ماليڪيولر معلوم ڪرڻ جا طريقا نمونن ۾ مليل ٽريس مقدار کي وڌائڻ جي ذريعي نيوڪليڪ ايسڊ جو وڏو مقدار پيدا ڪرڻ جي صلاحيت رکن ٿا.جڏهن ته هي حساس سڃاڻپ کي چالو ڪرڻ لاءِ فائديمند آهي، اهو پڻ ليبارٽري ماحول ۾ ايمپليفڪيشن ايروسول جي پکيڙ ذريعي آلودگي جي امڪان کي متعارف ڪرايو آهي.جڏهن تجربا ڪيا وڃن، اپاءَ ورتا وڃن ته جيئن ريجنٽس، ليبارٽري جي سامان ۽ بينچ جي جاءِ جي آلودگي کان بچڻ لاءِ، جيئن ته اهڙي آلودگي غلط-مثبت (يا غلط-منفي) نتيجا پيدا ڪري سگهي ٿي.

آلودگي جي امڪان کي گهٽائڻ ۾ مدد ڏيڻ لاء، سٺي ليبارٽري مشق هر وقت استعمال ڪيو وڃي.خاص طور تي، هيٺين نقطن جي حوالي سان احتياطي اپاء وٺڻ گهرجي:

1. هينڊلنگ ريجينٽ
2. ڪم جي جڳهه ۽ سامان جي تنظيم
3. مقرر ڪيل ماليڪيولر اسپيس لاءِ استعمال ۽ صفائي جي صلاح
4. جنرل ماليڪيولر حياتيات جي صلاح
5. اندروني ڪنٽرول
6. ببليوگرافي

1. هينڊلنگ ريجينٽ

ايروسول جي نسل کان بچڻ لاءِ کولڻ کان اڳ مختصر طور سينٽرفيوج ريجينٽ ٽيوب.ڪيترن ئي منجهيل ٿڪ ۽ ماسٽر اسٽاڪ جي آلودگي کان بچڻ لاء عليڪوٽ ريجنٽس.واضح طور تي سڀني ريگينٽ ۽ رد عمل واري ٽيوب کي ليبل ۽ تاريخ ڪريو ۽ سڀني تجربن ۾ استعمال ٿيل ريگينٽ لاٽ ۽ بيچ نمبرن جا لاگ برقرار رکو.Pipette سڀ reagents ۽ نموني فلٽر ٽوٽڪا استعمال ڪندي.خريد ڪرڻ کان پهريان، اهو مشورو ڏنو ويو آهي ته صنعتڪار سان تصديق ڪريو ته فلٽر ٽائيپ استعمال ٿيڻ واري پائپ جي برانڊ سان ٺهڪي اچي ٿي.

2. ڪم جي جڳهه ۽ سامان جي تنظيم

ڪم جي جڳهه کي منظم ڪيو وڃي ته جيئن ڪم جي وهڪري هڪ طرف ٿئي، صاف علائقن (پري پي سي آر) کان گندي علائقن تائين (پوسٽ پي سي آر).هيٺ ڏنل عام احتياط سان آلودگي جي امڪان کي گهٽائڻ ۾ مدد ملندي.الڳ الڳ ڪمرا رکيا وڃن، يا گھٽ ۾ گھٽ جسماني طور تي الڳ الڳ علائقا، لاءِ: ماسٽر ميڪس تيار ڪرڻ، نيوڪليڪ ايسڊ ڪڍڻ ۽ ڊي اين اي ٽيمپليٽ جو اضافو، ايمپليفڪيشن ۽ پراڊڪٽ کي سنڀالڻ، ۽ پراڊڪٽ جو تجزيو، مثال طور جيل الیکٹروفورسس.

ڪجهه سيٽنگن ۾، 4 الڳ ڪمرا هجڻ ڏکيو آهي.هڪ ممڪن پر گهٽ گهربل آپشن اهو آهي ته ماسٽر ميڪس تياري کي ڪنٽينمينٽ واري علائقي ۾ ڪيو وڃي، مثال طور هڪ لامينار فلو ڪابينا.نسٽڊ پي سي آر ايمپليفڪيشن جي صورت ۾، ٻئي دور جي رد عمل لاءِ ماسٽر ميڪس جي تياري کي ماسٽر مڪس جي تياري لاءِ ’صاف‘ واري علائقي ۾ تيار ڪيو وڃي، پر پرائمري پي سي آر پراڊڪٽ سان انيڪوليشن کي ايمپليفڪيشن روم ۾ ڪيو وڃي، ۽ جيڪڏهن ممڪن هجي. هڪ وقف ڪنٽينمينٽ واري علائقي ۾ (مثال طور هڪ لامينار فلو ڪابينا).

هر ڪمري/ علائقي کي واضح طور تي ليبل ٿيل پائپيٽ، فلٽر ٽپس، ٽيوب ريڪ، وورٽيڪس، سينٽريفيوجز (جيڪڏهن لاڳاپيل هجي)، قلم، عام ليب ريجنٽس، ليب ڪوٽس ۽ دستانن جا دٻا گهربل آهن جيڪي انهن جي لاڳاپيل ڪم اسٽيشنن تي رهندا.هٿ ڌوئڻ گهرجن ۽ دستانا ۽ ليبارٽري کوٽ تبديل ٿيڻ وقت مقرر ٿيل علائقن جي وچ ۾ حرڪت ڪن.ريجينٽ ۽ سامان کي گندي علائقي کان صاف علائقي ڏانهن منتقل نه ڪيو وڃي.جيڪڏهن هڪ انتهائي ڪيس پيدا ٿئي جتي هڪ ريٽيجنٽ يا سامان جو ٽڪرو پوئتي موٽڻ جي ضرورت آهي، ان کي پهريان 10٪ سوڊيم هائپو ڪلورائيٽ سان صاف ڪيو وڃي، ان کان پوء جراثيم کان پاڪ پاڻي سان صاف ڪيو وڃي.

نوٽ

10٪ سوڊيم هائپوڪلورائٽ جو حل روزانو تازو ڪيو وڃي.جڏهن صفائي لاءِ استعمال ڪيو وڃي، گهٽ ۾ گهٽ رابطي جو وقت 10 منٽن تي عمل ڪيو وڃي.
متبادل طور تي، تجارتي طور تي موجود پراڊڪٽس جيڪي DNA-تباهي مٿاڇري کي ختم ڪرڻ وارن جي طور تي تصديق ٿيل آهن استعمال ڪري سگھجن ٿيون جيڪڏهن مقامي حفاظتي سفارشون سوڊيم هائپو ڪلورائيٽ جي استعمال جي اجازت نه ڏين يا جيڪڏهن سوڊيم هائيپوڪلورائٽ سامان جي دھاتي حصن کي ختم ڪرڻ لاءِ مناسب نه آهي.

مثالي طور تي، عملي کي اڻ سڌي ڪم جي وهڪري جي اخلاقيات جي پابند ٿيڻ گهرجي ۽ گندي علائقن (پوسٽ-PCR) کان واپس صاف علائقن (PCR کان اڳ) ساڳئي ڏينهن تي نه وڃڻ گهرجي.بهرحال، اهڙا موقعا ٿي سگهن ٿا جڏهن اهو ناگزير آهي.جڏهن اهڙو موقعو پيدا ٿئي، اهلڪارن کي احتياط سان هٿ ڌوئڻ، دستانا تبديل ڪرڻ، مقرر ڪيل ليب ڪوٽ استعمال ڪرڻ ۽ ڪو به سامان متعارف نه ڪرائڻ گهرجي، جيڪو هو ٻيهر ڪمري مان ٻاهر ڪڍڻ چاهين، جهڙوڪ ليبارٽري ڪتاب.اهڙن ڪنٽرول قدمن تي زور ڏنو وڃي عملي جي تربيت ۾ ماليڪيولر طريقن تي.

استعمال ڪرڻ کان پوءِ، بينچ جي جاءِ کي 10٪ سوڊيم هائيپو ڪلورائيٽ سان صاف ڪيو وڃي (بعد ۾ رهجي ويل بليچ کي هٽائڻ لاءِ جراثيم کان پاڪ پاڻي)، 70٪ ايٿانول، يا تجارتي طور تي دستياب ٿيل ڊي اين اي-تباهي ڪندڙ ڊيڪونٽيمننٽ.مثالي طور تي، الٽرا وائلٽ (UV) بتيون نصب ٿيڻ گهرجن ته جيئن شعاعن کي صاف ڪرڻ لاءِ.بهرحال، UV ليمپ جو استعمال بند ڪم ڪندڙ علائقن تائين محدود هجڻ گهرجي، مثال طور حفاظتي ڪابينا، ليبارٽري اسٽاف جي UV نمائش کي محدود ڪرڻ لاء.مھرباني ڪري يو وي ليمپ جي سنڀال، وينٽيليشن ۽ صفائي لاءِ ٺاھيندڙ جي ھدايتن تي عمل ڪريو ته جيئن ليمپ اثرائتو رھن.

جيڪڏهن سوڊيم هائيپوڪلورائيٽ جي بدران 70٪ ايٿانول استعمال ڪيو وڃي ته، صفائي کي مڪمل ڪرڻ لاءِ UV روشني سان شعاع جي ضرورت پوندي.
vortex ۽ centrifuge sodium hypochlorite سان صاف نه ڪريو؛ان جي بدران، 70٪ ايٿانول سان صاف ڪريو ۽ يووي لائيٽ کي بي نقاب ڪريو، يا تجارتي ڊي اين اي کي تباهه ڪرڻ واري ڊڪشنري استعمال ڪريو.اسپيل لاء، وڌيڪ صفائي جي مشوري لاء ٺاهيندڙ سان چيڪ ڪريو.جيڪڏھن ٺاھيندڙ ھدايتون ان کي اجازت ڏين ٿيون، پائيپٽس کي باقاعدي طور تي آٽوڪليو ذريعي جراثيم ڪش ڪيو وڃي.جيڪڏهن پائپن کي آٽو ڪليوڊ نٿو ڪري سگهجي، انهن کي 10٪ سوڊيم هائيپوڪلورائيٽ سان صاف ڪرڻ لاءِ ڪافي آهي (جنهن بعد جراثيم کان پاڪ پاڻي سان چڱيءَ طرح صاف ڪيو وڃي ٿو) يا هڪ تجارتي ڊي اين اي-تباهه ڪرڻ واري ڊيڪونٽيمننٽ سان ۽ بعد ۾ يو وي جي نمائش.

اعلي فيصد سوڊيم هائيپوڪلورائٽ سان صفائي آخرڪار پائپيٽ پلاسٽڪ ۽ ڌاتو کي نقصان پهچائي سگھي ٿي جيڪڏهن باقاعده بنياد تي ڪيو وڃي.پهرين ٺاهيندڙ کان سفارشون چيڪ ڪريو.ٺاهيندڙن جي تجويز ڪيل شيڊول مطابق سڀني سامان کي باقاعده حساب سان ترتيب ڏيڻ جي ضرورت آهي.هڪ نامزد ٿيل شخص کي انچارج هجڻ گهرجي انهي کي يقيني بڻائڻ ته انشانکن شيڊول تي عمل ڪيو ويو آهي، تفصيلي لاگز برقرار رکيا ويا آهن، ۽ سروس ليبل واضح طور تي سامان تي ڏيکاريل آهن.

3. مقرر ڪيل ماليڪيولر اسپيس لاءِ استعمال ۽ صفائي جي صلاح

Pre-PCR: ريجنٽ aliquoting / mastermix جي تياري: هي ماليڪيولر تجربن جي تياري لاءِ استعمال ٿيندڙ سڀني جڳهن مان صاف هجڻ گهرجي ۽ مثالي طور تي يو وي لائيٽ سان ليس ٿيل ليمينار فلو ڪابينا هجڻ گهرجي.نموني، نڪتل نيوڪلڪ ايسڊ ۽ ايمپليفائيڊ پي سي آر پروڊڪٽس کي هن علائقي ۾ هٿ نه ڪيو وڃي.ايمپليفڪيشن ريجينٽس کي فريزر ۾ رکڻ گهرجي (يا فرج ۾، ٺاهيندڙن جي سفارشن موجب) ساڳي مخصوص جاءِ تي، مثالي طور تي لامينار فلو ڪيبينيٽ يا پري-PCR ايريا جي اڳيان.PCR کان اڳ واري علائقي يا ليمينار جي وهڪري جي ڪابينا ۾ داخل ٿيڻ تي دستانا هر دفعي تبديل ٿيڻ گهرجن.

پري پي سي آر ايريا يا ليمينار فلو ڪيبنٽ کي استعمال ڪرڻ کان اڳ ۽ بعد ۾ صاف ڪرڻ گهرجي: ڪيبنٽ ۾ موجود سڀني شين کي صاف ڪريو، مثال طور، پائيپٽ، ٽپ باڪس، وورٽيڪس، سينٽريفيوج، ٽيوب ريڪ، قلم وغيره 70٪ ايٿانول سان تجارتي ڊي اين اي-تباهي ڪندڙ decontaminant، ۽ سڪي وڃڻ جي اجازت ڏين ٿا.بند ڪم ڪرڻ واري علائقي جي صورت ۾، مثال طور، هڪ لامينار فلو ڪيبنٽ، 30 منٽن لاء هود کي UV روشني ڏانهن وڌايو.

نوٽ

ريگينٽس کي UV لائيٽ کي بي نقاب نه ڪريو؛صرف انھن کي ڪابينا ۾ منتقل ڪريو جڏھن اھو صاف آھي.جيڪڏهن ريورس ٽرانسڪرپشن پي سي آر کي انجام ڏيو، اهو پڻ مددگار ثابت ٿي سگهي ٿو سطحن ۽ سامان کي هڪ حل سان صاف ڪرڻ لاء جيڪو رابطي تي RNases کي ٽوڙي ٿو.اهو آر اين اي جي اينزيم جي تباهي کان غلط-منفي نتيجن کان بچڻ ۾ مدد ڪري سگھي ٿي.decontamination کان پوء ۽ ماسٽرمڪس تيار ڪرڻ کان اڳ، دستانو هڪ ڀيرو ٻيهر تبديل ڪيو وڃي، ۽ پوء ڪابينا استعمال ڪرڻ لاء تيار آهي.

اڳ-پي سي آر: نيوڪليڪ ايسڊ ڪڍڻ / ٽيمپليٽ اضافو:

نيوڪليڪ ايسڊ کي هڪ ٻئي مقرر ڪيل علائقي ۾ ڪڍيو وڃي ۽ هٿ ڪيو وڃي، پائپن جو هڪ الڳ سيٽ، فلٽر ٽپس، ٽيوب ريڪ، تازو دستانا، ليب ڪوٽس ۽ ٻيا سامان استعمال ڪندي. هي علائقو ٽيمپليٽ، ڪنٽرول ۽ رجحان لائنن جي اضافي لاءِ پڻ آهي. ماسٽرمڪس ٽيوب يا پليٽ.ڪڍيل نيوڪلڪ ايسڊ جي نمونن جي آلودگي کان بچڻ لاءِ جن جو تجزيو ڪيو پيو وڃي، اها سفارش ڪئي وئي آهي ته مثبت ڪنٽرولن يا معيارن کي سنڀالڻ کان اڳ دستانو تبديل ڪيو وڃي ۽ پائپن جو هڪ الڳ سيٽ استعمال ڪيو وڃي.پي سي آر ريجنٽس ۽ امپلائيڊ پراڊڪٽس کي هن علائقي ۾ پائپ نه ڪيو وڃي.نموني کي ساڳئي علائقي ۾ نامزد ٿيل فرج يا فريزر ۾ ذخيرو ڪرڻ گهرجي.نموني ڪم جي جڳهه کي صاف ڪيو وڃي جيئن ماسٽر ميڪس اسپيس وانگر.

پوسٽ-پي سي آر: ايمپليفڪيشن پراڊڪٽ کي هٿي ڏيڻ ۽ سنڀالڻ

هي نامزد ڪيل جڳهه پوسٽ-ايمپليفڪيشن جي عملن لاءِ آهي ۽ جسماني طور تي پي سي آر کان اڳ واري علائقن کان الڳ هجڻ گهرجي.اهو عام طور تي thermocyclers ۽ حقيقي وقت پليٽ فارمن تي مشتمل آهي، ۽ مثالي طور تي گول 1 PCR پراڊڪٽ کي گول 2 جي رد عمل ۾ شامل ڪرڻ لاءِ هڪ ليمينار فلو ڪابينا هجڻ گهرجي، جيڪڏهن nested PCR ڪيو پيو وڃي.PCR ريجنٽس ۽ نڪتل نيوڪلڪ ايسڊ کي هن علائقي ۾ هٿ نه ڪيو وڃي ڇاڪاڻ ته آلودگي جو خطرو تمام گهڻو آهي.هن علائقي ۾ دستانو، ليبارٽري ڪوٽا، پليٽ ۽ ٽيوب ريڪ، پائپيٽ، فلٽر ٽپس، بِن ۽ ٻين سامان جو هڪ الڳ سيٽ هجڻ گهرجي.ٽيوب کولڻ کان اڳ سينٽرفيوج ٿيڻ گهرجي.نموني ڪم جي جڳهه کي صاف ڪيو وڃي جيئن ماسٽر ميڪس اسپيس وانگر.

پوسٽ-پي سي آر: پيداوار جو تجزيو

هي ڪمرو پراڊڪٽ جي سڃاڻپ جي سامان لاءِ آهي، مثال طور جيل اليڪٽرروفورسس ٽينڪ، پاور پيڪ، يو وي ٽرانزيلوميٽر ۽ جيل دستاويزي نظام.هن علائقي ۾ دستانو، ليبارٽري ڪوٽا، پليٽ ۽ ٽيوب ريڪ، پائپيٽ، فلٽر ٽپس، بِن ۽ ٻيو سامان جو الڳ سيٽ هجڻ گهرجي.هن علائقي ۾ ٻيو ڪو به ريجينٽ نه ٿو آڻي سگهجي، سواءِ لوڊنگ ڊائي، ماليڪيولر مارڪر ۽ اگروز جيل، ۽ بفر اجزاء.نموني ڪم جي جڳهه کي صاف ڪيو وڃي جيئن ماسٽر ميڪس اسپيس وانگر.

اهم نوٽ

مثالي طور تي، پي سي آر کان اڳ واري ڪمرن ۾ ساڳئي ڏينهن داخل نه ٿيڻ گهرجي جيڪڏهن ڪم اڳ ۾ ئي پي سي آر کان پوءِ ڪمرن ۾ ڪيو ويو آهي.جيڪڏهن اهو مڪمل طور تي ناگزير آهي، پڪ ڪريو ته هٿ پهرين چڱي طرح ڌويا ويا آهن ۽ مخصوص ليب کوٽ ڪمرن ۾ پائڻ وارا آهن.ليبارٽري ڪتاب ۽ ڪاغذن کي پري پي سي آر ڪمرن ۾ نه ورتو وڃي جيڪڏهن اهي پوسٽ پي سي آر رومن ۾ استعمال ڪيا ويا آهن؛جيڪڏهن ضروري هجي ته، پروٽوڪول/نموني IDs وغيره جا نقلي پرنٽ آئوٽ وٺو.

4. جنرل ماليڪيولر حياتيات جي صلاح

پاؤڊر-آزاد دستانو استعمال ڪريو پردي جي نمائش کان بچڻ لاء.صحيح پائپنگ ٽيڪنڪ آلودگي کي گهٽائڻ لاء اهم آهي.غلط پائپنگ جو نتيجو ٿي سگھي ٿو ڦاٿل جڏهن مائع ۽ ايروسول ٺاهڻ.صحيح پائپنگ لاءِ سٺي مشق هيٺ ڏنل لنڪ تي ملي سگهي ٿي: پائپنگ لاءِ گلسن گائيڊ، انيڪيم پائپنگ ٽيڪنڪ ويڊيوز، سينٽرفيوج ٽيوب کولڻ کان اڳ، ۽ انهن کي احتياط سان کوليو ته جيئن ڦاٽڻ کان بچڻ لاءِ.آلودگي جي تعارف کان بچڻ لاء استعمال ڪرڻ کان پوء فوري طور تي ٽيوب بند ڪريو.

جڏهن هڪ کان وڌيڪ رد عمل انجام ڏيو، هڪ ماسٽر ميڪس تيار ڪريو جنهن ۾ عام ريجينٽ شامل آهن (مثال طور پاڻي، ڊي اين ٽي پي، بفر، پرائمر ۽ اينزيم) ريجنٽ جي منتقلي جي تعداد کي گھٽائڻ ۽ آلودگي جي خطري کي گھٽائڻ لاء.اهو سفارش آهي ته ماسٽر ميڪس کي برف يا ٿڌي بلاڪ تي قائم ڪرڻ لاء.گرم شروع ڪرڻ واري اينزيم جو استعمال غير مخصوص شين جي پيداوار کي گهٽائڻ ۾ مدد ڪري سگھي ٿي.تباهي کان بچڻ لاءِ فلورسنٽ پروبس تي مشتمل ريجنن کي روشنيءَ کان بچايو.

5. اندروني ڪنٽرول

سڀني رد عملن ۾ بي ٽيمپليٽ ڪنٽرول، ۽ مقداري رد عمل لاءِ ملٽي پوائنٽ ٽائيٽل ٽرينڊ لائن سان گڏ چڱي خاصي، تصديق ٿيل مثبت ۽ منفي ڪنٽرول شامل ڪريو.مثبت ڪنٽرول ايترو مضبوط نه هجڻ گهرجي ته اهو آلودگي جو خطرو پيدا ڪري.شامل ڪريو مثبت ۽ منفي ڪڍڻ وارا ڪنٽرول جڏهن نيوڪليڪ ايسڊ ڪڍڻ کي انجام ڏيو.

اها سفارش ڪئي وئي آهي ته واضح هدايتون هر هڪ علائقن ۾ پوسٽ ڪيون وڃن ته جيئن صارف ضابطن جي ضابطن کان واقف هجن.تشخيصي ليبارٽريون جيڪي ڪلينڪل نمونن ۾ ڊي اين اي يا آر اين اي جي تمام گهٽ سطحن جي نشاندهي ڪن ٿيون شايد اضافي حفاظتي قدمن کي اپنائڻ چاهين ٿيون الڳ ايئر هينڊلنگ سسٽم هجڻ سان پري پي سي آر ڪمرن ۾ ٿورڙو مثبت هوا جو دٻاءُ ۽ پي سي آر کان پوءِ ڪمرن ۾ ٿورو منفي هوا جو دٻاءُ.

آخرڪار، هڪ معيار کي يقيني بڻائڻ (QA) منصوبو مددگار آهي.اهڙي منصوبي ۾ شامل ٿيڻ گهرجي ريجنٽ ماسٽر اسٽاڪ ۽ ڪم ڪندڙ اسٽاڪ جي فهرستن، ڪٽس ۽ ريگينٽس کي اسٽوريج لاءِ ضابطا، ڪنٽرول جي نتيجن جي رپورٽنگ، اسٽاف ٽريننگ پروگرام، مسئلن جي حل ڪرڻ واري الگورتھم، ۽ ضرورت جي صورت ۾ اصلاحي عمل.

6. ببليوگرافي

Aslan A، Kinzelman J، Dreelin E، Anan'eva T، Lavander J. باب 3: هڪ qPCR ليبارٽري قائم ڪرڻ.USEPA qPCR ميٿڊ 1611 استعمال ڪندي تفريحي پاڻي جي جانچ لاءِ ھدايت وارو دستاويز. لينسنگ- مشي گن اسٽيٽ يونيورسٽي.

پبلڪ هيلٿ انگلينڊ، NHS.يو جي معيارن لاءِ مائڪرو بائيولوجيجي تحقيقات: سٺي ليبارٽري مشق جڏهن ماليڪيولر امپليفڪيشن اسيس کي انجام ڏيو).معيار جي هدايت.2013؛ 4 (4): 1-15.

Mifflin T. PCR ليبارٽري قائم ڪرڻ.ٿڌي بهار هارب پروٽوڪول.2007؛ 7.

Schroeder S 2013. Centrifuges جي روزاني سار سنڀال: سينٽرفيوجز، روٽرز ۽ اڊاپٽرز جي صفائي، سار سنڀال ۽ ڊس انفڪشن (وائيٽ پيپر نمبر 14).هيمبرگ: Eppendorf;2013.

ويانا آر وي، والس سي ايل.گڊ ڪلينيڪل ليبارٽري پريڪٽس (GCLP) تشخيصي ليبارٽريز ۾ استعمال ٿيندڙ ماليڪيولر بيسڊ ٽيسٽن لاءِ، ان ۾: اڪيار آءِ، ايڊيٽر.معيار جي ڪنٽرول جي وسيع اسپيڪٽرا.Rijeka, Croatia: Intech;2011: 29-52.