Molekularne detekcijske metode lahko proizvedejo veliko količino nukleinske kisline s pomnoževanjem sledov, ki jih najdemo v vzorcih.Čeprav je to koristno za omogočanje občutljivega odkrivanja, uvaja tudi možnost kontaminacije s širjenjem aerosolov za ojačanje v laboratorijskem okolju.Pri izvajanju poskusov je mogoče sprejeti ukrepe za preprečitev kontaminacije reagentov, laboratorijske opreme in prostora na mizi, saj lahko taka kontaminacija povzroči lažno pozitivne (ali lažno negativne) rezultate.

Da bi zmanjšali verjetnost kontaminacije, je treba ves čas izvajati dobro laboratorijsko prakso.Zlasti je treba upoštevati previdnostne ukrepe glede naslednjih točk:

1. Ravnanje z reagenti
2. Organizacija delovnega prostora in opreme
3. Nasveti za uporabo in čiščenje za določen molekularni prostor
4. Splošni nasveti za molekularno biologijo
5. Notranji nadzor
6. Bibliografija

1. Ravnanje z reagenti

Epruvete z reagenti pred odpiranjem na kratko centrifugirajte, da preprečite nastajanje aerosolov.Alikvotni reagenti, da preprečite večkratno zamrzovanje-odmrzovanje in kontaminacijo glavnih zalog.Jasno označite in datirajte vse reagentne in reakcijske epruvete ter vodite dnevnike serij reagenta in številk serij, uporabljenih v vseh poskusih.Odpipetirajte vse reagente in vzorce z uporabo filtrirnih konic.Pred nakupom je priporočljivo, da se pri proizvajalcu prepričate, ali konice filtra ustrezajo znamki pipete, ki jo boste uporabljali.

2. Organizacija delovnega prostora in opreme

Delovni prostor mora biti organiziran tako, da se zagotovi potek dela v eno smer, od čistih območij (pred PCR) do umazanih območij (post-PCR).Naslednji splošni previdnostni ukrepi bodo pomagali zmanjšati možnost okužbe.Imejte ločene določene prostore ali vsaj fizično ločena območja za: pripravo glavne mešanice, ekstrakcijo nukleinske kisline in dodajanje šablone DNK, pomnoževanje in ravnanje z pomnoženim izdelkom ter analizo izdelka, npr. gelsko elektroforezo.

V nekaterih okoljih je težko imeti 4 ločene sobe.Možna, a manj zaželena možnost je priprava glavne mešanice v zaprtem prostoru, npr. v komori z laminarnim tokom.V primeru ugnezdenega pomnoževanja PCR je treba pripravo glavne mešanice za drugi krog reakcije pripraviti v „čistem“ območju za pripravo glavne mešanice, vendar je treba inokulacijo s primarnim produktom PCR opraviti v prostoru za pomnoževanje in, če je mogoče, v namenskem zadrževalnem območju (npr. omara z laminarnim tokom).

Vsaka soba/območje potrebuje ločen komplet jasno označenih pipet, konic filtrov, stojala za epruvete, vorteksov, centrifug (če so ustrezne), peresa, generičnih laboratorijskih reagentov, laboratorijskih halj in škatel z rokavicami, ki ostanejo na njihovih delovnih postajah.Med premikanjem med določenimi območji si je treba umiti roke ter zamenjati rokavice in laboratorijske halje.Reagentov in opreme ne smete premikati iz umazanega območja v čisto območje.Če pride do skrajnega primera, ko je treba reagent ali kos opreme premakniti nazaj, ga je treba najprej dekontaminirati z 10 % natrijevim hipokloritom, čemur sledi brisanje s sterilno vodo.

Opomba

10-odstotno raztopino natrijevega hipoklorita je treba dnevno dopolniti.Pri uporabi za dekontaminacijo je treba upoštevati minimalni kontaktni čas 10 minut.
Če lokalna varnostna priporočila ne dovoljujejo uporabe natrijevega hipoklorita ali če natrijev hipoklorit ni primeren za dekontaminacijo kovinskih delov opreme, se lahko uporabijo tudi komercialno dostopni izdelki, ki so potrjeni kot sredstva za površinsko dekontaminacijo, ki uničujejo DNK.

V idealnem primeru bi se moralo osebje držati etosa enosmernega delovnega toka in ne iti iz umazanih območij (po PCR) nazaj na čista območja (pred PCR) na isti dan.Vendar se lahko zgodi, da je temu neizogibno.Ko se pojavi taka priložnost, mora osebje poskrbeti za temeljito umivanje rok, zamenjavo rokavic, uporabo za to namenjenega laboratorijskega plašča in ne prinašati nobene opreme, ki bi jo želeli znova odnesti iz sobe, kot so laboratorijske knjige.Takšne nadzorne ukrepe je treba poudariti pri usposabljanju osebja o molekularnih metodah.

Po uporabi je treba prostore na klopi očistiti z 10 % natrijevim hipokloritom (ki mu sledi sterilna voda za odstranitev ostankov belila), 70 % etanolom ali validiranim komercialno dostopnim dekontaminantom, ki uničuje DNK.V idealnem primeru bi bilo treba namestiti ultravijolične (UV) žarnice, ki omogočajo dekontaminacijo z obsevanjem.Vendar je treba uporabo UV žarnic omejiti na zaprta delovna območja, npr. varnostne omare, da se omeji izpostavljenost laboratorijskega osebja UV žarkom.Upoštevajte navodila proizvajalca za nego, prezračevanje in čiščenje UV žarnic, da zagotovite učinkovitost luči.

Če uporabljate 70 % etanol namesto natrijevega hipoklorita, bo za dokončanje dekontaminacije potrebno obsevanje z UV svetlobo.
Vrtinca in centrifuge ne čistite z natrijevim hipokloritom;namesto tega obrišite s 70% etanolom in izpostavite UV svetlobi ali uporabite komercialno dekontaminant, ki uničuje DNK.V primeru razlitja se obrnite na proizvajalca za nadaljnji nasvet glede čiščenja.Če navodila proizvajalca to dovoljujejo, je treba pipete redno sterilizirati v avtoklavu.Če pipet ni mogoče avtoklavirati, zadostuje, da jih očistite z 10-odstotnim natrijevim hipokloritom (čemur sledi temeljito brisanje s sterilno vodo) ali s komercialnim dekontaminantom, ki uničuje DNA, čemur sledi izpostavitev UV.

Čiščenje z visoko vsebnostjo natrijevega hipoklorita lahko sčasoma poškoduje plastiko in kovine pipete, če se izvaja redno;najprej preverite priporočila proizvajalca.Vso opremo je treba redno kalibrirati v skladu z urnikom, ki ga priporoča proizvajalec.Imenovana oseba bi morala biti odgovorna za zagotavljanje, da se upošteva razpored umerjanja, da se vodijo podrobni dnevniki in da so servisne oznake jasno prikazane na opremi.

3. Nasveti za uporabo in čiščenje za določen molekularni prostor

Predhodna PCR: Alikvotiranje reagenta/priprava glavne mešanice: To bi moral biti najčistejši od vseh prostorov, ki se uporabljajo za pripravo molekularnih poskusov, idealno pa bi morala biti določena omara z laminarnim tokom, opremljena z UV-lučjo.Na tem območju se ne sme ravnati z vzorci, ekstrahirano nukleinsko kislino in pomnoženimi produkti PCR.Reagente za pomnoževanje je treba hraniti v zamrzovalniku (ali hladilniku, v skladu s priporočili proizvajalca) v istem določenem prostoru, najbolje poleg omare z laminarnim tokom ali območja pred PCR.Rokavice je treba zamenjati vsakič, ko vstopite v prostor pred PCR ali v omarico z laminarnim tokom.

Območje pred PCR ali omarico z laminarnim tokom je treba pred uporabo in po njej očistiti na naslednji način: Obrišite vse predmete v omarici, npr. komercialno dekontaminant, ki uničuje DNK, in pustite, da se posuši.V primeru zaprtega delovnega prostora, npr. kabineta z laminarnim tokom, izpostavite napo UV svetlobi za 30 minut.

Opomba

Reagentov ne izpostavljajte UV svetlobi;v omaro jih premaknite šele, ko je čista.Če izvajate PCR z reverzno transkripcijo, je lahko tudi koristno, če površine in opremo obrišete z raztopino, ki ob stiku razgradi RNaze.To lahko pomaga preprečiti lažno negativne rezultate encimske razgradnje RNA.Po dekontaminaciji in pred pripravo mastermixa je potrebno še enkrat zamenjati rokavice in nato je omara pripravljena za uporabo.

Pre-PCR: Ekstrakcija nukleinske kisline/dodajanje predloge:

Nukleinsko kislino je treba ekstrahirati in z njo ravnati v drugem določenem območju z uporabo ločenega niza pipet, konic filtrov, stojala za epruvete, svežih rokavic, laboratorijskih plaščev in druge opreme. To območje je namenjeno tudi dodajanju predlog, kontrol in trendnih linij mastermix cevi ali plošče.Da bi se izognili kontaminaciji ekstrahiranih vzorcev nukleinske kisline, ki se analizirajo, je priporočljivo zamenjati rokavice pred rokovanjem s pozitivnimi kontrolami ali standardi in uporabiti ločen komplet pipet.Reagentov PCR in pomnoženih produktov ne smete pipetirati v tem območju.Vzorce je treba hraniti v za to namenjenih hladilnikih ali zamrzovalnikih v istem prostoru.Delovni prostor vzorca je treba očistiti na enak način kot prostor mastermixa.

Post-PCR: Pomnoževanje in ravnanje z pomnoženim izdelkom

Ta določen prostor je za postopke pomnoževanja in mora biti fizično ločen od območij pred PCR.Običajno vsebuje termociklerje in platforme v realnem času, idealno pa bi moralo imeti omaro z laminarnim tokom za dodajanje produkta PCR 1. kroga reakciji 2. kroga, če se izvaja ugnezdeni PCR.Na tem območju se ne sme rokovati z reagenti PCR in ekstrahirano nukleinsko kislino, ker je tveganje kontaminacije veliko.To območje mora imeti ločen komplet rokavic, laboratorijskih plaščev, stojal za plošče in epruvete, pipet, nastavkov filtrov, posod in druge opreme.Pred odpiranjem je treba epruvete centrifugirati.Delovni prostor vzorca je treba očistiti na enak način kot prostor mastermixa.

Post-PCR: analiza izdelka

Ta soba je namenjena opremi za odkrivanje produkta, npr. posode za elektroforezo z gelom, napajalne enote, UV transiluminator in dokumentacijski sistem za gel.To območje mora imeti ločene komplete rokavic, laboratorijske halje, stojala za plošče in epruvete, pipete, konice filtrov, posode in drugo opremo.V to območje ni dovoljeno vnašati drugih reagentov, razen barvila za nalaganje, molekularnega markerja in agaroznega gela ter komponent pufra.Delovni prostor vzorca je treba očistiti na enak način kot prostor mastermixa.

Pomembna opomba

Idealno bi bilo, da v prostore pred PCR ne bi vstopili isti dan, če je bilo delo že opravljeno v prostorih post-PCR.Če je temu povsem neizogibno, poskrbite, da si najprej temeljito umijete roke in da v sobah nosite posebne laboratorijske halje.Laboratorijske knjige in papirologije ne smete prenašati v prostore pred PCR, če so bili uporabljeni v prostorih po PCR;če je potrebno, naredite podvojene izpise protokolov/ID vzorcev itd.

4. Splošni nasveti za molekularno biologijo

Uporabljajte rokavice brez pudra, da preprečite zaviranje testa.Pravilna tehnika pipetiranja je najpomembnejša za zmanjšanje kontaminacije.Nepravilno pipetiranje lahko povzroči brizganje pri točenju tekočin in nastajanje aerosolov.Dobro prakso za pravilno pipetiranje lahko najdete na naslednjih povezavah: Gilsonov vodnik za pipetiranje, videoposnetki tehnike pipetiranja Anachem, Centrifugalne epruvete pred odpiranjem in jih previdno odprite, da preprečite brizganje.Zaprite epruvete takoj po uporabi, da preprečite vnos kontaminantov.

Pri izvajanju več reakcij pripravite eno mastermix, ki vsebuje običajne reagente (npr. vodo, dNTP, pufer, primerje in encim), da zmanjšate število prenosov reagenta in zmanjšate nevarnost kontaminacije.Priporočljivo je, da mastermix postavite na led ali hladno kocko.Uporaba encima Hot Start lahko pomaga zmanjšati proizvodnjo nespecifičnih izdelkov.Reagente, ki vsebujejo fluorescentne sonde, zaščitite pred svetlobo, da preprečite razgradnjo.

5. Notranji nadzor

Vključite dobro označene, potrjene pozitivne in negativne kontrole, skupaj s kontrolo brez šablone v vse reakcije in večtočkovno titrirano linijo trenda za kvantitativne reakcije.Pozitivna kontrola ne sme biti tako močna, da bi predstavljala tveganje za okužbo.Pri izvajanju ekstrakcije nukleinske kisline vključite pozitivne in negativne kontrole ekstrakcije.

Priporočljivo je, da so v vsakem od območij objavljena jasna navodila, da bodo uporabniki seznanjeni s pravili obnašanja.Diagnostični laboratoriji, ki odkrijejo zelo nizke ravni DNK ali RNK v kliničnih vzorcih, bodo morda želeli sprejeti dodatne varnostne ukrepe za ločene sisteme za ravnanje s zrakom z rahlo pozitivnim zračnim tlakom v prostorih pred PCR in rahlo negativnim zračnim tlakom v prostorih po PCR.

Nazadnje je v pomoč razvoj načrta za zagotavljanje kakovosti (QA).Takšen načrt mora vključevati sezname glavnih in delovnih zalog reagenta, pravila za shranjevanje kompletov in reagentov, poročanje o rezultatih nadzora, programe usposabljanja osebja, algoritme za odpravljanje težav in po potrebi popravne ukrepe.

6. Bibliografija

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Poglavje 3: Postavitev laboratorija qPCR.Dokument z navodili za testiranje rekreacijskih voda z metodo USEPA qPCR 1611. Lansing-Michigan State University.

Javno zdravje Anglije, NHS.Standardi Združenega kraljestva za mikrobiološke preiskave: dobra laboratorijska praksa pri izvajanju testov molekularne amplifikacije).Navodila za kakovost.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Postavitev laboratorija za PCR.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Redno vzdrževanje centrifug: čiščenje, vzdrževanje in dezinfekcija centrifug, rotorjev in adapterjev (Bela knjiga št. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Dobra klinična laboratorijska praksa (GCLP) za molekularne teste, ki se uporabljajo v diagnostičnih laboratorijih, v: Akyar I, urednik.Širok spekter kontrole kakovosti.Rijeka, Hrvaška: Intech;2011: 29–52.