Os métodos de detecção molecular têm a capacidade de produzir um grande volume de ácido nucleico através da amplificação de quantidades vestigiais encontradas nas amostras.Embora isso seja benéfico para permitir a detecção sensível, também introduz a possibilidade de contaminação por meio da disseminação de aerossóis de amplificação no ambiente de laboratório.Ao realizar experimentos, medidas podem ser tomadas para evitar a contaminação de reagentes, equipamentos de laboratório e espaço de bancada, pois tal contaminação pode gerar resultados falso-positivos (ou falso-negativos).

Para ajudar a reduzir a probabilidade de contaminação, as Boas Práticas de Laboratório devem ser aplicadas em todos os momentos.Especificamente, precauções devem ser tomadas em relação aos seguintes pontos:

1. Manuseio de reagentes
2. Organização do espaço de trabalho e equipamentos
3. Recomendações de uso e limpeza para o espaço molecular designado
4. Conselhos gerais de biologia molecular
5. Controles internos
6. Bibliografia

1. Manuseio de reagentes

Centrifugue brevemente os tubos de reagente antes de abrir para evitar a geração de aerossóis.Aliquote os reagentes para evitar múltiplos congelamentos e descongelamentos e a contaminação dos estoques mestres.Etiquete e date claramente todos os tubos de reagentes e de reação e mantenha os registros dos lotes de reagentes e números de lotes usados ​​em todos os experimentos.Pipete todos os reagentes e amostras usando ponteiras com filtro.Antes da compra, é aconselhável confirmar com o fabricante se as ponteiras com filtro são adequadas para a marca da pipeta a ser utilizada.

2. Organização do espaço de trabalho e equipamentos

O espaço de trabalho deve ser organizado para garantir que o fluxo de trabalho ocorra em uma direção, das áreas limpas (pré-PCR) para as áreas sujas (pós-PCR).As seguintes precauções gerais ajudarão a reduzir a chance de contaminação.Tenha salas designadas separadas ou, no mínimo, áreas separadas fisicamente, para: preparação de mastermix, extração de ácido nucleico e adição de modelo de DNA, amplificação e manuseio de produto amplificado e análise de produto, por exemplo, eletroforese em gel.

Em algumas configurações, é difícil ter 4 salas separadas.Uma opção possível, mas menos desejável, é fazer a preparação do mastermix em uma área de contenção, por exemplo, uma cabine de fluxo laminar.No caso de amplificação por PCR nested, a preparação do mastermix para a segunda rodada de reação deve ser preparada na área 'limpa' para preparação do mastermix, mas a inoculação com o produto de PCR primário deve ser feita na sala de amplificação e, se possível em uma área de contenção dedicada (por exemplo, uma cabine de fluxo laminar).

Cada sala/área precisa de um conjunto separado de pipetas claramente identificadas, pontas de filtro, suportes de tubos, vórtices, centrífugas (se relevante), canetas, reagentes de laboratório genéricos, jalecos e caixas de luvas que permanecerão em suas respectivas estações de trabalho.As mãos devem ser lavadas e as luvas e jalecos trocados ao se deslocar entre as áreas designadas.Os reagentes e equipamentos não devem ser movidos de uma área suja para uma área limpa.Caso ocorra um caso extremo em que um reagente ou equipamento precise ser movido para trás, ele deve primeiro ser descontaminado com hipoclorito de sódio a 10%, seguido de uma limpeza com água estéril.

Observação

A solução de hipoclorito de sódio a 10% deve ser preparada diariamente.Quando usado para descontaminação, deve-se respeitar um tempo mínimo de contato de 10 minutos.
Alternativamente, produtos disponíveis comercialmente que são validados como descontaminantes de superfície destruidores de DNA podem ser usados ​​se as recomendações de segurança locais não permitirem o uso de hipoclorito de sódio ou se o hipoclorito de sódio não for adequado para descontaminar as partes metálicas do equipamento.

Idealmente, a equipe deve seguir o ethos de fluxo de trabalho unidirecional e não ir de áreas sujas (pós-PCR) de volta para áreas limpas (pré-PCR) no mesmo dia.No entanto, pode haver ocasiões em que isso é inevitável.Quando tal situação ocorrer, o pessoal deve ter o cuidado de lavar bem as mãos, trocar as luvas, usar o jaleco designado e não introduzir nenhum equipamento que queira retirar da sala novamente, como livros de laboratório.Tais medidas de controle devem ser enfatizadas no treinamento de pessoal em métodos moleculares.

Após o uso, os espaços das bancadas devem ser limpos com hipoclorito de sódio a 10% (seguido de água estéril para remover o alvejante residual), etanol a 70% ou um descontaminante destruidor de DNA disponível comercialmente.Idealmente, lâmpadas ultravioleta (UV) devem ser instaladas para permitir a descontaminação por irradiação.Entretanto, o uso de lâmpadas UV deve ser restrito a áreas de trabalho fechadas, por exemplo, armários de segurança, para limitar a exposição do pessoal do laboratório aos raios UV.Respeite as instruções do fabricante para cuidados, ventilação e limpeza de lâmpadas UV, a fim de garantir que as lâmpadas permaneçam eficazes.

Se usar etanol 70% em vez de hipoclorito de sódio, será necessária irradiação com luz ultravioleta para completar a descontaminação.
Não limpe o vórtex e centrifugue com hipoclorito de sódio;em vez disso, limpe com etanol 70% e exponha à luz ultravioleta ou use um descontaminante destruidor de DNA comercial.Para derramamentos, verifique com o fabricante para mais conselhos de limpeza.Se as instruções do fabricante permitirem, as pipetas devem ser esterilizadas rotineiramente em autoclave.Se as pipetas não puderem ser autoclavadas, deve ser suficiente limpá-las com hipoclorito de sódio a 10% (seguido de uma limpeza completa com água estéril) ou com um descontaminante comercial destruidor de DNA seguido de exposição aos raios UV.

A limpeza com hipoclorito de sódio de alta porcentagem pode eventualmente danificar os plásticos e metais da pipeta se for feita regularmente;verifique as recomendações do fabricante primeiro.Todos os equipamentos precisam ser calibrados regularmente de acordo com o cronograma recomendado pelo fabricante.Uma pessoa designada deve ser responsável por garantir que o cronograma de calibração seja cumprido, registros detalhados sejam mantidos e etiquetas de serviço sejam claramente exibidas no equipamento.

3. Recomendações de uso e limpeza para o espaço molecular designado

Pré-PCR: alíquota de reagentes/preparação de mastermix: Este deve ser o mais limpo de todos os espaços usados ​​para a preparação de experimentos moleculares e deve ser idealmente uma cabine de fluxo laminar designada equipada com luz ultravioleta.Amostras, ácidos nucleicos extraídos e produtos de PCR amplificados não devem ser manuseados nesta área.Os reagentes de amplificação devem ser mantidos em freezer (ou geladeira, conforme recomendações do fabricante) no mesmo espaço designado, de preferência próximo ao gabinete de fluxo laminar ou área de pré-PCR.As luvas devem ser trocadas sempre que entrar na área pré-PCR ou na cabine de fluxo laminar.

A área de pré-PCR ou gabinete de fluxo laminar deve ser limpo antes e depois do uso da seguinte forma: Limpe todos os itens do gabinete, por exemplo, pipetas, caixas de ponteiras, vórtice, centrífuga, suportes de tubos, canetas, etc. com etanol 70% ou um descontaminante destruidor de DNA comercial e deixe secar.No caso de uma área de trabalho fechada, por exemplo, uma cabine de fluxo laminar, exponha a capa à luz ultravioleta por 30 minutos.

Observação

Não exponha os reagentes à luz UV;apenas mova-os para dentro do armário quando estiver limpo.Se estiver realizando PCR de transcrição reversa, também pode ser útil limpar as superfícies e equipamentos com uma solução que decompõe RNases em contato.Isso pode ajudar a evitar resultados falso-negativos da degradação enzimática do RNA.Após a descontaminação e antes de preparar o mastermix, as luvas devem ser trocadas mais uma vez e o gabinete está pronto para uso.

Pré-PCR: Extração de ácido nucleico/adição de modelo:

O ácido nucleico deve ser extraído e manuseado em uma segunda área designada, usando um conjunto separado de pipetas, pontas de filtro, suportes de tubos, luvas limpas, jalecos e outros equipamentos. Essa área também serve para adicionar modelos, controles e linhas de tendência ao tubos ou placas mastermix.Para evitar a contaminação das amostras de ácido nucleico extraídas que estão sendo analisadas, é recomendável trocar as luvas antes de manusear controles positivos ou padrões e usar um conjunto separado de pipetas.Os reagentes de PCR e os produtos amplificados não devem ser pipetados nesta área.As amostras devem ser armazenadas em geladeiras ou freezers designados na mesma área.O espaço de trabalho de amostra deve ser limpo da mesma forma que o espaço mastermix.

Pós-PCR: Amplificação e manuseio do produto amplificado

Este espaço designado é para processos de pós-amplificação e deve ser fisicamente separado das áreas de pré-PCR.Ele geralmente contém termocicladores e plataformas em tempo real e, idealmente, deve ter um gabinete de fluxo laminar para adicionar o produto de PCR da rodada 1 à reação da rodada 2, se a PCR aninhada estiver sendo realizada.Os reagentes de PCR e os ácidos nucleicos extraídos não devem ser manuseados nesta área, pois o risco de contaminação é alto.Esta área deve ter um conjunto separado de luvas, jalecos, prateleiras de placas e tubos, pipetas, pontas de filtro, caixas e outros equipamentos.Os tubos devem ser centrifugados antes de serem abertos.O espaço de trabalho de amostra deve ser limpo da mesma forma que o espaço mastermix.

Pós-PCR: análise do produto

Esta sala é para equipamentos de detecção de produtos, por exemplo, tanques de eletroforese em gel, fontes de alimentação, transiluminador UV e sistema de documentação de gel.Esta área deve ter conjuntos separados de luvas, jalecos, prateleiras de placas e tubos, pipetas, pontas de filtro, caixas e outros equipamentos.Nenhum outro reagente pode ser trazido para esta área, excluindo corante de carregamento, marcador molecular e gel de agarose e componentes de tampão.O espaço de trabalho de amostra deve ser limpo da mesma forma que o espaço mastermix.

Nota importante

Idealmente, as salas pré-PCR não devem ser acessadas no mesmo dia se o trabalho já tiver sido realizado nas salas pós-PCR.Se isso for completamente inevitável, primeiro certifique-se de lavar bem as mãos e usar jalecos específicos nas salas.Livros de laboratório e papelada não devem ser levados para as salas pré-PCR se tiverem sido usados ​​nas salas pós-PCR;se necessário, faça impressões duplicadas de protocolos/IDs de amostra, etc.

4. Conselhos gerais de biologia molecular

Use luvas sem pó para evitar a inibição do ensaio.A técnica correta de pipetagem é fundamental para reduzir a contaminação.A pipetagem incorreta pode resultar em respingos ao dispensar líquidos e na criação de aerossóis.Boas práticas para pipetagem correta podem ser encontradas nos seguintes links: Guia Gilson para pipetagem, Vídeos da técnica de pipetagem Anachem, Centrifugue os tubos antes de abrir e abra-os com cuidado para evitar respingos.Feche os tubos imediatamente após o uso para evitar a introdução de contaminantes.

Ao realizar várias reações, prepare um mastermix contendo reagentes comuns (por exemplo, água, dNTPs, tampão, primers e enzima) para minimizar o número de transferências de reagentes e reduzir a ameaça de contaminação.Recomenda-se configurar o mastermix no gelo ou em um bloco frio.O uso de uma enzima Hot Start pode ajudar a reduzir a produção de produtos não específicos.Proteja os reagentes que contêm sondas fluorescentes da luz para evitar degradação.

5. Controles internos

Inclua controles positivos e negativos confirmados bem caracterizados, juntamente com um controle sem modelo em todas as reações e uma linha de tendência titulada de vários pontos para reações quantitativas.O controle positivo não deve ser tão forte que represente um risco de contaminação.Inclua controles de extração positivos e negativos ao realizar a extração de ácido nucleico.

Recomenda-se que sejam afixadas instruções claras em cada uma das áreas para que os utilizadores tenham conhecimento das regras de conduta.Os laboratórios de diagnóstico que detectam níveis muito baixos de DNA ou RNA em amostras clínicas podem querer adotar a medida de segurança adicional de ter sistemas de tratamento de ar separados com pressão de ar ligeiramente positiva nas salas pré-PCR e pressão de ar ligeiramente negativa nas salas pós-PCR.

Por fim, é útil desenvolver um plano de garantia de qualidade (QA).Esse plano deve incluir listas de estoques mestres de reagentes e estoques de trabalho, regras para armazenamento de kits e reagentes, relatórios de resultados de controle, programas de treinamento de pessoal, algoritmos de solução de problemas e ações corretivas quando necessário.

6. Bibliografia

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