Metodele de detecție moleculară au capacitatea de a produce un volum mare de acid nucleic prin amplificarea urmelor găsite în probe.Deși acest lucru este benefic pentru a permite detectarea sensibilă, introduce, de asemenea, posibilitatea contaminării prin răspândirea aerosolilor de amplificare în mediul de laborator.La efectuarea experimentelor, pot fi luate măsuri pentru a evita contaminarea reactivilor, a echipamentului de laborator și a spațiului de lucru, deoarece o astfel de contaminare poate genera rezultate fals pozitive (sau fals negative).

Pentru a ajuta la reducerea probabilității contaminării, bunele practici de laborator trebuie exercitate în orice moment.În mod specific, trebuie luate măsuri de precauție cu privire la următoarele puncte:

1. Manipularea reactivilor
2. Organizarea spațiului de lucru și a echipamentelor
3. Sfaturi de utilizare și curățare pentru spațiul molecular desemnat
4. Sfaturi generale de biologie moleculară
5. Controale interne
6. Bibliografie

1. Manipularea reactivilor

Centrifugați scurt tuburile de reactiv înainte de deschidere pentru a evita generarea de aerosoli.Reactivi alicoți pentru a evita mai multe îngheț-dezgheț și contaminarea stocurilor principale.Etichetați și datați în mod clar toate reactivii și tuburile de reacție și mențineți registrele de lot de reactiv și numere de lot utilizate în toate experimentele.Pipetați toți reactivii și probele folosind vârfuri de filtru.Înainte de cumpărare, este recomandabil să confirmați cu producătorul că vârfurile filtrului se potrivesc cu marca de pipetă care va fi utilizată.

2. Organizarea spațiului de lucru și a echipamentelor

Spațiul de lucru ar trebui să fie organizat pentru a se asigura că fluxul de lucru are loc într-o singură direcție, de la zonele curate (pre-PCR) la zonele murdare (post-PCR).Următoarele precauții generale vor ajuta la reducerea șanselor de contaminare.Să aibă camere separate sau cel puțin zone separate fizic, pentru: prepararea amestecului principal, extracția acidului nucleic și adăugarea șablonului ADN, amplificarea și manipularea produsului amplificat și analiza produsului, de exemplu electroforeza pe gel.

În unele situații, a avea 4 camere separate este dificil.O opțiune posibilă, dar mai puțin de dorit, este să faceți prepararea mastermix-ului într-o zonă de izolare, de exemplu, un dulap cu flux laminar.În cazul amplificării prin PCR imbricată, pregătirea mix-ului principal pentru a doua rundă de reacție ar trebui să fie pregătită în zona „curată” pentru prepararea mixului master, dar inocularea cu produsul PCR primar trebuie făcută în camera de amplificare și, dacă este posibil într-o zonă de izolare dedicată (de exemplu, un dulap cu flux laminar).

Fiecare cameră/zonă are nevoie de un set separat de pipete, vârfuri de filtre, suporturi pentru tuburi, vortexuri, centrifuge (dacă este cazul), pixuri, reactivi generici de laborator, halate de laborator și cutii cu mănuși etichetate clar, care vor rămâne la stațiile de lucru respective.Mâinile trebuie spălate, iar mănușile și halatele de laborator trebuie schimbate atunci când vă deplasați între zonele desemnate.Reactivii și echipamentele nu trebuie mutate dintr-o zonă murdară într-o zonă curată.În cazul în care apare un caz extrem în care un reactiv sau un echipament trebuie mutat înapoi, acesta trebuie mai întâi decontaminat cu hipoclorit de sodiu 10%, urmat de o ștergere cu apă sterilă.

Notă

Soluția de hipoclorit de sodiu 10% trebuie preparată proaspătă zilnic.Când este utilizat pentru decontaminare, trebuie respectat un timp de contact minim de 10 minute.
Alternativ, produsele disponibile comercial care sunt validate ca decontaminanți de suprafață care distrug ADN-ul pot fi utilizate dacă recomandările locale de siguranță nu permit utilizarea hipocloritului de sodiu sau dacă hipocloritul de sodiu nu este adecvat pentru decontaminarea părților metalice ale echipamentelor.

În mod ideal, personalul ar trebui să respecte etosul fluxului de lucru unidirecțional și să nu treacă din zonele murdare (post-PCR) înapoi în zonele curate (pre-PCR) în aceeași zi.Cu toate acestea, pot exista ocazii în care acest lucru este inevitabil.Când apare o astfel de ocazie, personalul trebuie să aibă grijă să se spele bine pe mâini, să schimbe mănușile, să folosească halatul de laborator desemnat și să nu introducă niciun echipament pe care vor dori să-l scoată din nou din cameră, cum ar fi cărțile de laborator.Astfel de măsuri de control ar trebui să fie accentuate în pregătirea personalului cu privire la metodele moleculare.

După utilizare, spațiile de bancă trebuie curățate cu hipoclorit de sodiu 10% (urmat de apă sterilă pentru a îndepărta înălbitorul rezidual), etanol 70% sau cu un decontaminant care distruge ADN-ul validat disponibil comercial.În mod ideal, lămpile cu ultraviolete (UV) ar trebui să fie montate pentru a permite decontaminarea prin iradiere.Cu toate acestea, utilizarea lămpilor UV ar trebui limitată la zonele de lucru închise, de exemplu dulapuri de siguranță, pentru a limita expunerea la UV a personalului din laborator.Vă rugăm să respectați instrucțiunile producătorului pentru îngrijirea, ventilarea și curățarea lămpilor UV pentru a vă asigura că lămpile rămân eficiente.

Dacă se utilizează etanol 70% în loc de hipoclorit de sodiu, va fi necesară iradierea cu lumină UV pentru a finaliza decontaminarea.
Nu curățați vortexul și centrifugați cu hipoclorit de sodiu;în schimb, ștergeți cu 70% etanol și expuneți la lumină UV sau utilizați un decontaminant comercial care distruge ADN-ul.Pentru scurgeri, consultați producătorul pentru sfaturi suplimentare de curățare.Dacă instrucțiunile producătorului permit acest lucru, pipetele trebuie sterilizate în mod obișnuit prin autoclavă.Dacă pipetele nu pot fi autoclavate, ar trebui să fie suficient să le curățați cu hipoclorit de sodiu 10% (urmat de o ștergere temeinică cu apă sterilă) sau cu un decontaminant comercial care distruge ADN-ul urmat de expunere la UV.

Curățarea cu un procent ridicat de hipoclorit de sodiu poate deteriora materialele plastice și metalele pipetei dacă se face în mod regulat;verificați mai întâi recomandările producătorului.Toate echipamentele trebuie calibrate în mod regulat conform programului recomandat de producător.O persoană desemnată ar trebui să fie responsabilă de a se asigura că programul de calibrare este respectat, că sunt păstrate jurnalele detaliate și că etichetele de service sunt afișate clar pe echipament.

3. Sfaturi de utilizare și curățare pentru spațiul molecular desemnat

Pre-PCR: Alicotare reactiv/preparare mastermix: Acesta ar trebui să fie cel mai curat dintre toate spațiile utilizate pentru pregătirea experimentelor moleculare și, în mod ideal, ar trebui să fie un cabinet cu flux laminar desemnat, echipat cu lumină UV.Eșantioanele, acidul nucleic extras și produsele PCR amplificate nu trebuie manipulate în această zonă.Reactivii de amplificare trebuie păstrați într-un congelator (sau frigider, conform recomandărilor producătorului) în același spațiu desemnat, în mod ideal lângă dulapul cu flux laminar sau zona pre-PCR.Mănușile trebuie schimbate de fiecare dată la intrarea în zona pre-PCR sau în cabinetul cu flux laminar.

Zona pre-PCR sau dulapul cu flux laminar trebuie curățat înainte și după utilizare, după cum urmează: Ștergeți toate articolele din dulap, de exemplu pipete, cutii cu vârfuri, vortex, centrifugă, suporturi pentru tuburi, stilouri etc. cu etanol 70% sau un decontaminant comercial care distruge ADN-ul și lăsați să se usuce.În cazul unei zone de lucru închise, de exemplu un dulap cu flux laminar, expuneți hota la lumină UV timp de 30 de minute.

Notă

Nu expuneți reactivii la lumina UV;mutați-le în dulap numai după ce este curat.Dacă se efectuează PCR cu transcripție inversă, poate fi de asemenea util să ștergeți suprafețele și echipamentele cu o soluție care descompune RNazele la contact.Acest lucru poate ajuta la evitarea rezultatelor fals negative din degradarea enzimatică a ARN.După decontaminare și înainte de pregătirea mastermix-ului, mănușile trebuie schimbate încă o dată, iar apoi dulapul este gata de utilizare.

Pre-PCR: Extracția acidului nucleic/adăugarea șablonului:

Acidul nucleic trebuie extras și manipulat într-o a doua zonă desemnată, folosind un set separat de pipete, vârfuri de filtre, suporturi pentru tuburi, mănuși proaspete, halate de laborator și alte echipamente. Această zonă este, de asemenea, pentru adăugarea de șablon, controale și linii de tendință la tuburi sau plăci mastermix.Pentru a evita contaminarea probelor de acid nucleic extrase care sunt analizate, se recomandă schimbarea mănușilor înainte de a manipula controalele pozitive sau standardele și utilizarea unui set separat de pipete.Reactivii PCR și produsele amplificate nu trebuie pipetate în această zonă.Probele trebuie depozitate în frigidere sau congelatoare desemnate în aceeași zonă.Spațiul de lucru eșantion trebuie curățat în același mod ca și spațiul mastermix.

Post-PCR: Amplificarea și manipularea produsului amplificat

Acest spațiu desemnat este pentru procesele de post-amplificare și ar trebui să fie separat fizic de zonele pre-PCR.De obicei, conține termocicloare și platforme în timp real și, în mod ideal, ar trebui să aibă un dulap cu flux laminar pentru adăugarea produsului PCR runda 1 la reacția runda 2, dacă se efectuează PCR imbricată.Reactivii PCR și acidul nucleic extras nu trebuie manipulați în această zonă, deoarece riscul de contaminare este mare.Această zonă ar trebui să aibă un set separat de mănuși, halate de laborator, suporturi pentru plăci și tuburi, pipete, vârfuri de filtre, recipiente și alte echipamente.Tuburile trebuie centrifugate înainte de deschidere.Spațiul de lucru eșantion trebuie curățat în același mod ca și spațiul mastermix.

Post-PCR: Analiza produsului

Această cameră este destinată echipamentelor de detectare a produselor, de exemplu rezervoare de electroforeză cu gel, blocuri de alimentare, transiluminator UV și sistemul de documentare a gelului.Această zonă ar trebui să aibă seturi separate de mănuși, halate de laborator, suporturi pentru plăci și tuburi, pipete, vârfuri de filtre, recipiente și alte echipamente.Nu pot fi introduși alți reactivi în această zonă, cu excepția colorantului de încărcare, a markerului molecular și a gelului de agaroză și a componentelor tampon.Spațiul de lucru eșantion trebuie curățat în același mod ca și spațiul mastermix.

Notă importantă

În mod ideal, în sălile de pre-PCR nu ar trebui să intre în aceeași zi dacă s-a lucrat deja în sălile post-PCR.Dacă acest lucru este complet inevitabil, asigurați-vă că mâinile sunt mai întâi spălate bine și că în încăperi sunt purtate halate de laborator specifice.Cărțile de laborator și documentele nu trebuie să fie duse în sălile pre-PCR dacă au fost folosite în sălile post-PCR;dacă este necesar, faceți copii tipărite ale protocoalelor/eșantioanelor de ID-uri etc.

4. Sfaturi generale de biologie moleculară

Utilizați mănuși fără pudră pentru a evita inhibarea testului.Tehnica corectă de pipetare este esențială pentru reducerea contaminării.Pipetarea incorectă poate duce la stropire la distribuirea lichidelor și la formarea de aerosoli.O bună practică pentru pipetarea corectă poate fi găsită la următoarele link-uri: Ghidul Gilson pentru pipetare, Videoclipuri cu tehnica de pipetare Anachem, Tuburile de centrifugare înainte de deschidere și deschideți-le cu atenție pentru a evita stropirea.Închideți tuburile imediat după utilizare pentru a evita introducerea de contaminanți.

Când efectuați mai multe reacții, pregătiți un mastermix care conține reactivi obișnuiți (de exemplu apă, dNTP, tampon, primeri și enzime) pentru a minimiza numărul de transferuri de reactiv și pentru a reduce amenințarea de contaminare.Se recomandă instalarea mastermix-ului pe gheață sau un bloc rece.Utilizarea unei enzime Hot Start poate ajuta la reducerea producției de produse nespecifice.Protejați reactivii care conțin sonde fluorescente de lumină pentru a evita degradarea.

5. Controale interne

Includeți controale pozitive și negative bine caracterizate, confirmate, împreună cu un control fără șablon în toate reacțiile și o linie de tendință titrată în mai multe puncte pentru reacțiile cantitative.Controlul pozitiv nu trebuie să fie atât de puternic încât să prezinte un risc de contaminare.Includeți controale de extracție pozitive și negative atunci când efectuați extracția acidului nucleic.

Se recomandă ca în fiecare dintre zone să fie postate instrucțiuni clare, astfel încât utilizatorii să cunoască regulile de conduită.Laboratoarele de diagnosticare care detectează niveluri foarte scăzute de ADN sau ARN în probele clinice ar putea dori să adopte măsura de securitate suplimentară de a avea sisteme separate de tratare a aerului cu presiune a aerului ușor pozitivă în camerele pre-PCR și presiunea aerului ușor negativă în camerele post-PCR.

În cele din urmă, dezvoltarea unui plan de asigurare a calității (QA) este utilă.Un astfel de plan ar trebui să includă liste de stocuri principale de reactivi și stocuri de lucru, reguli pentru depozitarea truselor și reactivilor, raportarea rezultatelor controlului, programe de formare a personalului, algoritmi de depanare și acțiuni de remediere atunci când este necesar.

6. Bibliografie

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Capitolul 3: Setarea unui laborator qPCR.Un document de orientare pentru testarea apelor de agrement folosind metoda USEPA qPCR 1611. Lansing- Michigan State University.

Sănătate Publică Anglia, NHS.Standarde din Regatul Unit pentru investigațiile microbiologice: Bună practică de laborator atunci când se efectuează teste de amplificare moleculară).Ghid de calitate.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Înființarea unui laborator PCR.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Întreținerea de rutină a centrifugelor: curățarea, întreținerea și dezinfectarea centrifugelor, rotoarelor și adaptoarelor (Cartea albă nr. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Bună practică clinică de laborator (GCLP) pentru testele bazate pe moleculare utilizate în laboratoarele de diagnostic, În: Akyar I, editor.Spectre largi de control al calității.Rijeka, Croația: Intech;2011: 29–52.