د مالیکولر کشف میتودونه د دې وړتیا لري چې په نمونو کې موندل شوي د ټریس مقدارونو د لوړولو له لارې د نیوکلیک اسید لوی مقدار تولید کړي.پداسې حال کې چې دا د حساس کشف کولو وړ کولو لپاره ګټور دی، دا د لابراتوار چاپیریال کې د امپلیفیکیشن ایروسولونو د خپریدو له لارې د ککړتیا احتمال هم معرفي کوي.کله چې تجربې ترسره کیږي، د ریجنټونو، لابراتوار تجهیزاتو او بنچ ځای د ککړتیا څخه مخنیوي لپاره اقدامات ترسره کیدی شي، ځکه چې دا ډول ککړتیا ممکن غلط مثبت (یا غلط - منفي) پایلې رامینځته کړي.

د ککړتیا احتمال کمولو کې د مرستې لپاره، ښه لابراتوار تمرین باید هر وخت تمرین شي.په ځانګړې توګه، د لاندې ټکو په اړه باید احتیاطي تدابیر ونیول شي:

1. د ریجنټونو سمبالول
2. د کار ځای او تجهیزاتو تنظیم کول
3. د ټاکل شوي مالیکولر ځای لپاره د کارولو او پاکولو مشوره
4. د مالیکول بیولوژی عمومي مشوره
5. داخلي کنټرولونه
6. کتابتون

1. د ریجنټونو سمبالول

د خلاصیدو دمخه په لنډه توګه سینټرفیوژ ریجینټ ټیوبونه د ایروسول تولید څخه مخنیوي لپاره.Aliquot reagents د ډیری کنګل کیدو او د ماسټر سټاک ککړتیا څخه مخنیوي لپاره.په واضح ډول ټول ریجنټ او عکس العمل ټیوبونه لیبل او نیټه کړئ او په ټولو تجربو کې کارول شوي د ریجنټ لاټ او بیچ شمیرو لاګونه وساتئ.د فلټر لارښوونو په کارولو سره ټول ریجنټونه او نمونې پایپټ کړئ.د پیرودلو دمخه ، دا مشوره ورکول کیږي چې د تولید کونکي سره تصدیق وکړئ چې د فلټر لارښوونې د پیپټ برانډ سره مناسب دي چې کارول کیږي.

2. د کار ځای او تجهیزاتو تنظیم کول

د کار ځای باید تنظیم شي ترڅو ډاډ ترلاسه شي چې د کار جریان په یو لوري کې واقع کیږي، له پاکو سیمو (پری PCR) څخه ناپاکو سیمو ته (د PCR وروسته).لاندې عمومي احتیاطي تدابیر به د ککړتیا چانس کمولو کې مرسته وکړي.جلا ټاکل شوې خونې ولرئ، یا لږ تر لږه له فزیکي پلوه جلا ځایونه ولرئ، د دې لپاره: د ماسټر مکس چمتو کول، د نیوکلیک اسید استخراج او د DNA ټیمپلیټ اضافه کول، د پراخ شوي محصول پراخول او سمبالول، او د محصول تحلیل، د بیلګې په توګه جیل الیکٹروفورسیس.

په ځینو ترتیباتو کې، د 4 جلا خونو درلودل ستونزمن دي.یو ممکنه مګر لږ مطلوب انتخاب دا دی چې د کانټینټ په ساحه کې د ماسټر مکس چمتو کول ترسره کړئ، د بیلګې په توګه د لامینار جریان کابینه.د nested PCR امپلیفیکیشن په صورت کې، د دویم پړاو غبرګون لپاره د ماسټر مکس چمتو کول باید د ماسټر مکس چمتو کولو لپاره په پاکه ساحه کې چمتو شي، مګر د لومړني PCR محصول سره د امپلیفیکیشن په خونه کې باید ترسره شي، او که امکان ولري. په یوه وقف شوي کنټرول ساحه کې (د بیلګې په توګه د لامینار جریان کابینه).

هره کوټه/ساحه د روښانه لیبل شوي پایپټونو جلا سیټ ته اړتیا لري، د فلټر لارښوونو، ټیوب ریکونو، ورټیکس، سینټرفیوجز (که اړونده وي)، قلمونه، د لابراتوار عمومي ریجنټونه، د لابراتوار کوټونه او د دستکشې بکسونه چې په خپلو اړوندو کارځایونو کې پاتې کیږي.لاسونه باید ومینځل شي او دستکشې او لابراتوار کوټونه د ټاکل شوي ساحو تر مینځ حرکت کولو پرمهال بدل شي.ریجنټونه او تجهیزات باید له ناپاکو سیمې څخه پاکې سیمې ته ونه لیږدول شي.که چیرې یوه سخته پیښه رامینځته شي چیرې چې ریجنټ یا د تجهیزاتو ټوټه باید شاته حرکت وکړي، دا باید لومړی د 10٪ سوډیم هایپوکلورایټ سره پاک شي، بیا وروسته د جراثیمو اوبو سره پاک شي.

نوټ

د 10٪ سوډیم هایپوکلورایټ محلول باید هره ورځ تازه جوړ شي.کله چې د پاکولو لپاره کارول کیږي، لږترلږه د 10 دقیقو تماس وخت باید تعقیب شي.
په بدیل توګه، په سوداګریزه توګه موجود محصولات چې د DNA ویجاړونکي سطحې ککړونکي په توګه تایید شوي کارول کیدی شي که چیرې د محلي خوندیتوب سپارښتنې د سوډیم هایپوکلورائټ کارولو ته اجازه ورنکړي یا که سوډیم هایپوکلورایټ د تجهیزاتو فلزي برخو پاکولو لپاره مناسب نه وي.

په عین حال کې، کارمندان باید د غیر مستقیم کاري جریان اخلاقو ته غاړه کیږدي او په هماغه ورځ له ناپاکو سیمو (PCR وروسته) بیرته پاکو سیمو (PCR مخکې) ته لاړ نشي.په هرصورت، ممکن ځینې وختونه شتون ولري کله چې دا ناباوره وي.کله چې دا ډول فرصت رامنځ ته شي، پرسونل باید په احتیاط سره لاسونه ومینځي، دستکشې بدل کړي، ډیزاین شوي لابراتوار کوټ وکاروي او داسې وسایل معرفي نکړي چې دوی یې بیا له کوټې څخه بهر وباسي، لکه د لابراتوار کتابونه.دا ډول کنټرول اقدامات باید د مالیکولر میتودونو په اړه د کارمندانو روزنې کې ټینګار وشي.

د استعمال وروسته، د بینچ ځایونه باید د 10٪ سوډیم هایپوکلورایټ (د پاتې شونو د لیرې کولو لپاره د جراثیمو اوبو سره تعقیب شي)، 70٪ ایتانول، یا د اعتبار وړ سوداګریز موجود DNA - تخریب کونکي ککړونکي سره پاک شي.په عین حال کې، د الټرا وایلټ (UV) څراغونه باید نصب شي ترڅو د شعاع له لارې د ککړتیا وړ کړي.په هرصورت، د UV څراغونو کارول باید د تړلو کاري ساحو پورې محدود وي، د بیلګې په توګه د خوندیتوب کابینې، د لابراتوار کارمندانو د UV افشا کولو محدودولو لپاره.مهرباني وکړئ د UV څراغ پاملرنې ، وینټیلیشن او پاکولو لپاره د تولید کونکي لارښوونو ته غاړه کیږدئ ترڅو ډاډ ترلاسه شي چې لامپونه اغیزمن پاتې کیږي.

که چیرې د سوډیم هایپوکلورایټ پر ځای 70٪ ایتانول وکاروئ، نو د ککړتیا بشپړولو لپاره به د UV رڼا سره شعاع ته اړتیا وي.
د سوډیم هایپوکلورایټ سره وورټیکس او سینټرفیوج مه پاکوئ؛پرځای یې، د 70٪ ایتانول سره پاک کړئ او د UV رڼا سره مخ شئ، یا د سوداګریزې DNA تخریب کونکي څخه کار واخلئ.د توزیع کولو لپاره، د نورو پاکولو مشورې لپاره د جوړونکي سره وګورئ.که چیرې د تولید کونکي لارښوونې ورته اجازه ورکړي، پایپټ باید په منظمه توګه د آټوکلیو لخوا تعقیم شي.که چیری پایپونه په اتوماتیک ډول ونه مینځل شی، نو دا باید د 10٪ سوډیم هایپوکلورایټ (وروسته د جراثیمو اوبو سره په بشپړه توګه پاکه شي) یا د سوداګریز DNA - تخریب کونکي ډیکنټامیننټ سره چې د UV افشا کیدو وروسته پاک شي کافي وي.

د لوړې سلنې سوډیم هایپوکلورایټ سره پاکول ممکن په پای کې د پایپټ پلاستيک او فلزاتو ته زیان ورسوي که چیرې په منظم ډول ترسره شي.لومړی د تولید کونکي وړاندیزونه چیک کړئ.ټول تجهیزات باید د تولید کونکي لخوا وړاندیز شوي مهالویش سره سم په منظم ډول کیلیبریټ شي.یو ټاکل شوی کس باید د دې ډاډ ترلاسه کولو مسؤل وي چې د کیلیبریشن مهالویش تعقیب کیږي ، تفصيلي لاګونه ساتل کیږي ، او د خدماتو لیبلونه په تجهیزاتو کې په واضح ډول ښودل شوي.

3. د ټاکل شوي مالیکولر ځای لپاره د کارولو او پاکولو مشوره

Pre-PCR: Reagent aliquoting / mastermix تیاری: دا باید د ټولو هغو ځایونو څخه پاکه وي چې د مالیکولر تجربو د چمتو کولو لپاره کارول کیږي او په مثالي توګه د لامینار جریان کابینه وي چې په UV رڼا سمبال وي.نمونې، استخراج شوي نیوکلیک اسید او پراخ شوي PCR محصولات باید پدې ساحه کې ونه کارول شي.د امپلیفیکیشن ریجنټ باید په فریزر (یا فرج کې، د جوړونکي سپارښتنو سره سم) په ورته ټاکل شوي ځای کې وساتل شي، په مثالي توګه د لامینار جریان کابینې یا د PCR مخکې ساحې ته نږدې.دستکشې باید هر ځل د PCR مخکې ساحې یا د لامینار جریان کابینې ته د ننوتلو وروسته بدل شي.

د PCR څخه دمخه ساحه یا د لامینار جریان کابینه باید د کارولو دمخه او وروسته په لاندې ډول پاکه شي: په کابینې کې ټول توکي پاک کړئ ، د بیلګې په توګه پایپټ ، ټیپ بکس ، ورټیکس ، سینټرفیوج ، ټیوب ریکونه ، قلمونه او داسې نور د 70٪ ایتانول یا ایتانول سره تجارتي DNA - تخریب کونکی ، او وچولو ته اجازه ورکوي.د تړل شوي کاري ساحې په حالت کې، د بیلګې په توګه د لامینار جریان کابینه، د 30 دقیقو لپاره د UV رڼا ته هود ښکاره کړئ.

نوټ

Reagents د UV رڼا ته مه ښکاره کوئ؛یوازې یوځل یې کابینې ته واړوئ کله چې پاک شي.که چیرې د ریورس ټرانسکرپشن PCR ترسره کول ، نو دا به ګټور وي چې سطحې او تجهیزات د داسې محلول سره پاک کړئ چې په تماس کې RNases ماتوي.دا ممکن د RNA د انزایم تخریب څخه د غلط - منفي پایلو څخه مخنیوي کې مرسته وکړي.د پاکولو وروسته او د ماسټر مکس چمتو کولو دمخه، دستکشې باید یو ځل بیا بدل شي، او بیا کابینه د کارولو لپاره چمتو ده.

د PCR څخه مخکې: د نیوکلیک اسید استخراج / د ټیمپلیټ اضافه کول:

نیوکلیک اسید باید په دوهم ټاکل شوي ساحه کې استخراج او اداره شي، د پایپټ، فلټر لارښوونو، ټیوب ریکونو، تازه دستکشو، لابراتوار کوټونو او نورو تجهیزاتو په کارولو سره. د ماسټر مکس ټیوب یا پلیټونه.د استخراج شوي نیوکلیک اسید نمونو د ککړتیا څخه مخنیوي لپاره چې تحلیل کیږي، دا سپارښتنه کیږي چې د مثبت کنټرول یا معیارونو اداره کولو دمخه دستکشې بدل کړئ او د پایپټونو جلا سیټ وکاروئ.د PCR ریجنټونه او پراخ شوي محصولات باید پدې سیمه کې پایپ ونه لګول شي.نمونې باید په ورته سیمه کې په ټاکل شوي فریجونو یا فریزرونو کې زیرمه شي.د نمونې کاري ځای باید د ماسټر مکس ځای په څیر پاک شي.

د PCR وروسته: د پراخ شوي محصول پراخول او اداره کول

دا ټاکل شوی ځای د لوړولو وروسته پروسو لپاره دی او باید په فزیکي توګه د PCR مخکې ساحو څخه جلا وي.دا معمولا thermocyclers او د ریښتیني وخت پلیټ فارمونه لري، او په مثالي توګه باید د راؤنډ 1 PCR محصول اضافه کولو لپاره د راؤنډ 2 عکس العمل لپاره د لامینار جریان کابینه ولري ، که چیرې نیسټ شوي PCR ترسره کیږي.د PCR ریجنټونه او استخراج شوي نیوکلیک اسید باید پدې سیمه کې ونه کارول شي ځکه چې د ککړتیا خطر ډیر دی.دا ساحه باید د دستکشو، لابراتوار کوټونو، پلیټ او ټیوب ریکونو، پایپټ، د فلټر لارښوونو، ډنډونو او نورو تجهیزاتو جلا جلا سیټ ولري.ټیوبونه باید د خلاصیدو دمخه سینټرفیوج شي.د نمونې کاري ځای باید د ماسټر مکس ځای په څیر پاک شي.

د PCR څخه وروسته: د محصول تحلیل

دا خونه د محصول کشف کولو تجهیزاتو لپاره ده، د بیلګې په توګه د جیل الیکٹروفورسیس ټانکونه، د بریښنا کڅوړې، د UV ټرانزیلومینټر او د جیل اسنادو سیسټم.دا ساحه باید د دستکشو جلا سیټونه، لابراتوار کوټونه، پلیټ او ټیوب ریکونه، پایپټونه، د فلټر لارښوونې، ډنډونه او نور تجهیزات ولري.د بارولو رنګ، مالیکول مارکر او اګروز جیل، او بفر اجزاو پرته نور هیڅ ریجنټ پدې ساحه کې نشي راوړل کیدی.د نمونې کاري ځای باید د ماسټر مکس ځای په څیر پاک شي.

مهمه یادونه

په عین حال کې، د PCR مخکې خونو ته باید په ورته ورځ داخل نه شي که چیرې د PCR وروسته خونو کې کار ترسره شوی وي.که دا په بشپړه توګه د مخنیوي وړ نه وي، ډاډ ترلاسه کړئ چې لاسونه لومړی په ښه توګه مینځل شوي او په خونه کې د لابراتوار ځانګړي کوټونه اغوستل شوي.د لابراتوار کتابونه او کاغذي کارونه باید د PCR دمخه خونو ته ونه وړل شي که چیرې دوی د PCR وروسته خونو کې کارول شوي وي؛که اړتیا وي، د پروتوکولونو / نمونې IDs، او نور نقل شوي چاپونه واخلئ.

4. د مالیکول بیولوژي عمومي مشوره

د پوډر څخه پاک دستکشې وکاروئ ترڅو د ارزونې مخنیوی څخه مخنیوی وشي.د پایپ کولو سمه تخنیک د ککړتیا کمولو لپاره خورا مهم دی.غلط پایپټینګ کولی شي د مایعاتو توزیع کولو او د ایروسول رامینځته کولو په وخت کې د ټوټې کیدو لامل شي.د سم پایپټینګ لپاره ښه تمرین په لاندې لینکونو کې موندل کیدی شي: د پایپټینګ لپاره د ګیلسن لارښود، د اناکیم پایپټینګ تخنیک ویډیوګانې، د سینټریفیوج ټیوبونه د پرانیستلو دمخه، او په احتیاط سره یې خلاص کړئ ترڅو د ویشلو څخه مخنیوی وشي.د کارولو وروسته سمدلاسه ټیوبونه وتړئ ترڅو د ککړتیاو د معرفي کیدو څخه مخنیوی وشي.

کله چې ډیری عکس العملونه ترسره کوئ، یو ماسټر مکس چمتو کړئ چې عام ریجنټونه ولري (د بیلګې په توګه اوبه، dNTPs، بفر، پریمر او انزایم) ترڅو د ریجنټ لیږد شمیر کم کړي او د ککړتیا خطر کم کړي.دا سپارښتنه کیږي چې ماسټر مکس په یخ یا سړه بلاک کې تنظیم کړئ.د هاټ سټارټ انزایم کارول ممکن د غیر مشخص محصولاتو تولید کمولو کې مرسته وکړي.هغه ریجنټونه چې فلوروسینټ پروبونه لري له رڼا څخه خوندي کړئ ترڅو د تخریب مخه ونیول شي.

5. داخلي کنټرولونه

په ټولو عکس العملونو کې د نه ټیمپلیټ کنټرول سره ښه مشخص شوي ، تایید شوي مثبت او منفي کنټرولونه شامل کړئ ، او د کمیتي عکس العملونو لپاره څو ټکي ټایټ شوي رجحان لاین شامل کړئ.مثبت کنټرول باید دومره قوي نه وي چې دا د ککړتیا خطر رامینځته کړي.د نیوکلیک اسید استخراج ترسره کولو پرمهال مثبت او منفي استخراج کنټرولونه شامل کړئ.

دا سپارښتنه کیږي چې واضح لارښوونې په هره برخه کې ځړول شي ترڅو کاروونکي د چلند قواعدو څخه خبر وي.تشخیصي لابراتوارونه چې په کلینیکي نمونو کې د DNA یا RNA خورا ټیټې کچې کشف کوي ممکن د PCR دمخه خونو کې د لږ مثبت هوا فشار سره او د PCR وروسته خونو کې د هوا لږ منفي فشار سره د جلا هوا اداره کولو سیسټمونو اضافي امنیت اقدام غوره کړي.

په نهایت کې ، د کیفیت تضمین (QA) پلان رامینځته کول ګټور دي.په دې ډول پلان کې باید د ریجنټ ماسټر سټاکونو او کاري سټاکونو لیست شامل وي، د کټونو او ریجنټونو ذخیره کولو قواعد، د کنټرول پایلو راپور ورکول، د کارمندانو روزنې پروګرامونه، د ستونزو حل کولو الګوریتمونه، او د اړتیا په وخت کې د درملنې اقدامات شامل دي.

6. کتابتون

Aslan A، Kinzelman J، Dreelin E، Anan'eva T، Lavander J. دریم څپرکی: د qPCR لابراتوار ترتیب کول.د USEPA qPCR میتود 1611 په کارولو سره د تفریحی اوبو ازموینې لپاره لارښود سند. لانسینګ - میشیګان ایالت پوهنتون.

د عامې روغتیا انګلستان، NHS.د مایکروبیولوژی تحقیقاتو لپاره د انګلستان معیارونه: د لابراتوار ښه تمرین کله چې د مالیکولر امپلیفیکیشن اسیس ترسره کوي).د کیفیت لارښود.2013؛4(4):1-15.

Mifflin T. د PCR لابراتوار جوړول.د سړه پسرلي هارب پروتوک.۲۰۰۷؛۷

Schroeder S 2013. د سنټرفیوجونو معمول ساتنه: د سینټرفیوجونو پاکول، ساتنه او غیر منتن کول، روټرونه او اډاپټرونه (د سپین کاغذ نمبر 14).هامبورګ: Eppendorf;۲۰۱۳.

ویانا آر وی، والیس سی ایل.د کلینیکي لابراتوار ښه تمرین (GCLP) د مالیکولر پراساس ازموینو لپاره چې په تشخیصي لابراتوارونو کې کارول کیږي، په: اکیار I، مدیر.د کیفیت کنټرول پراخه سپیکٹرا.ریجیکا، کرویشیا: Intech;2011: 29-52.