Metodat e zbulimit molekular kanë aftësinë për të prodhuar një vëllim të madh të acidit nukleik përmes amplifikimit të sasive gjurmë që gjenden në mostra.Ndërsa kjo është e dobishme për të mundësuar zbulimin e ndjeshëm, ai gjithashtu prezanton mundësinë e kontaminimit përmes përhapjes së aerosoleve të amplifikimit në mjedisin laboratorik.Gjatë kryerjes së eksperimenteve, mund të ndërmerren masa për të shmangur kontaminimin e reagentëve, pajisjeve laboratorike dhe hapësirës së stolit, pasi një kontaminim i tillë mund të gjenerojë rezultate false-pozitive (ose false-negative).

Për të ndihmuar në uljen e gjasave të kontaminimit, Praktika e Mirë Laboratorike duhet të ushtrohet në çdo kohë.Në mënyrë të veçantë, duhet të merren masa paraprake në lidhje me pikat e mëposhtme:

1. Trajtimi i reagentëve
2. Organizimi i hapësirës së punës dhe pajisjeve
3. Këshilla për përdorimin dhe pastrimin për hapësirën e caktuar molekulare
4. Këshilla të përgjithshme të biologjisë molekulare
5. Kontrollet e brendshme
6. Bibliografi

1. Trajtimi i reagentëve

Centrifugoni shkurt tubat e reagentit përpara hapjes për të shmangur gjenerimin e aerosoleve.Reagentë të mjaftueshëm për të shmangur ngrirje-shkrirjet e shumta dhe ndotjen e rezervave kryesore.Etiketoni qartë dhe datën e të gjithë tubave të reagentëve dhe reaksioneve dhe mbani regjistrat e numrit të grupeve dhe grupeve të reagentëve të përdorur në të gjitha eksperimentet.Pipetoni të gjithë reagentët dhe mostrat duke përdorur majat e filtrit.Përpara blerjes, këshillohet të konfirmoni me prodhuesin që majat e filtrit përshtaten me markën e pipetës që do të përdoret.

2. Organizimi i hapësirës së punës dhe pajisjeve

Hapësira e punës duhet të organizohet për të siguruar që rrjedha e punës të ndodhë në një drejtim, nga zonat e pastra (para-PCR) në zonat e pista (post-PCR).Masat paraprake të përgjithshme të mëposhtme do të ndihmojnë për të zvogëluar mundësinë e kontaminimit.Keni dhoma të veçanta të përcaktuara, ose minimalisht zona të ndara fizikisht, për: përgatitjen e mastermiksit, nxjerrjen e acidit nukleik dhe shtimin e shabllonit të ADN-së, amplifikimin dhe trajtimin e produktit të përforcuar dhe analizën e produktit, p.sh. elektroforezë xheli.

Në disa mjedise, të kesh 4 dhoma të ndara është e vështirë.Një opsion i mundshëm, por më pak i dëshirueshëm është që të bëni përgatitjen e mastermiksit në një zonë izolimi, p.sh. një kabinet me rrjedhje laminare.Në rastin e amplifikimit të mbivendosur PCR, përgatitja e mastermiksit për reaksionin e raundit të dytë duhet të përgatitet në zonën 'e pastër' për përgatitjen e mastermiksit, por inokulimi me produktin primar PCR duhet të bëhet në dhomën e amplifikimit, dhe nëse është e mundur. në një zonë të dedikuar izolimi (p.sh. një kabinet me rrjedhje laminare).

Çdo dhomë/zonë ka nevojë për një grup të veçantë pipetash të etiketuara qartë, majë filtri, rafte tubash, vorbulla, centrifuga (nëse është e nevojshme), stilolapsa, reagentë laboratorikë gjenerikë, veshje laboratorike dhe kuti dorezash që do të qëndrojnë në stacionet e tyre përkatëse të punës.Duart duhet të lahen dhe dorezat dhe veshjet e laboratorit duhet të ndërrohen kur lëvizni midis zonave të caktuara.Reagentët dhe pajisjet nuk duhet të zhvendosen nga një zonë e ndotur në një zonë të pastër.Nëse shfaqet një rast ekstrem kur një reagjent ose një pjesë e pajisjes duhet të zhvendoset mbrapsht, duhet fillimisht të dekontaminohet me hipoklorit natriumi 10%, e më pas të fshihet me ujë steril.

shënim

Zgjidhja 10% e hipokloritit të natriumit duhet të përgatitet e freskët çdo ditë.Kur përdoret për dekontaminim, duhet të respektohet një kohë kontakti minimale prej 10 minutash.
Përndryshe, produktet e disponueshme në treg që janë të vërtetuara si dekontaminues sipërfaqësor që shkatërrojnë ADN-në mund të përdoren nëse rekomandimet lokale të sigurisë nuk lejojnë përdorimin e hipokloritit të natriumit ose nëse hipokloriti i natriumit nuk është i përshtatshëm për dekontaminimin e pjesëve metalike të pajisjeve.

Në mënyrë ideale, stafi duhet t'i përmbahet moralit të rrjedhës së punës me një drejtim dhe të mos kthehet nga zonat e pista (pas-PCR) në zonat e pastra (para-PCR) në të njëjtën ditë.Megjithatë, mund të ketë raste kur kjo është e pashmangshme.Kur lind një rast i tillë, personeli duhet të kujdeset që të lajë plotësisht duart, të ndryshojë dorezat, të përdorë veshjen e caktuar të laboratorit dhe të mos prezantojë asnjë pajisje që do të dëshirojë ta nxjerrë përsëri nga dhoma, si p.sh. librat e laboratorit.Masa të tilla kontrolli duhet të theksohen në trajnimin e stafit për metodat molekulare.

Pas përdorimit, hapësirat e stolave ​​duhet të pastrohen me 10% hipoklorit natriumi (pasuar me ujë steril për të hequr zbardhuesin e mbetur), 70% etanol ose një dekontaminues të vlefshëm në treg për shkatërrimin e ADN-së.Idealisht, llambat ultraviolet (UV) duhet të vendosen për të mundësuar dekontaminimin nga rrezatimi.Megjithatë, përdorimi i llambave UV duhet të kufizohet në zonat e mbyllura të punës, p.sh. kabinete sigurie, në mënyrë që të kufizohet ekspozimi ndaj rrezeve ultraviolet të stafit të laboratorit.Ju lutemi respektoni udhëzimet e prodhuesit për kujdesin, ventilimin dhe pastrimin e llambave UV në mënyrë që të siguroheni që llambat të mbeten efektive.

Nëse përdorni 70% etanol në vend të hipokloritit të natriumit, do të nevojitet rrezatimi me dritë UV për të përfunduar dekontaminimin.
Mos e pastroni vorbullën dhe centrifugoni me hipoklorit natriumi;në vend të kësaj, fshijeni me 70% etanol dhe ekspozojeni në dritën UV, ose përdorni një dekontaminues komercial që shkatërron ADN-në.Për derdhjet, konsultohuni me prodhuesin për këshilla të mëtejshme pastrimi.Nëse udhëzimet e prodhuesit e lejojnë këtë, pipetat duhet të sterilizohen në mënyrë rutinore me autoklavë.Nëse pipetat nuk mund të autoklavohen, duhet të mjaftojë pastrimi i tyre me 10% hipoklorit natriumi (pasuar nga një fshirje e plotë me ujë steril) ose me një dekontaminues komercial që shkatërron ADN-në e ndjekur nga ekspozimi ndaj UV.

Pastrimi me hipoklorit natriumi me përqindje të lartë mund të dëmtojë përfundimisht plastikën dhe metalet e pipetës nëse bëhet rregullisht;kontrolloni së pari rekomandimet nga prodhuesi.Të gjitha pajisjet duhet të kalibrohen rregullisht sipas planit të rekomanduar nga prodhuesi.Një person i caktuar duhet të jetë përgjegjës për të siguruar që programi i kalibrimit të respektohet, të ruhen regjistrat e detajuar dhe etiketat e shërbimit të shfaqen qartë në pajisje.

3. Këshilla për përdorimin dhe pastrimin për hapësirën e caktuar molekulare

Para-PCR: Përgatitja e alikutimit të reagentit / mastermiksit: Kjo duhet të jetë më e pastra nga të gjitha hapësirat e përdorura për përgatitjen e eksperimenteve molekulare dhe në mënyrë ideale duhet të jetë një kabinet i caktuar me rrjedhje laminare i pajisur me një dritë UV.Mostrat, acidi nukleik i ekstraktuar dhe produktet e amplifikuara PCR nuk duhet të trajtohen në këtë zonë.Reagentët përforcues duhet të mbahen në një frigorifer (ose frigorifer, sipas rekomandimeve të prodhuesit) në të njëjtën hapësirë ​​të caktuar, në mënyrë ideale pranë kabinetit të rrjedhës laminare ose zonës para PCR.Dorezat duhet të ndërrohen çdo herë pas hyrjes në zonën para PCR ose në kabinetin e rrjedhës laminare.

Zona para PCR ose kabineti i rrjedhës laminare duhet të pastrohet para dhe pas përdorimit si më poshtë: Fshini të gjithë artikujt në kabinet, p.sh. dekontaminues komercial që shkatërron ADN-në dhe lëreni të thahet.Në rastin e një zone pune të mbyllur, p.sh. një kabinet me rrjedhje laminare, ekspozoni kapuçin në dritën UV për 30 minuta.

shënim

Mos i ekspozoni reagentët ndaj dritës UV;zhvendosini ato në kabinet vetëm pasi të jetë i pastër.Nëse kryeni PCR të transkriptimit të kundërt, mund të jetë gjithashtu e dobishme të fshini sipërfaqet dhe pajisjet me një zgjidhje që zbërthen RNase në kontakt.Kjo mund të ndihmojë në shmangien e rezultateve false-negative nga degradimi i enzimës së ARN-së.Pas dekontaminimit dhe para përgatitjes së mastermiksit, dorezat duhet të ndërrohen edhe një herë dhe më pas kabineti është gati për përdorim.

Pre-PCR: Ekstraktimi i acidit nukleik/shtimi i shabllonit:

Acidi nukleik duhet të nxirret dhe të trajtohet në një zonë të dytë të caktuar, duke përdorur një grup të veçantë pipetash, majë filtri, rafte tubash, doreza të freskëta, veshje laboratori dhe pajisje të tjera. Kjo zonë është gjithashtu për shtimin e shablloneve, kontrolleve dhe vijave të trendit në tuba ose pllaka mastermix.Për të shmangur kontaminimin e mostrave të acidit nukleik të nxjerrë që po analizohen, rekomandohet ndërrimi i dorezave përpara përdorimit të kontrolleve ose standardeve pozitive dhe përdorimi i një grupi të veçantë pipetash.Reagentët PCR dhe produktet e përforcuara nuk duhet të futen me pipetë në këtë zonë.Mostrat duhet të ruhen në frigoriferë ose ngrirës të caktuar në të njëjtën zonë.Hapësira e punës së mostrës duhet të pastrohet në të njëjtën mënyrë si hapësira e mastermix-it.

Post-PCR: Amplifikimi dhe trajtimi i produktit të përforcuar

Kjo hapësirë ​​e caktuar është për proceset pas amplifikimit dhe duhet të jetë fizikisht e ndarë nga zonat para PCR.Zakonisht përmban termociklerë dhe platforma në kohë reale, dhe në mënyrë ideale duhet të ketë një kabinet të rrjedhës laminare për shtimin e produktit PCR të rrumbullakët 1 në reaksionin e raundit 2, nëse po kryhet PCR e vendosur.Reagentët PCR dhe acidi nukleik i nxjerrë nuk duhet të trajtohen në këtë zonë pasi rreziku i kontaminimit është i lartë.Kjo zonë duhet të ketë një grup të veçantë dorezash, veshje laboratori, rafte për pllaka dhe tuba, pipeta, majë filtri, kosha dhe pajisje të tjera.Tubat duhet të centrifugohen përpara hapjes.Hapësira e punës së mostrës duhet të pastrohet në të njëjtën mënyrë si hapësira e mastermix-it.

Post-PCR: Analiza e produktit

Kjo dhomë është për pajisjet e zbulimit të produktit, p.sh. rezervuarët e elektroforezës së xhelit, paketat e energjisë, transilluminatorin UV dhe sistemin e dokumentacionit të xhelit.Kjo zonë duhet të ketë komplete të veçanta dorezash, veshje laboratori, rafte për pllaka dhe tuba, pipeta, majë filtri, kosha dhe pajisje të tjera.Asnjë reagent tjetër nuk mund të sillet në këtë zonë, me përjashtim të bojës ngarkuese, markerit molekular dhe xhelit të agarozës dhe komponentëve tampon.Hapësira e punës së mostrës duhet të pastrohet në të njëjtën mënyrë si hapësira e mastermix-it.

Shënim i rëndësishëm

Idealisht, dhomat para PCR nuk duhet të futen në të njëjtën ditë nëse puna është kryer tashmë në dhomat pas PCR.Nëse kjo është krejtësisht e pashmangshme, sigurohuni që së pari të lani duart tërësisht dhe të vishni veshje të veçanta laboratorike në dhoma.Librat e laboratorit dhe dokumentet nuk duhet të futen në dhomat e para-PCR nëse ato janë përdorur në dhomat pas PCR;nëse është e nevojshme, bëni printime të dyfishta të protokolleve/identifikimit të mostrave, etj.

4. Këshilla të përgjithshme të biologjisë molekulare

Përdorni doreza pa pluhur për të shmangur frenimin e analizës.Teknika e saktë e vendosjes me pipet është thelbësore për reduktimin e kontaminimit.Pipettimi i gabuar mund të rezultojë në spërkatje gjatë shpërndarjes së lëngjeve dhe në krijimin e aerosoleve.Praktika e mirë për vendosjen e saktë të pipetës mund të gjendet në lidhjet e mëposhtme: Udhëzues Gilson për nxjerrjen me pipetë, video të teknikës së pipetimit Anachem, Centrifugoni tubat përpara hapjes dhe hapini me kujdes për të shmangur spërkatjen.Mbyllni tubat menjëherë pas përdorimit për të shmangur futjen e ndotësve.

Kur kryeni reaksione të shumta, përgatitni një master-përzierje që përmban reagentë të zakonshëm (p.sh. ujë, dNTP, bufer, primerë dhe enzimë) për të minimizuar numrin e transferimeve të reagentëve dhe për të zvogëluar rrezikun e kontaminimit.Rekomandohet të vendosni mastermiksin në akull ose në një bllok të ftohtë.Përdorimi i një enzime Hot Start mund të ndihmojë në reduktimin e prodhimit të produkteve jo specifike.Mbroni reagentët që përmbajnë sonda fluoreshente nga drita për të shmangur degradimin.

5. Kontrollet e brendshme

Përfshini kontrolle pozitive dhe negative të karakterizuara mirë, të konfirmuara, së bashku me një kontroll pa shabllon në të gjitha reagimet dhe një linjë trendi të titruar me shumë pika për reagimet sasiore.Kontrolli pozitiv nuk duhet të jetë aq i fortë sa të përbëjë rrezik kontaminimi.Përfshini kontrollet pozitive dhe negative të nxjerrjes kur kryeni nxjerrjen e acidit nukleik.

Rekomandohet që të vendosen udhëzime të qarta në secilën prej zonave në mënyrë që përdoruesit të jenë të vetëdijshëm për rregullat e sjelljes.Laboratorët diagnostikues që zbulojnë nivele shumë të ulëta të ADN-së ose ARN-së në mostrat klinike mund të dëshirojnë të miratojnë masën shtesë të sigurisë për të pasur sisteme të veçanta të trajtimit të ajrit me presion pak pozitiv të ajrit në dhomat para PCR dhe presion pak negativ të ajrit në dhomat pas PCR.

Së fundi, zhvillimi i një plani të sigurimit të cilësisë (QA) është i dobishëm.Një plan i tillë duhet të përfshijë listat e rezervave kryesore të reagentëve dhe rezervave të punës, rregullat për ruajtjen e kompleteve dhe reagentëve, raportimin e rezultateve të kontrollit, programet e trajnimit të stafit, algoritmet e zgjidhjes së problemeve dhe veprimet korrigjuese kur nevojiten.

6. Bibliografi

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitulli 3: Vendosja e një laboratori qPCR.Një dokument udhëzues për testimin e ujërave rekreative duke përdorur metodën USEPA qPCR 1611. Universiteti Shtetëror Lansing- Michigan.

Shëndeti Publik Angli, NHS.Standardet e Mbretërisë së Bashkuar për hetimet e mikrobiologjisë: Praktikë e mirë laboratorike gjatë kryerjes së analizave të amplifikimit molekular).Udhëzues cilësor.2013; 4 (4): 1–15.

Mifflin T. Ngritja e një laboratori PCR.Cold Spring Harb Protoc.2007; 7.

Schroeder S 2013. Mirëmbajtja rutinë e centrifugave: pastrimi, mirëmbajtja dhe dezinfektimi i centrifugave, rotorëve dhe përshtatësve (Letra e bardhë nr. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Praktika e Mirë Klinike Laboratorike (GCLP) për testet me bazë molekulare të përdorura në laboratorët diagnostikues, Në: Akyar I, redaktor.Spektër të gjerë të kontrollit të cilësisë.Rijeka, Kroaci: Intech;2011: 29–52.