kabla ya PCR.Kwa kawaida huwa na vidhibiti joto na majukwaa ya wakati halisi, na kwa hakika inapaswa kuwa na kabati ya mtiririko wa lamina kwa ajili ya kuongeza bidhaa ya mzunguko wa 1 ya PCR kwenye majibu ya raundi ya 2, ikiwa PCR iliyoorodheshwa inatekelezwa.Vitendanishi vya PCR na asidi nucleic iliyotolewa hazipaswi kushughulikiwa katika eneo hili kwa kuwa hatari ya uchafuzi ni kubwa.Eneo hili linapaswa kuwa na seti tofauti ya kinga, nguo za maabara, sahani na bomba la bomba, pipettes, vidokezo vya chujio, mapipa na vifaa vingine.Mirija lazima iwe katikati kabla ya kufunguliwa.Sampuli ya nafasi ya kazi inapaswa kusafishwa kwa njia sawa na nafasi ya mastermix.

Baada ya PCR: Uchambuzi wa bidhaa

Chumba hiki ni cha vifaa vya kutambua bidhaa, kwa mfano tanki za gel electrophoresis, vifurushi vya umeme, kipeperushi cha UV na mfumo wa kuweka kumbukumbu wa jeli.Eneo hili linapaswa kuwa na seti tofauti za glavu, nguo za maabara, racks za sahani na tube, pipettes, vidokezo vya chujio, mapipa na vifaa vingine.Hakuna vitendanishi vingine vinavyoweza kuletwa katika eneo hili, bila kujumuisha rangi ya kupakia, alama ya molekuli na jeli ya agarose, na vijenzi vya bafa.Sampuli ya nafasi ya kazi inapaswa kusafishwa kwa njia sawa na nafasi ya mastermix.

Ujumbe muhimu

Kwa hakika, vyumba vya kabla ya PCR havipaswi kuingizwa siku hiyo hiyo ikiwa kazi tayari imefanywa katika vyumba vya baada ya PCR.Ikiwa hii haiwezi kuepukika kabisa, hakikisha kwamba mikono imeoshwa vizuri kwanza na kwamba makoti maalum ya maabara yanavaliwa katika vyumba.Vitabu vya maabara na karatasi hazipaswi kupelekwa kwenye vyumba vya kabla ya PCR ikiwa zimetumika katika vyumba vya baada ya PCR;ikihitajika, chukua nakala za uchapishaji wa itifaki/sampuli za vitambulisho, n.k.

4. Ushauri wa jumla wa biolojia ya molekuli

Tumia glavu zisizo na unga ili kuepuka kizuizi cha majaribio.Mbinu sahihi ya bomba ni muhimu ili kupunguza uchafuzi.Uwekaji bomba usio sahihi unaweza kusababisha kunyunyiza maji wakati wa kutoa vimiminika na kuundwa kwa erosoli.Mazoezi mazuri ya upigaji bomba yanaweza kupatikana katika viungo vifuatavyo: Mwongozo wa Gilson wa upigaji bomba, video za mbinu za kupitisha bomba za Anachem, mirija ya Centrifuge kabla ya kufunguliwa, na uifungue kwa uangalifu ili kuepuka kunyunyiza.Funga mirija mara baada ya matumizi ili kuepuka kuanzishwa kwa uchafu.

Wakati wa kutekeleza athari nyingi, tayarisha mchanganyiko mmoja mkuu ulio na vitendanishi vya kawaida (km maji, dNTP, bafa, vianzio na kimeng'enya) ili kupunguza idadi ya uhamishaji wa vitendanishi na kupunguza tishio la uchafuzi.Inashauriwa kuanzisha mastermix kwenye barafu au kuzuia baridi.Matumizi ya kimeng'enya cha Hot Start inaweza kusaidia kupunguza uzalishaji wa bidhaa zisizo maalum.Linda vitendanishi vilivyo na vichunguzi vya umeme kutoka kwenye mwanga ili kuepuka uharibifu.

5. Udhibiti wa ndani

Jumuisha vidhibiti vilivyo na sifa nzuri, vilivyothibitishwa vyema na hasi, pamoja na udhibiti usio na violezo katika miitikio yote, na mstari wa mwelekeo ulio na alama nyingi wa miitikio ya kiasi.Udhibiti mzuri haupaswi kuwa na nguvu sana hivi kwamba unaweza kusababisha hatari ya uchafuzi.Jumuisha vidhibiti vyema na hasi vya uchimbaji wakati wa kufanya uchimbaji wa asidi ya nucleic.

Inapendekezwa kuwa maagizo ya wazi yawekwe katika kila moja ya maeneo ili watumiaji wafahamu sheria za maadili.Maabara za uchunguzi zinazogundua viwango vya chini sana vya DNA au RNA katika sampuli za kimatibabu zinaweza kutaka kupitisha kipimo cha ziada cha usalama cha kuwa na mifumo tofauti ya kushughulikia hewa yenye shinikizo chanya kidogo katika vyumba vya kabla ya PCR na shinikizo hasi kidogo katika vyumba vya baada ya PCR.

Mwishowe, kuunda mpango wa uhakikisho wa ubora (QA) ni muhimu.Mpango kama huo unapaswa kujumuisha orodha za hisa kuu za vitendanishi na hisa za kazi, sheria za kuhifadhi vifaa na vitendanishi, kuripoti matokeo ya udhibiti, programu za mafunzo ya wafanyakazi, algoriti za utatuzi, na hatua za kurekebisha inapohitajika.

6. Bibliografia

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Sura ya 3: Kuanzisha maabara ya qPCR.Hati ya mwongozo ya kupima maji ya burudani kwa kutumia mbinu ya USEPA qPCR 1611. Chuo Kikuu cha Jimbo la Lansing- Michigan.

Afya ya Umma Uingereza, NHS.Viwango vya Uingereza vya uchunguzi wa biolojia: Mazoezi Bora ya Maabara wakati wa kufanya majaribio ya ukuzaji wa molekuli).Mwongozo wa Ubora.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Kuanzisha maabara ya PCR.Itifaki ya Cold Spring Harb.2007;7.

Schroeder S 2013. Matengenezo ya kawaida ya centrifuges: kusafisha, matengenezo na disinfection ya centrifuges, rotors na adapters (White paper No. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Mazoezi Bora ya Maabara ya Kliniki (GCLP) kwa vipimo vya msingi vya Masi vinavyotumika katika maabara za uchunguzi, Katika: Akyar I, mhariri.Wigo mpana wa udhibiti wa ubora.Rijeka, Kroatia: Intech;2011: 29-52.