Métode deteksi molekular mibanda kamampuhan pikeun ngahasilkeun volume badag asam nukléat ngaliwatan amplifikasi jumlah renik kapanggih dina sampel.Sanaos ieu mangpaat pikeun ngaktifkeun deteksi sénsitip, éta ogé ngenalkeun kamungkinan kontaminasi ngaliwatan panyebaran aerosol amplifikasi di lingkungan laboratorium.Nalika ngalaksanakeun ékspérimén, langkah-langkah tiasa dilakukeun pikeun ngahindarkeun kontaminasi réagen, alat laboratorium sareng rohangan bangku, sabab kontaminasi sapertos kitu tiasa ngahasilkeun hasil positip palsu (atanapi palsu-négatip).

Pikeun ngabantosan ngirangan kamungkinan kontaminasi, Praktek Laboratorium Alus kedah dilaksanakeun unggal waktos.Sacara khusus, pancegahan kedah dilaksanakeun ngeunaan titik-titik ieu:

1. Nanganan réagen
2. Organisasi workspace jeung alat
3. Pamakéan sareng naséhat beberesih pikeun rohangan molekular anu ditunjuk
4. Saran biologi molekular umum
5. Kadali internal
6. Bibliografi

1. Nanganan réagen

Sakeudeung centrifuge tabung réagen saméméh muka pikeun nyegah generasi aerosol.Aliquot réagen pikeun nyegah sababaraha freeze-thaws jeung kontaminasi saham master.Jelas labél sareng tanggal sadaya tabung réagen sareng réaksi sareng mertahankeun log réagen réagen sareng nomer bets anu dianggo dina sadaya percobaan.Pipet sadaya réagen sareng sampel nganggo tip saringan.Sateuacan ngagaleuh, disarankeun pikeun mastikeun sareng produsén yén tip saringan cocog sareng merek pipette anu dianggo.

2. Organisasi workspace jeung alat

Ruang gawé kudu diatur pikeun mastikeun yén aliran gawé lumangsung dina hiji arah, ti wewengkon beresih (pre-PCR) ka wewengkon kotor (post-PCR).Pancegahan umum di handap ieu bakal ngabantosan ngirangan kamungkinan kontaminasi.Mibanda kamar ditunjuk misah, atawa di wewengkon minimal fisik misah, pikeun: persiapan mastermix, ékstraksi asam nukléat jeung tambahan template DNA, amplifikasi jeung penanganan produk amplified, sarta analisis produk, misalna éléktroforésis gél.

Dina sababaraha setélan, ngabogaan 4 kamar misah hese.Hiji pilihan mungkin tapi kirang desirable nyaéta pikeun ngalakukeun persiapan mastermix di wewengkon ngawadahan, misalna hiji kabinet aliran laminar.Dina kasus amplifikasi PCR nested, persiapan mastermix pikeun réaksi babak kadua kedah disiapkeun di daérah 'bersih' pikeun persiapan mastermix, tapi inokulasi sareng produk PCR primér kedah dilakukeun di kamar amplifikasi, sareng upami mungkin. di wewengkon wadah husus (misalna kabinet aliran laminar).

Tiap kamar / wewengkon perlu set misah pipettes jelas dilabélan, tips filter, rak tube, vortexes, centrifuges (lamun relevan), pulpen, réagen lab generik, jas lab na kotak sarung nu bakal tetep dina workstations masing-masing.Leungeun kedah dikumbah sareng sarung tangan sareng jas lab robih nalika pindah antara daérah anu ditunjuk.Réagen sareng alat-alat henteu kedah dipindahkeun tina daérah anu kotor ka daérah anu bersih.Upami aya kasus anu ekstrim dimana réagen atanapi sapotong alat kedah dipindahkeun ka tukang, éta kedah didekontaminasi heula ku 10% natrium hipoklorit, teras diusap ku cai steril.

Catetan

Solusi natrium hipoklorit 10% kedah didamel seger unggal dinten.Nalika dianggo pikeun dekontaminasi, waktos kontak minimum 10 menit kedah dipatuhi.
Alternatipna, produk sadia komersil anu divalidasi salaku decontaminants permukaan DNA-ngancurkeun bisa dipaké lamun rekomendasi kaamanan lokal teu ngidinan pamakéan natrium hypochlorite atawa lamun natrium hypochlorite teu cocog pikeun decontaminating bagian logam pakakas.

Ideally, staf kudu abide ku etos aliran karya unidirectional jeung teu balik ti wewengkon kotor (pasca-PCR) deui ka wewengkon bersih (pre-PCR) dina dinten anu sami.Sanajan kitu, meureun aya kasempetan nalika ieu teu bisa dihindari.Nalika aya kasempetan sapertos kitu, tanaga kedah ati-ati pikeun ngumbah leungeun sacara saksama, ngaganti sarung tangan, nganggo jas lab anu ditunjuk sareng henteu ngenalkeun alat-alat naon waé anu badé dicandak kaluar deui, sapertos buku lab.Ukuran kontrol misalna kudu emphasized dina latihan staf on métode molekular.

Saatos dianggo, rohangan bangku kedah dibersihkeun ku 10% natrium hipoklorit (dituturkeun ku cai steril pikeun ngaleungitkeun sésa-sésa ngabodaskeun), étanol 70%, atanapi decontaminant ngancurkeun DNA anu disahkeun sacara komersil.Ideally, lampu ultra-violet (UV) kudu dipasang pikeun ngaktipkeun dekontaminasi ku iradiasi.Nanging, pamakean lampu UV kedah dibatesan di daérah kerja anu ditutup, sapertos kabinét kaamanan, pikeun ngawatesan paparan UV staf laboratorium.Mangga turutan parentah produsén pikeun perawatan lampu UV, ventilasi jeung beberesih guna mastikeun yén lampu tetep éféktif.

Upami nganggo étanol 70% tibatan natrium hipoklorit, penyinaran sareng sinar UV bakal diperyogikeun pikeun ngalengkepan dekontaminasi.
Ulah ngabersihan vortex na centrifuge kalawan natrium hypochlorite;tibatan, usap handap kalawan 70% étanol sarta ngalaan sinar UV, atawa ngagunakeun decontaminant DNA-destroying komérsial.Pikeun spills, pariksa ku produsén pikeun nasihat beberesih salajengna.Upami parentah produsén ngijinkeun éta, pipettes kedah rutin disterilisasi ku autoclave.Upami pipet henteu tiasa diautoklaf, cekap pikeun ngabersihan kalayan natrium hipoklorit 10% (diteruskeun ku usap sacara saksama ku cai steril) atanapi nganggo decontaminant ngancurkeun DNA komérsial anu dituturkeun ku paparan UV.

Dibersihkeun ku natrium hipoklorit persentase luhur ahirna tiasa ngaruksak plastik pipette sareng logam upami dilakukeun sacara rutin;pariksa rekomendasi ti produsén munggaran.Sadaya alat kedah dikalibrasi sacara teratur dumasar kana jadwal anu disarankeun ku produsén.Jalma anu ditunjuk kedah tanggung jawab pikeun mastikeun yén jadwal kalibrasi dipatuhi, log lengkep dijaga, sareng labél jasa jelas ditampilkeun dina alat.

3. Pamakéan sareng naséhat beberesih pikeun rohangan molekular anu ditunjuk

Pra-PCR: Persiapan aliquoting / mastermix réagen: Ieu kedah janten tempat anu paling bersih tina sadaya rohangan anu dianggo pikeun persiapan percobaan molekular sareng idéal janten kabinet aliran laminar anu ditunjuk dilengkepan ku lampu UV.Sampel, sari asam nukléat sareng produk PCR anu diamplifikasi teu kedah diurus di daérah ieu.Réagen amplifikasi kudu disimpen dina freezer (atawa kulkas, nurutkeun saran produsén) dina spasi nu sami, ideally gigireun kabinet aliran laminar atawa wewengkon pre-PCR.Sarung tangan kedah digentos unggal waktos nalika lebet ka daérah pra-PCR atanapi kabinet aliran laminar.

Wewengkon pra-PCR atanapi kabinet aliran laminar kedah dibersihkeun sateuacan sareng saatos dianggo sapertos kieu: Ngusap sadaya barang dina kabinet, sapertos pipettes, kotak tip, vortex, centrifuge, rak tabung, pulpén, sareng sajabana nganggo étanol 70% atanapi a decontaminant DNA-destroying komérsial, sarta ngidinan nepi ka garing.Dina kasus wewengkon gawé katutup, misalna kabinet aliran laminar, ngalaan tiung ka lampu UV salila 30 menit.

Catetan

Ulah ngalaan réagen kana sinar UV;ngan pindahkeun kana kabinet lamun geus beresih.Upami ngalakukeun PCR transkripsi ngabalikeun, éta ogé tiasa ngabantosan pikeun ngusap permukaan sareng alat nganggo solusi anu ngarecah RNases nalika kontak.Ieu tiasa ngabantosan ngahindarkeun hasil négatip palsu tina degradasi énzim RNA.Saatos dekontaminasi sareng sateuacan nyiapkeun mastermix, sarung tangan kedah diganti sakali deui, teras kabinet siap dianggo.

Pra-PCR: Ekstraksi asam nukléat/tambahan template:

Asam nukléat kudu sasari jeung diatur dina wewengkon ditunjuk kadua, ngagunakeun set misah tina pipettes, tips filter, rak tube, sarung seger, jas lab jeung equipment.This lianna. Wewengkon ieu ogé pikeun nambahkeun template, kontrol jeung trendlines ka tabung mastermix atanapi piring.Pikeun ngahindarkeun kontaminasi sampel asam nukléat sasari anu keur dianalisis, disarankeun pikeun ngaganti sarung tangan saméméh nanganan kontrol atawa standar positif sarta ngagunakeun set pipettes misah.Réagen PCR sareng produk anu diamplifikasi henteu kedah dipipet di daérah ieu.Sampel kedah disimpen dina kulkas atanapi freezer anu ditunjuk di daérah anu sami.Ruang kerja sampel kedah dibersihkeun ku cara anu sami sareng rohangan mastermix.

Post-PCR: Amplifikasi sareng penanganan produk anu diamplifikasi

Ruang anu ditunjuk ieu kanggo prosés pasca-amplifikasi sareng kedah misah sacara fisik ti daérah pra-PCR.Biasana ngandung thermocyclers sareng platform real-time, sareng idéalna kedah gaduh kabinet aliran laminar pikeun nambihan produk PCR babak 1 kana réaksi babak 2, upami PCR nested dilaksanakeun.Réagen PCR sareng asam nukléat ékstrak henteu kedah diurus di daérah ieu kusabab résiko kontaminasi luhur.Wewengkon ieu kedah gaduh set sarung tangan anu misah, jas lab, rak piring sareng tabung, pipettes, tip saringan, tong sampah sareng alat-alat sanés.Tabung kedah disentri sateuacan dibuka.Ruang kerja sampel kedah dibersihkeun ku cara anu sami sareng rohangan mastermix.

Post-PCR: analisis produk

Ruang ieu kanggo alat-alat deteksi produk, contona tank éléktroforésis gél, pak kakuatan, transilluminator UV sareng sistem dokuméntasi gél.Wewengkon ieu kedah gaduh set sarung tangan, jas lab, rak piring sareng tabung, pipettes, tip saringan, tong sampah sareng alat-alat sanés.Henteu aya réagen sanés anu tiasa dibawa ka daérah ieu, henteu kalebet pewarna muatan, spidol molekular sareng gél agarose, sareng komponén panyangga.Ruang kerja sampel kedah dibersihkeun ku cara anu sami sareng rohangan mastermix.

Catetan penting

Ideally, kamar pre-PCR teu kudu diasupkeun dina dinten anu sami lamun pagawean geus dipigawé di kamar post-PCR.Upami ieu leres-leres teu tiasa dihindari, pastikeun yén panangan dikumbah heula sacara saksama sareng jas lab khusus dianggo di kamar.Buku lab sareng paperwork teu kedah dibawa ka kamar pre-PCR lamun aranjeunna geus dipaké di kamar post-PCR;lamun perlu, nyandak duplikat print-kaluar tina protokol / ID sampel, jsb.

4. Saran biologi molekular umum

Anggo sarung tangan bébas bubuk pikeun nyegah inhibisi uji.Téhnik pipetting anu leres penting pisan pikeun ngirangan kontaminasi.Pipet anu salah tiasa nyababkeun percikan nalika ngaluarkeun cairan sareng nyiptakeun aerosol.Prakték alus pikeun pipetting bener bisa kapanggih dina tumbu di handap ieu: Gilson pituduh pikeun pipetting, video téhnik pipetting Anachem, tabung Centrifuge saméméh muka, tur muka aranjeunna taliti ulah splashing.Tutup tabung langsung saatos dianggo pikeun ngahindarkeun bubuka kontaminan.

Nalika ngalakukeun sababaraha réaksi, nyiapkeun hiji mastermix ngandung réagen umum (misalna cai, dNTPs, buffer, primers jeung énzim) pikeun ngaleutikan jumlah mindahkeun réagen jeung ngurangan ancaman kontaminasi.Disarankeun pikeun nyetél mastermix dina és atanapi blok tiis.Pamakéan énzim Hot Start tiasa ngabantosan ngirangan produksi produk non-spésifik.Ngajagi réagen anu ngandung panyilidikan fluoresensi tina cahaya supados ngahindarkeun degradasi.

5. Kadali internal

Kaasup kontrol positif jeung négatif anu dicirian saé, dikonfirmasi, sareng kontrol tanpa template dina sadaya réaksi, sareng garis tren titrated multi-titik pikeun réaksi kuantitatif.Kontrol positip henteu kedah kuat pisan anu nyababkeun résiko kontaminasi.Kaasup kontrol ékstraksi positif jeung negatif nalika ngalakukeun ékstraksi asam nukléat.

Disarankeun yén paréntah anu jelas dipasang dina unggal daérah supados pangguna sadar kana aturan kalakuan.Laboratorium diagnostik anu ngadeteksi tingkat DNA atanapi RNA anu rendah pisan dina conto klinis panginten hoyong ngadopsi ukuran kaamanan tambahan pikeun gaduh sistem penanganan hawa anu misah kalayan tekanan hawa rada positip di kamar pre-PCR sareng tekanan hawa rada négatip di kamar post-PCR.

Anu pamungkas, ngamekarkeun rencana jaminan kualitas (QA) mantuan.Rencana sapertos kitu kedah kalebet daptar saham master réagen sareng saham kerja, aturan pikeun nyimpen kit sareng réagen, ngalaporkeun hasil kontrol, program pelatihan staf, algoritma ngungkulan, sareng tindakan rémédial upami diperyogikeun.

6. Bibliografi

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Bab 3: Nyetel hiji laboratorium qPCR.Dokumén pituduh pikeun nguji cai rekreasi nganggo metodeu qPCR USEPA 1611. Lansing- Michigan State University.

Kaséhatan Umum Inggris, NHS.Standar Inggris pikeun panyelidikan mikrobiologi: Praktek Laboratorium anu hadé nalika ngalakukeun uji amplifikasi molekular).Pituduh Kualitas.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Nyetél laboratorium PCR.Tiis Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. pangropéa rutin centrifuges: beberesih, pangropéa na disinfection of centrifuges, rotors na adapters (White kertas No. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) pikeun tés dumasar molekular dipaké di laboratorium diagnostik, Dina: Akyar I, redaktur.spéktra lega kontrol kualitas.Rijeka, Kroasia: Intech;2011: 29–52.