Molekylära detektionsmetoder har förmågan att producera en stor volym nukleinsyra genom amplifiering av spårmängder som finns i prover.Även om detta är fördelaktigt för att möjliggöra känslig detektion, introducerar det också möjligheten för kontaminering genom spridning av amplifieringsaerosoler i laboratoriemiljön.Vid genomförande av experiment kan åtgärder vidtas för att undvika kontaminering av reagenser, laboratorieutrustning och bänkutrymme, eftersom sådan kontaminering kan generera falskt positiva (eller falsknegativa) resultat.

För att minska sannolikheten för kontaminering bör god laboratoriepraxis alltid utövas.Specifikt bör försiktighetsåtgärder vidtas när det gäller följande punkter:

1. Hantering av reagens
2. Organisation av arbetsyta och utrustning
3. Användnings- och rengöringsråd för det angivna molekylutrymmet
4. Allmänna molekylärbiologiska råd
5. Interna kontroller
6. Bibliografi

1. Hantering av reagens

Centrifugera reagensrören kort innan de öppnas för att undvika generering av aerosoler.Alikvotera reagenser för att undvika flera frys-tinningar och kontaminering av masterstockar.Märk och datera tydligt alla reagens- och reaktionsrör och upprätthåll loggar över reagenslot- och batchnummer som används i alla experiment.Pipettera alla reagenser och prover med filterspetsar.Innan du köper, är det lämpligt att bekräfta med tillverkaren att filterspetsarna passar märket på pipetten som ska användas.

2. Organisation av arbetsyta och utrustning

Arbetsytan bör organiseras för att säkerställa att arbetsflödet sker i en riktning, från rena områden (pre-PCR) till smutsiga områden (post-PCR).Följande allmänna försiktighetsåtgärder hjälper till att minska risken för kontaminering.Ha separata avsedda rum, eller åtminstone fysiskt separata områden, för: beredning av mastermix, nukleinsyraextraktion och DNA-malltillägg, amplifiering och hantering av amplifierad produkt och produktanalys, t.ex. gelelektrofores.

I vissa sammanhang är det svårt att ha fyra separata rum.Ett möjligt men mindre önskvärt alternativ är att göra mastermixberedningen i ett inneslutningsområde, t.ex. ett laminärt flödesskåp.I fallet med kapslad PCR-amplifiering bör beredningen av mastermixen för den andra omgångsreaktionen beredas i det "rena" området för mastermixberedningen, men inokuleringen med den primära PCR-produkten bör göras i amplifieringsrummet, och om möjligt i ett särskilt inneslutningsområde (t.ex. ett laminärt flödesskåp).

Varje rum/område behöver en separat uppsättning tydligt märkta pipetter, filterspetsar, rörställ, virvlar, centrifuger (om relevant), pennor, generiska laboratoriereagenser, labbrockar och lådor med handskar som finns kvar på sina respektive arbetsstationer.Händerna måste tvättas och handskar och labbrockar bytas vid förflyttning mellan de anvisade områdena.Reagenser och utrustning bör inte flyttas från ett smutsigt område till ett rent område.Skulle ett extremfall uppstå där ett reagens eller en utrustning behöver flyttas bakåt, måste den först dekontamineras med 10 % natriumhypoklorit, följt av en avtorkning med sterilt vatten.

Notera

Den 10 % natriumhypokloritlösningen måste beredas färsk dagligen.Vid användning för dekontaminering bör en kontakttid på minst 10 minuter följas.
Alternativt kan kommersiellt tillgängliga produkter som är validerade som DNA-förstörande ytdekontaminanter användas om lokala säkerhetsrekommendationer inte tillåter användning av natriumhypoklorit eller om natriumhypoklorit inte är lämpligt för att dekontaminera utrustningens metalldelar.

Helst bör personalen följa det enkelriktade arbetsflödet och inte gå från smutsiga områden (post-PCR) tillbaka till rena områden (pre-PCR) samma dag.Det kan dock finnas tillfällen då detta är oundvikligt.När sådana tillfällen uppstår måste personalen se till att tvätta händerna noggrant, byta handskar, använda den avsedda labbrocken och inte introducera någon utrustning som de vill ta med sig ut ur rummet igen, såsom labbböcker.Sådana kontrollåtgärder bör betonas i personalutbildningen om molekylära metoder.

Efter användning ska bänkutrymmen rengöras med 10 % natriumhypoklorit (följt av sterilt vatten för att avlägsna rester av blekmedel), 70 % etanol eller ett validerat kommersiellt tillgängligt DNA-förstörande dekontamineringsmedel.Helst bör ultravioletta (UV) lampor monteras för att möjliggöra dekontaminering genom bestrålning.Användningen av UV-lampor bör dock begränsas till slutna arbetsområden, t.ex. säkerhetsskåp, för att begränsa laboratoriepersonalens UV-exponering.Följ tillverkarens instruktioner för skötsel, ventilation och rengöring av UV-lampor för att säkerställa att lamporna förblir effektiva.

Om du använder 70 % etanol istället för natriumhypoklorit kommer bestrålning med UV-ljus att behövas för att slutföra saneringen.
Rengör inte virveln och centrifugera inte med natriumhypoklorit;Torka istället av med 70 % etanol och exponera för UV-ljus, eller använd en kommersiell DNA-förstörande dekontamineringsmedel.För spill, kontakta tillverkaren för ytterligare rengöringsråd.Om tillverkarens instruktioner tillåter det, bör pipetter rutinmässigt steriliseras med autoklav.Om pipetter inte kan autoklaveras bör det räcka att rengöra dem med 10 % natriumhypoklorit (följt av en noggrann avtorkning med sterilt vatten) eller med en kommersiell DNA-förstörande dekontaminering följt av UV-exponering.

Rengöring med högprocenthalt natriumhypoklorit kan så småningom skada pipettplaster och metaller om den görs regelbundet;kontrollera rekommendationerna från tillverkaren först.All utrustning måste kalibreras regelbundet enligt tillverkarens rekommenderade schema.En utsedd person bör vara ansvarig för att se till att kalibreringsschemat följs, att detaljerade loggar förs och att serviceetiketter tydligt visas på utrustningen.

3. Användnings- och rengöringsråd för det angivna molekylutrymmet

Pre-PCR: Reagensalikvotering / mastermix-beredning: Detta bör vara det renaste av alla utrymmen som används för att förbereda molekylära experiment och bör helst vara ett designat laminärt flödesskåp utrustat med ett UV-ljus.Prover, extraherad nukleinsyra och amplifierade PCR-produkter får inte hanteras i detta område.Amplifieringsreagenser bör förvaras i en frys (eller kylskåp, enligt tillverkarens rekommendationer) i samma avsedda utrymme, helst bredvid laminärflödesskåpet eller pre-PCR-området.Handskar bör bytas varje gång när man går in i pre-PCR-området eller laminärflödesskåpet.

Pre-PCR-området eller laminärflödesskåpet ska rengöras före och efter användning enligt följande: Torka av alla föremål i skåpet, t.ex. pipetter, spetslådor, virvel, centrifug, rörställ, pennor, etc. med 70 % etanol eller en kommersiellt DNA-förstörande dekontamineringsmedel och låt torka.Vid ett stängt arbetsområde, t.ex. ett laminärt flödesskåp, utsätt huven för UV-ljus i 30 minuter.

Notera

Utsätt inte reagenser för UV-ljus;flytta in dem bara i skåpet när det är rent.Om man utför omvänd transkriptions-PCR kan det också vara bra att torka av ytor och utrustning med en lösning som bryter ner RNaser vid kontakt.Detta kan hjälpa till att undvika falsknegativa resultat från enzymnedbrytning av RNA.Efter sanering och före beredning av mastermixen ska handskarna bytas en gång till, och sedan är skåpet klart att användas.

Pre-PCR: Nukleinsyraextraktion/malltillägg:

Nukleinsyra måste extraheras och hanteras i ett andra avsett område med hjälp av en separat uppsättning pipetter, filterspetsar, rörställ, fräscha handskar, laboratorierockar och annan utrustning. Detta område är också för att lägga till mallar, kontroller och trendlinjer till mastermix rör eller plattor.För att undvika kontaminering av de extraherade nukleinsyraproverna som analyseras, rekommenderas att man byter handskar innan man hanterar positiva kontroller eller standarder och att man använder en separat uppsättning pipetter.PCR-reagenser och amplifierade produkter får inte pipetteras i detta område.Prover bör förvaras i avsedda kylar eller frysar i samma område.Exemplets arbetsyta bör rengöras på samma sätt som mastermixutrymmet.

Post-PCR: Amplifiering och hantering av den amplifierade produkten

Detta avsedda utrymme är för post-amplifieringsprocesser och bör vara fysiskt skilt från pre-PCR-områdena.Den innehåller vanligtvis termocykler och realtidsplattformar och bör helst ha ett laminärt flödesskåp för att lägga till rund 1 PCR-produkten till omgång 2-reaktionen, om kapslad PCR utförs.PCR-reagens och extraherad nukleinsyra får inte hanteras i detta område eftersom risken för kontaminering är hög.Detta område bör ha en separat uppsättning handskar, labbrockar, tallrikar och rörställ, pipetter, filterspetsar, kärl och annan utrustning.Rören måste centrifugeras innan de öppnas.Exemplets arbetsyta bör rengöras på samma sätt som mastermixutrymmet.

Post-PCR: Produktanalys

Detta rum är avsett för produktdetektionsutrustning, t.ex. gelelektroforestankar, kraftpaket, UV-transilluminator och geldokumentationssystemet.Detta område bör ha separata uppsättningar av handskar, labbrockar, tallrikar och rörställ, pipetter, filterspetsar, kärl och annan utrustning.Inga andra reagenser kan föras in i detta område, exklusive laddningsfärgämne, molekylär markör och agarosgel och buffertkomponenter.Exemplets arbetsyta bör rengöras på samma sätt som mastermixutrymmet.

Viktig notering

Helst ska man inte gå in i pre-PCR-rummen samma dag om arbete redan har utförts i post-PCR-rummen.Om detta är helt oundvikligt, se till att händerna först tvättas noggrant och att specifika labbrockar bärs i rummen.Labbböcker och pappersarbete får inte tas in i pre-PCR-rummen om de har använts i post-PCR-rummen;vid behov ta dubbletter av utskrifter av protokoll/prov-ID osv.

4. Allmänna molekylärbiologiska råd

Använd puderfria handskar för att undvika analyshämning.Korrekt pipetteringsteknik är avgörande för att minska kontaminering.Felaktig pipettering kan resultera i stänk vid utmatning av vätskor och skapandet av aerosoler.God praxis för korrekt pipettering kan hittas på följande länkar: Gilson guide till pipettering, Anachem pipetteringsteknik videor, Centrifugera rör innan de öppnas och öppna dem försiktigt för att undvika stänk.Stäng rören omedelbart efter användning för att undvika att föroreningar kommer in.

När du utför flera reaktioner, förbered en mastermix som innehåller vanliga reagenser (t.ex. vatten, dNTP, buffert, primers och enzym) för att minimera antalet reagensöverföringar och minska risken för kontaminering.Det rekommenderas att sätta upp mastermixen på is eller ett kallt block.Användning av ett Hot Start-enzym kan bidra till att minska produktionen av icke-specifika produkter.Skydda reagenser som innehåller fluorescerande prober från ljus för att undvika nedbrytning.

5. Interna kontroller

Inkludera välkarakteriserade, bekräftade positiva och negativa kontroller, tillsammans med en kontroll utan mall i alla reaktioner, och en flerpunktstitrerad trendlinje för kvantitativa reaktioner.Den positiva kontrollen bör inte vara så stark att den utgör en föroreningsrisk.Inkludera positiva och negativa extraktionskontroller när du utför nukleinsyraextraktion.

Det rekommenderas att tydliga instruktioner läggs upp i vart och ett av områdena så att användarna är medvetna om uppföranderegler.Diagnostiska laboratorier som upptäcker mycket låga nivåer av DNA eller RNA i kliniska prover kanske vill använda den extra säkerhetsåtgärden att ha separata luftbehandlingssystem med lätt positivt lufttryck i pre-PCR-rummen och något negativt lufttryck i post-PCR-rummen.

Slutligen är det till hjälp att utveckla en kvalitetssäkringsplan (QA).En sådan plan bör innehålla listor över reagenshuvudlager och arbetslager, regler för förvaring av kit och reagens, rapportering av kontrollresultat, personalutbildningsprogram, felsökningsalgoritmer och korrigerande åtgärder vid behov.

6. Bibliografi

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitel 3: Inrättande av ett qPCR-laboratorium.Ett vägledningsdokument för att testa fritidsvatten med USEPA qPCR-metod 1611. Lansing- Michigan State University.

Folkhälsa England, NHS.Storbritanniens standarder för mikrobiologiska undersökningar: god laboratoriepraxis vid utförande av molekylära amplifieringsanalyser).Kvalitetsvägledning.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Inrättande av ett PCR-laboratorium.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Rutinunderhåll av centrifuger: rengöring, underhåll och desinfektion av centrifuger, rotorer och adaptrar (Vitbok nr 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) för molekylärbaserade tester som används i diagnostiska laboratorier, i: Akyar I, redaktör.Brett spektrum av kvalitetskontroll.Rijeka, Kroatien: Intech;2011: 29–52.