Molekulárne detekčné metódy majú schopnosť produkovať veľký objem nukleovej kyseliny prostredníctvom amplifikácie stopových množstiev nachádzajúcich sa vo vzorkách.Aj keď je to výhodné na umožnenie citlivej detekcie, zavádza to aj možnosť kontaminácie prostredníctvom šírenia amplifikačných aerosólov v laboratórnom prostredí.Pri vykonávaní experimentov je možné prijať opatrenia na zabránenie kontaminácii činidiel, laboratórneho vybavenia a priestoru lavice, pretože takáto kontaminácia môže spôsobiť falošne pozitívne (alebo falošne negatívne) výsledky.

Aby sa znížila pravdepodobnosť kontaminácie, mala by sa vždy dodržiavať správna laboratórna prax.Konkrétne by sa mali prijať preventívne opatrenia týkajúce sa nasledujúcich bodov:

1. Manipulácia s činidlami
2. Organizácia pracovného priestoru a vybavenia
3. Rady na používanie a čistenie určeného molekulárneho priestoru
4. Všeobecné poradenstvo v oblasti molekulárnej biológie
5. Vnútorné kontroly
6. Bibliografia

1. Manipulácia s činidlami

Pred otvorením skúmavky s činidlom krátko odstreďte, aby ste zabránili tvorbe aerosólov.Alikvotné reagencie, aby sa zabránilo viacnásobnému zmrazeniu a rozmrazeniu a kontaminácii základných zásob.Všetky skúmavky a reakčné skúmavky jasne označte a označte dátumom a uchovávajte záznamy o číslach šarží a šarží použitých pri všetkých experimentoch.Všetky činidlá a vzorky napipetujte pomocou filtračných špičiek.Pred kúpou sa odporúča overiť si u výrobcu, že špičky filtra zodpovedajú použitej značke pipety.

2. Organizácia pracovného priestoru a vybavenia

Pracovný priestor by mal byť organizovaný tak, aby sa zabezpečilo, že tok práce prebieha jedným smerom, od čistých oblastí (pred PCR) po špinavé oblasti (po PCR).Nasledujúce všeobecné preventívne opatrenia pomôžu znížiť možnosť kontaminácie.Majte oddelené určené miestnosti alebo minimálne fyzicky oddelené priestory na: prípravu mastermixu, extrakciu nukleovej kyseliny a pridanie templátu DNA, amplifikáciu a manipuláciu s amplifikovaným produktom a analýzu produktu, napr. gélovú elektroforézu.

V niektorých nastaveniach je ťažké mať 4 oddelené miestnosti.Možnou, ale menej žiaducou možnosťou je pripraviť mastermix v uzavretej oblasti, napr. v komore s laminárnym tokom.V prípade nested PCR amplifikácie by mala byť príprava mastermixu pre druhé kolo reakcie pripravená v „čistej“ oblasti pre prípravu mastermixu, ale inokulácia primárnym PCR produktom by mala byť vykonaná v amplifikačnej miestnosti, a ak je to možné vo vyhradenej uzavretej oblasti (napr. skriňa s laminárnym prúdením).

Každá miestnosť/oblasť potrebuje samostatnú súpravu jasne označených pipiet, filtračných špičiek, stojanov na skúmavky, vortexov, centrifúg (ak sú relevantné), pier, všeobecných laboratórnych činidiel, laboratórnych plášťov a škatúľ rukavíc, ktoré zostanú na príslušných pracovných staniciach.Pri pohybe medzi určenými oblasťami si treba umyť ruky a vymeniť si rukavice a laboratórne plášte.Činidlá a zariadenia by sa nemali premiestňovať zo špinavého miesta do čistého.Ak nastane extrémny prípad, keď je potrebné posunúť činidlo alebo časť zariadenia dozadu, musí sa najskôr dekontaminovať 10 % chlórnanom sodným a následne utrieť sterilnou vodou.

Poznámka

10 % roztok chlórnanu sodného sa musí pripravovať denne čerstvý.Pri použití na dekontamináciu je potrebné dodržať minimálny čas kontaktu 10 minút.
Alternatívne možno použiť komerčne dostupné produkty, ktoré sú validované ako povrchové dekontaminanty ničiace DNA, ak miestne bezpečnostné odporúčania neumožňujú použitie chlórnanu sodného alebo ak chlórnan sodný nie je vhodný na dekontamináciu kovových častí zariadenia.

V ideálnom prípade by zamestnanci mali dodržiavať étos jednosmerného pracovného toku a neprechádzať zo špinavých oblastí (po PCR) späť do čistých oblastí (pred PCR) v ten istý deň.Môžu však nastať situácie, keď sa tomu nedá vyhnúť.Keď nastane takáto príležitosť, personál sa musí postarať o to, aby si dôkladne umyl ruky, vymenil si rukavice, použil na to určený laboratórny plášť a nevnášal do miestnosti žiadne vybavenie, ktoré by si chcel opäť odniesť, ako napríklad laboratórne knihy.Takéto kontrolné opatrenia by mali byť zdôraznené pri školení personálu o molekulárnych metódach.

Po použití je potrebné priestory na lavici vyčistiť 10 % chlórnanom sodným (nasledovaným sterilnou vodou na odstránenie zvyškov bielidla), 70 % etanolom alebo overeným komerčne dostupným dekontaminačným prostriedkom na ničenie DNA.V ideálnom prípade by mali byť namontované ultrafialové (UV) lampy, ktoré umožnia dekontamináciu ožiarením.Používanie UV lámp by sa však malo obmedziť na uzavreté pracovné priestory, napr. bezpečnostné skrinky, aby sa obmedzilo vystavenie personálu laboratória UV žiareniu.Dodržiavajte pokyny výrobcu týkajúce sa starostlivosti o UV lampu, vetrania a čistenia, aby lampa zostala účinná.

Ak sa namiesto chlórnanu sodného použije 70% etanol, bude potrebné na dokončenie dekontaminácie ožiarenie UV svetlom.
Nečistite vír a neodstreďujte chlórnanom sodným;namiesto toho utrite 70% etanolom a vystavte UV svetlu alebo použite komerčný dekontaminačný prostriedok na ničenie DNA.V prípade rozliatia sa obráťte na výrobcu, ktorý vám poskytne ďalšie rady na čistenie.Ak to pokyny výrobcu umožňujú, pipety by sa mali bežne sterilizovať v autokláve.Ak sa pipety nedajú autoklávovať, malo by postačovať ich očistenie 10 % chlórnanom sodným (s následným dôkladným utretím sterilnou vodou) alebo komerčným dekontaminačným prostriedkom na ničenie DNA a následným vystavením UV žiareniu.

Čistenie vysokopercentným chlórnanom sodným môže nakoniec poškodiť plasty a kovy pipety, ak sa vykonáva pravidelne;najprv skontrolujte odporúčania od výrobcu.Všetky zariadenia je potrebné pravidelne kalibrovať podľa plánu odporúčaného výrobcom.Určená osoba by mala byť zodpovedná za to, aby sa dodržiaval plán kalibrácie, aby sa uchovávali podrobné záznamy a na zariadení boli zreteľne zobrazené servisné štítky.

3. Rady na používanie a čistenie určeného molekulárneho priestoru

Pre-PCR: Rozdelenie alikvót činidiel / príprava mastermixu: Toto by malo byť najčistejšie zo všetkých priestorov používaných na prípravu molekulárnych experimentov a v ideálnom prípade by to mala byť určená skrinka s laminárnym tokom vybavená UV svetlom.V tejto oblasti sa nesmie manipulovať so vzorkami, extrahovanou nukleovou kyselinou a amplifikovanými produktmi PCR.Amplifikačné činidlá by sa mali uchovávať v mrazničke (alebo chladničke podľa odporúčaní výrobcu) v rovnakom určenom priestore, ideálne vedľa skrinky s laminárnym tokom alebo oblasti pred PCR.Rukavice by sa mali vymeniť zakaždým, keď vstúpite do oblasti pred PCR alebo do komory s laminárnym prúdením.

Oblasť pred PCR alebo skrinku s laminárnym tokom by ste mali pred a po použití vyčistiť nasledovne: Utrite všetky predmety v skrinke, napr. pipety, škatuľky na špičky, vortex, centrifúgu, stojany na skúmavky, perá atď. 70 % etanolom alebo komerčný dekontaminačný prostriedok na ničenie DNA a nechajte uschnúť.V prípade uzavretého pracovného priestoru, napr. skrinky s laminárnym prúdením, vystavte odsávač pár na 30 minút UV žiareniu.

Poznámka

Nevystavujte činidlá UV žiareniu;presuňte ich do skrinky až vtedy, keď je čistá.Pri vykonávaní reverznej transkripčnej PCR môže byť tiež užitočné utrieť povrchy a vybavenie roztokom, ktorý pri kontakte rozkladá RNázy.To môže pomôcť vyhnúť sa falošne negatívnym výsledkom enzýmovej degradácie RNA.Po dekontaminácii a pred prípravou mastermixu je potrebné rukavice ešte raz vymeniť a potom je skriňa pripravená na použitie.

Pre-PCR: Extrakcia nukleovej kyseliny/pridanie šablóny:

Nukleová kyselina sa musí extrahovať a manipulovať s ňou v druhej určenej oblasti pomocou samostatnej sady pipiet, filtračných špičiek, stojanov na skúmavky, čerstvých rukavíc, laboratórnych plášťov a ďalšieho vybavenia. Táto oblasť je tiež určená na pridanie šablón, kontrol a trendových čiar do skúmavky alebo platne na mastermix.Aby sa predišlo kontaminácii vzoriek extrahovaných nukleových kyselín, ktoré sa analyzujú, odporúča sa pred manipuláciou s pozitívnymi kontrolami alebo štandardmi vymeniť rukavice a použiť samostatnú sadu pipiet.Do tejto oblasti sa nesmú pipetovať činidlá PCR a amplifikované produkty.Vzorky by sa mali skladovať v určených chladničkách alebo mrazničkách v rovnakom priestore.Pracovný priestor vzorky by sa mal čistiť rovnakým spôsobom ako priestor mastermixu.

Post-PCR: Amplifikácia a manipulácia s amplifikovaným produktom

Tento určený priestor je určený pre procesy po amplifikácii a mal by byť fyzicky oddelený od oblastí pred PCR.Zvyčajne obsahuje termocykléry a platformy v reálnom čase av ideálnom prípade by mal mať skriňu s laminárnym tokom na pridanie produktu PCR 1. kola do reakcie 2. kola, ak sa vykonáva nested PCR.V tejto oblasti sa nesmie manipulovať s činidlami PCR a extrahovanou nukleovou kyselinou, pretože riziko kontaminácie je vysoké.Táto oblasť by mala mať samostatnú súpravu rukavíc, laboratórnych plášťov, stojanov na taniere a skúmavky, pipet, filtračných špičiek, zásobníkov a iného vybavenia.Skúmavky musia byť pred otvorením odstredené.Pracovný priestor vzorky by sa mal čistiť rovnakým spôsobom ako priestor mastermixu.

Post-PCR: Analýza produktu

Táto miestnosť je určená pre zariadenia na detekciu produktov, napr. nádrže na gélovú elektroforézu, napájacie zdroje, UV transiluminátor a systém dokumentácie gélu.Táto oblasť by mala mať samostatné súpravy rukavíc, laboratórnych plášťov, stojanov na taniere a skúmavky, pipety, filtračných špičiek, zásobníkov a iného vybavenia.Do tejto oblasti nie je možné priviesť žiadne iné činidlá, s výnimkou farbiva, molekulárneho markera a agarózového gélu a zložiek pufra.Pracovný priestor vzorky by sa mal čistiť rovnakým spôsobom ako priestor mastermixu.

Dôležitá poznámka

V ideálnom prípade by sa do miestností pred PCR nemalo vstupovať v ten istý deň, ak sa v miestnostiach po PCR už pracovalo.Ak je to úplne nevyhnutné, zaistite, aby ste si najskôr dôkladne umyli ruky a aby ste v miestnostiach nosili špeciálne laboratórne plášte.Laboratórne knihy a papiere sa nesmú brať do miestností pred PCR, ak boli použité v miestnostiach po PCR;v prípade potreby urobte duplicitné výtlačky protokolov/vzorových ID atď.

4. Všeobecné poradenstvo v oblasti molekulárnej biológie

Používajte rukavice bez púdru, aby ste zabránili inhibícii testu.Správna technika pipetovania je rozhodujúca pre zníženie kontaminácie.Nesprávne pipetovanie môže viesť k rozstrekovaniu pri dávkovaní tekutín a tvorbe aerosólov.Osvedčené postupy pre správne pipetovanie nájdete na nasledujúcich odkazoch: Gilsonov sprievodca pipetovaním, videá o technike pipetovania Anachem, Skúmavky pred otvorením odstreďte a opatrne ich otvorte, aby nedošlo k postriekaniu.Skúmavky ihneď po použití uzavrite, aby ste zabránili vneseniu kontaminantov.

Pri vykonávaní viacerých reakcií pripravte jeden mastermix obsahujúci bežné reagencie (napr. vodu, dNTP, pufor, primery a enzým), aby ste minimalizovali počet prenosov reagencií a znížili riziko kontaminácie.Odporúča sa umiestniť mastermix na ľad alebo studený blok.Použitie enzýmu Hot Start môže pomôcť znížiť produkciu nešpecifických produktov.Činidlá obsahujúce fluorescenčné sondy chráňte pred svetlom, aby ste zabránili degradácii.

5. Vnútorné kontroly

Zahrňte dobre charakterizované, potvrdené pozitívne a negatívne kontroly spolu s kontrolou bez šablóny vo všetkých reakciách a viacbodovou titrovanou trendovou čiarou pre kvantitatívne reakcie.Pozitívna kontrola by nemala byť taká silná, aby predstavovala riziko kontaminácie.Pri vykonávaní extrakcie nukleových kyselín zahrňte pozitívne a negatívne kontroly extrakcie.

Odporúča sa, aby boli v každej z oblastí umiestnené jasné pokyny, aby si používatelia boli vedomí pravidiel správania.Diagnostické laboratóriá, ktoré detegujú veľmi nízke hladiny DNA alebo RNA v klinických vzorkách, môžu chcieť prijať dodatočné bezpečnostné opatrenie, a to mať oddelené vzduchotechnické systémy s mierne pozitívnym tlakom vzduchu v miestnostiach pred PCR a mierne negatívnym tlakom vzduchu v miestnostiach po PCR.

Napokon je užitočné vypracovať plán zabezpečenia kvality (QA).Takýto plán by mal obsahovať zoznamy základných a pracovných zásob činidiel, pravidlá skladovania súprav a činidiel, podávanie správ o výsledkoch kontrol, programy školenia personálu, algoritmy na riešenie problémov a v prípade potreby nápravné opatrenia.

6. Bibliografia

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitola 3: Nastavenie laboratória qPCR.Usmerňovací dokument pre testovanie rekreačných vôd pomocou metódy USEPA qPCR 1611. Lansing-Michigan State University.

Verejné zdravie Anglicko, NHS.Normy Spojeného kráľovstva pre mikrobiologické vyšetrenia: Správna laboratórna prax pri vykonávaní molekulárnych amplifikačných testov).Usmernenie kvality.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Zriadenie laboratória PCR.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Bežná údržba centrifúg: čistenie, údržba a dezinfekcia centrifúg, rotorov a adaptérov (Biela kniha č. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Správna klinická laboratórna prax (GCLP) pre molekulárne testy používané v diagnostických laboratóriách, In: Akyar I, editor.Široké spektrum kontroly kvality.Rijeka, Chorvátsko: Intech;2011: 29.–52.