Методе молекуларне детекције имају способност да произведу велику количину нуклеинске киселине кроз амплификацију количина у траговима које се налазе у узорцима.Иако је ово корисно за омогућавање осетљиве детекције, оно такође уводи могућност контаминације кроз ширење аеросола за појачавање у лабораторијском окружењу.Приликом извођења експеримената могу се предузети мере да се избегне контаминација реагенаса, лабораторијске опреме и простора на клупи, јер таква контаминација може да генерише лажно позитивне (или лажно негативне) резултате.

Да би се смањила вероватноћа контаминације, Добре лабораторијске праксе треба увек да се примењују.Конкретно, треба предузети мере предострожности у вези са следећим тачкама:

1. Руковање реагенсима
2. Организација радног простора и опреме
3. Савети за коришћење и чишћење за одређени молекуларни простор
4. Општи савети из молекуларне биологије
5. Унутрашње контроле
6. Библиографија

1. Руковање реагенсима

Кратко центрифугирајте епрувете са реагенсом пре отварања да бисте избегли стварање аеросола.Аликвотни реагенси да би се избегло вишеструко замрзавање-одмрзавање и контаминација матичних залиха.Јасно означите и датирајте све епрувете са реагенсима и реакционим епруветама и водите евиденцију бројева серија реагенса и серија коришћених у свим експериментима.Пипетирајте све реагенсе и узорке користећи врхове филтера.Пре куповине, препоручљиво је да потврдите код произвођача да врхови филтера одговарају марки пипете која ће се користити.

2. Организација радног простора и опреме

Радни простор треба организовати тако да се обезбеди да се ток посла одвија у једном правцу, од чистих подручја (пре-ПЦР) до прљавих подручја (пост-ПЦР).Следеће опште мере предострожности ће помоћи да се смањи могућност контаминације.Имајте одвојене одређене просторије, или најмање физички одвојене просторе, за: припрему мастермикса, екстракцију нуклеинске киселине и додавање ДНК шаблона, амплификацију и руковање амплификованим производом и анализу производа, нпр. гел електрофореза.

У неким окружењима, тешко је имати 4 одвојене собе.Могућа, али мање пожељна опција је припрема мастермикса у затвореном простору, нпр.У случају угњежђене ПЦР амплификације, припрему мастермикса за другу рунду реакције треба припремити у 'чистом' простору за припрему мастермикса, али инокулацију примарним ПЦР производом треба обавити у просторији за амплификација, и ако је могуће у посебном простору за задржавање (нпр. кабинет са ламинарним протоком).

Свакој просторији/области је потребан посебан сет јасно означених пипета, врхова филтера, носача за епрувете, вортекса, центрифуга (ако је релевантно), оловки, генеричких лабораторијских реагенса, лабораторијских мантила и кутија за рукавице које ће остати на њиховим радним станицама.Руке се морају опрати, а рукавице и лабораторијски мантили променити када се крећете између одређених места.Реагенсе и опрему не треба премештати из прљавог у чист простор.Ако дође до екстремног случаја када реагенс или део опреме треба да се помери уназад, он се прво мора деконтаминирати са 10% натријум хипохлорита, а затим обрисати стерилном водом.

Белешка

10% раствор натријум хипохлорита се мора свакодневно правити свеже.Када се користи за деконтаминацију, потребно је придржавати се минималног времена контакта од 10 минута.
Алтернативно, комерцијално доступни производи који су валидирани као површински деконтаминанти који уништавају ДНК могу се користити ако локалне безбедносне препоруке не дозвољавају употребу натријум хипохлорита или ако натријум хипохлорит није погодан за деконтаминацију металних делова опреме.

У идеалном случају, особље треба да се придржава етоса једносмерног тока рада и да се не враћа из прљавих подручја (пост-ПЦР) назад у чиста подручја (пре-ПЦР) истог дана.Међутим, могу постојати случајеви када је то неизбежно.Када се укаже таква прилика, особље мора да води рачуна о томе да темељно опере руке, промени рукавице, користи предвиђени лабораторијски мантил и не уноси никакву опрему коју ће поново желети да изнесе из собе, као што су лабораторијске књиге.Такве мере контроле треба да буду наглашене у обуци особља о молекуларним методама.

Након употребе, просторе на клупама треба очистити са 10% натријум хипохлорита (а затим стерилном водом за уклањање остатака избељивача), 70% етанолом или валидираним комерцијално доступним деконтаминантом који уништава ДНК.У идеалном случају, ултраљубичасте (УВ) лампе треба да буду постављене да би се омогућила деконтаминација зрачењем.Међутим, употреба УВ лампи треба да буде ограничена на затворене радне просторе, нпр. сигурносне ормаре, како би се ограничила изложеност лабораторијског особља УВ зрачењу.Молимо придржавајте се упутстава произвођача за негу УВ лампе, вентилацију и чишћење како бисте осигурали да лампе остану ефикасне.

Ако користите 70% етанол уместо натријум хипохлорита, биће потребно зрачење УВ светлом да би се завршила деконтаминација.
Не чистите вртлог и центрифугирајте натријум хипохлоритом;уместо тога, обришите са 70% етанола и изложите УВ светлу, или користите комерцијални деконтаминант који уништава ДНК.У случају просипања, обратите се произвођачу за даље савете о чишћењу.Ако упутства произвођача то дозвољавају, пипете треба рутински стерилисати у аутоклаву.Ако пипете не могу да се аутоклавирају, требало би да буде довољно да их очистите са 10% натријум хипохлорита (после чега следи темељно брисање стерилном водом) или комерцијалним деконтаминантом који уништава ДНК, а затим излагањем УВ зрачењу.

Чишћење са високим процентом натријум хипохлорита може евентуално оштетити пластику и метале пипета ако се обавља редовно;прво проверите препоруке произвођача.Сву опрему треба редовно калибрисати према распореду који препоручује произвођач.Одређена особа треба да буде задужена да се придржава распореда калибрације, да се одржавају детаљни дневници и да су сервисне налепнице јасно приказане на опреми.

3. Савети за коришћење и чишћење за одређени молекуларни простор

Пре-ПЦР: Аликвотирање реагенса/припрема мастермикса: Ово би требало да буде најчистији од свих простора који се користе за припрему молекуларних експеримената и идеално би требало да буде одређен кабинет за ламинарни проток опремљен УВ светлом.Узорци, екстрахована нуклеинска киселина и амплификовани ПЦР производи се не смеју руковати у овој области.Реагенсе за појачавање треба држати у замрзивачу (или фрижидеру, према препорукама произвођача) у истом одређеном простору, идеално поред кабинета за ламинарни проток или пре-ПЦР области.Рукавице треба мењати сваки пут када уђете у пре-ПЦР зону или кабинет за ламинарни проток.

Пре-ПЦР област или кабинет за ламинарни проток треба очистити пре и после употребе на следећи начин: Обришите све предмете у кабинету, нпр. пипете, кутије са врховима, вортекс, центрифуге, носаче за цеви, оловке, итд. са 70% етанола или комерцијални деконтаминант који уништава ДНК и оставити да се осуши.У случају затвореног радног простора, нпр. кабинета са ламинарним протоком, изложите хаубу УВ светлу 30 минута.

Белешка

Не излажите реагенсе УВ светлу;померите их у кабинет само када је чист.Ако обављате ПЦР са реверзном транскрипцијом, такође може бити од помоћи да обришете површине и опрему раствором који разграђује РНазе при контакту.Ово може помоћи да се избегну лажно негативни резултати ензимске деградације РНК.Након деконтаминације и пре припреме мастермикса, рукавице треба још једном променити и тада је кабинет спреман за употребу.

Пре-ПЦР: Екстракција нуклеинске киселине/додавање шаблона:

Нуклеинска киселина се мора екстраховати и руковати у другој одређеној области, користећи посебан сет пипета, врхова филтера, носача за епрувете, свежих рукавица, лабораторијских мантила и друге опреме. Ово подручје је такође за додавање шаблона, контрола и линија тренда у мастермик цеви или плоче.Да би се избегла контаминација екстрахованих узорака нуклеинске киселине који се анализирају, препоручује се замена рукавица пре руковања позитивним контролама или стандардима и употреба посебног комплета пипета.ПЦР реагенси и појачани производи се не смеју пипетирати у овој области.Узорке треба чувати у одређеним фрижидерима или замрзивачима у истом простору.Радни простор узорка треба очистити на исти начин као и простор мастермикса.

Пост-ПЦР: Амплификација и руковање амплификованим производом

Овај одређени простор је за процесе после амплификације и требало би да буде физички одвојен од пре-ПЦР области.Обично садржи термоциклере и платформе у реалном времену, а идеално би требало да има кабинет са ламинарним протоком за додавање ПЦР производа 1. круга у реакцију 2. круга, ако се изводи угнежђени ПЦР.ПЦР реагенсима и екстрахованом нуклеинском киселином се не сме руковати у овој области јер је ризик од контаминације висок.Ово подручје треба да има посебан сет рукавица, лабораторијских мантила, носача за плоче и епрувете, пипете, врхове филтера, канте и другу опрему.Епрувете се морају центрифугирати пре отварања.Радни простор узорка треба очистити на исти начин као и простор мастермикса.

Пост-ПЦР: Анализа производа

Ова просторија је за опрему за детекцију производа, нпр. резервоаре за гел електрофорезу, агрегате за напајање, УВ трансилуминатор и систем за документацију гела.Ово подручје треба да има одвојене комплете рукавица, лабораторијских мантила, носача за плоче и епрувете, пипете, врхове филтера, канте и другу опрему.У ову област се не могу уносити други реагенси, осим боје за пуњење, молекуларног маркера и агарозног гела и компоненти пуфера.Радни простор узорка треба очистити на исти начин као и простор мастермикса.

Важна напомена

У идеалном случају, у просторије пре ПЦР не би требало улазити истог дана ако је посао већ обављен у просторијама после ПЦР.Ако је ово потпуно неизбежно, побрините се да се руке прво добро оперу и да се у собама носе посебни лабораторијски мантили.Лабораторијске књиге и папирологија не смеју се уносити у просторије за пре-ПЦР ако су коришћене у просторијама за пост-ПЦР;ако је потребно, узмите дупликате одштампаних протокола/ИД узорака итд.

4. Општи савети из молекуларне биологије

Користите рукавице без пудера да бисте избегли инхибицију анализе.Исправна техника пипетирања је најважнија за смањење контаминације.Неправилно пипетирање може довести до прскања при испуштању течности и стварања аеросола.Добра пракса за правилно пипетирање може се наћи на следећим линковима: Гилсонов водич за пипетирање, видео снимци Анацхем технике пипетирања, епрувете за центрифугирање пре отварања и пажљиво их отворите да бисте избегли прскање.Затворите епрувете одмах након употребе да бисте избегли уношење загађивача.

Када изводите више реакција, припремите једну главну мешавину која садржи уобичајене реагенсе (нпр. воду, дНТП, пуфер, прајмере и ензим) да бисте минимизирали број трансфера реагенса и смањили опасност од контаминације.Препоручује се постављање мастермикса на лед или хладан блок.Употреба ензима Хот Старт може помоћи да се смањи производња неспецифичних производа.Заштитите реагенсе који садрже флуоресцентне сонде од светлости како бисте избегли деградацију.

5. Унутрашње контроле

Укључите добро окарактерисане, потврђене позитивне и негативне контроле, заједно са контролом без шаблона у свим реакцијама и линијом тренда за квантитативне реакције са више тачака.Позитивна контрола не би требало да буде толико јака да представља ризик од контаминације.Укључите позитивне и негативне контроле екстракције када изводите екстракцију нуклеинске киселине.

Препоручује се да се у свакој области поставе јасна упутства како би корисници били свесни правила понашања.Дијагностичке лабораторије које детектују веома ниске нивое ДНК или РНК у клиничким узорцима можда ће желети да усвоје додатну безбедносну меру да имају одвојене системе за руковање ваздухом са благо позитивним ваздушним притиском у просторијама пре ПЦР и благо негативним ваздушним притиском у просторијама након ПЦР.

На крају, развој плана осигурања квалитета (КА) је од помоћи.Такав план треба да садржи спискове главних залиха реагенса и радних залиха, правила за складиштење комплета и реагенса, извештавање о резултатима контроле, програме обуке особља, алгоритме за решавање проблема и поправне радње када је то потребно.

6. Библиографија

Аслан А, Кинзелман Ј, Дреелин Е, Анан'ева Т, Лавандер Ј. Поглавље 3: Успостављање кПЦР лабораторије.Упутство за тестирање рекреативних вода коришћењем УСЕПА кПЦР методе 1611. Лансинг-Мицхиган Стате Университи.

Јавно здравље Енглеске, НХС.Британски стандарди за микробиолошка истраживања: Добра лабораторијска пракса при извођењу тестова молекуларне амплификације).Куалити Гуиданце.2013;4(4):1–15.

Миффлин Т. Постављање ПЦР лабораторије.Цолд Спринг Харб Протоц.2007;7.

Сцхроедер С 2013. Рутинско одржавање центрифуга: чишћење, одржавање и дезинфекција центрифуга, ротора и адаптера (Бела књига бр. 14).Хамбург: Епендорф;2013.

Виана РВ, Валлис ЦЛ.Добра клиничка лабораторијска пракса (ГЦЛП) за молекуларне тестове који се користе у дијагностичким лабораторијама, У: Акиар И, уредник.Широки спектар контроле квалитета.Ријека, Хрватска: Интецх;2011: 29–52.