Molekylære deteksjonsmetoder har evnen til å produsere et stort volum nukleinsyre gjennom amplifisering av spormengder funnet i prøver.Selv om dette er fordelaktig for å muliggjøre sensitiv deteksjon, introduserer det også muligheten for kontaminering gjennom spredning av amplifikasjonsaerosoler i laboratoriemiljøet.Ved gjennomføring av eksperimenter kan det iverksettes tiltak for å unngå kontaminering av reagenser, laboratorieutstyr og benkeplass, da slik forurensning kan generere falskt positive (eller falskt negative) resultater.

For å bidra til å redusere sannsynligheten for kontaminering, bør god laboratoriepraksis utøves til enhver tid.Spesielt bør forholdsregler tas angående følgende punkter:

1. Håndtering av reagenser
2. Organisering av arbeidsrom og utstyr
3. Bruk og rengjøringsråd for det angitte molekylrommet
4. Generelle molekylærbiologiske råd
5. Internkontroll
6. Bibliografi

1. Håndtering av reagenser

Sentrifuger reagensrørene kort før åpning for å unngå dannelse av aerosoler.Alikvoter reagenser for å unngå gjentatte frys-tinninger og kontaminering av masterstocks.Merk og dater tydelig alle reagens- og reaksjonsrør og oppretthold logger over reagenslot- og batchnumre brukt i alle eksperimenter.Pipetter alle reagenser og prøver ved hjelp av filterspisser.Før du kjøper, er det tilrådelig å bekrefte med produsenten at filterspissene passer til pipettemerket som skal brukes.

2. Organisering av arbeidsrom og utstyr

Arbeidsområdet bør organiseres for å sikre at arbeidsflyten skjer i én retning, fra rene områder (pre-PCR) til skitne områder (post-PCR).Følgende generelle forholdsregler vil bidra til å redusere sjansen for kontaminering.Ha separate utpekte rom, eller i det minste fysisk adskilte områder, for: klargjøring av mastermix, nukleinsyreekstraksjon og DNA-templatetilsetning, amplifikasjon og håndtering av amplifisert produkt, og produktanalyse, f.eks. gelelektroforese.

I noen omgivelser er det vanskelig å ha 4 separate rom.Et mulig, men mindre ønskelig alternativ er å gjøre mastermix-forberedelsen i et inneslutningsområde, f.eks. et laminært strømningsskap.Ved nestet PCR-amplifikasjon bør klargjøringen av mastermixen for andre runde-reaksjonen tilberedes i det "rene" området for mastermix-preparering, men inokuleringen med det primære PCR-produktet bør gjøres i amplifikasjonsrommet, og om mulig. i et dedikert oppbevaringsområde (f.eks. et laminært strømningsskap).

Hvert rom/område trenger et eget sett med tydelig merkede pipetter, filterspisser, rørstativer, virvler, sentrifuger (hvis relevant), penner, generiske laboratoriereagenser, laboratoriefrakker og bokser med hansker som blir liggende på deres respektive arbeidsstasjoner.Hendene må vaskes og hansker og laboratoriefrakker skiftes ved flytting mellom de angitte områdene.Reagenser og utstyr skal ikke flyttes fra et skittent område til et rent område.Skulle det oppstå et ekstremt tilfelle der en reagens eller et utstyr må flyttes bakover, må det først dekontamineres med 10 % natriumhypokloritt, etterfulgt av en tørking med sterilt vann.

Merk

10 % natriumhypoklorittløsningen må tilberedes fersk daglig.Ved bruk til dekontaminering bør en minimum kontakttid på 10 minutter overholdes.
Alternativt kan kommersielt tilgjengelige produkter som er validert som DNA-ødeleggende overflatedekontaminanter brukes hvis lokale sikkerhetsanbefalinger ikke tillater bruk av natriumhypokloritt eller hvis natriumhypokloritt ikke er egnet for dekontaminering av metalldeler av utstyr.

Ideelt sett bør personalet overholde den ensrettede arbeidsflyt-etosen og ikke gå fra skitne områder (post-PCR) tilbake til rene områder (pre-PCR) samme dag.Det kan imidlertid være tilfeller hvor dette er uunngåelig.Når slike anledninger oppstår, må personellet passe på å vaske hendene grundig, skifte hansker, bruke den angitte laboratoriefrakken og ikke introdusere noe utstyr de ønsker å ta med ut av rommet igjen, for eksempel laboratoriebøker.Slike kontrolltiltak bør vektlegges i opplæring av ansatte om molekylære metoder.

Etter bruk skal benkeplassene rengjøres med 10 % natriumhypokloritt (etterfulgt av sterilt vann for å fjerne rester av blekemiddel), 70 % etanol eller et validert kommersielt tilgjengelig DNA-ødeleggende dekontamineringsmiddel.Ideelt sett bør ultrafiolette (UV) lamper monteres for å muliggjøre dekontaminering ved bestråling.Bruk av UV-lamper bør imidlertid begrenses til lukkede arbeidsområder, f.eks. sikkerhetsskap, for å begrense laboratoriepersonalets UV-eksponering.Følg produsentens instruksjoner for pleie, ventilasjon og rengjøring av UV-lamper for å sikre at lampene forblir effektive.

Hvis du bruker 70 % etanol i stedet for natriumhypokloritt, vil bestråling med UV-lys være nødvendig for å fullføre dekontamineringen.
Ikke rengjør virvelen og sentrifuger med natriumhypokloritt;Tørk i stedet av med 70 % etanol og utsett for UV-lys, eller bruk en kommersiell DNA-ødeleggende dekontaminant.For søl, sjekk med produsenten for ytterligere rengjøringsråd.Hvis produsentens instruksjoner tillater det, bør pipetter rutinemessig steriliseres i autoklav.Hvis pipetter ikke kan autoklaveres, bør det være tilstrekkelig å rengjøre dem med 10 % natriumhypokloritt (etterfulgt av en grundig tørking med sterilt vann) eller med en kommersiell DNA-ødeleggende dekontaminant etterfulgt av UV-eksponering.

Rengjøring med høyprosent natriumhypokloritt kan til slutt skade pipetteplast og metaller hvis det gjøres regelmessig;sjekk anbefalingene fra produsenten først.Alt utstyr må kalibreres regelmessig i henhold til produsentens anbefalte tidsplan.En utpekt person bør være ansvarlig for å sikre at kalibreringsplanen overholdes, detaljerte logger opprettholdes og serviceetiketter vises tydelig på utstyret.

3. Bruk og rengjøringsråd for det angitte molekylrommet

Pre-PCR: Reagensalikvotering / mastermix-preparering: Dette bør være det reneste av alle rom som brukes til forberedelse av molekylære eksperimenter og bør ideelt sett være et utpekt laminært strømningsskap utstyrt med et UV-lys.Prøver, ekstrahert nukleinsyre og amplifiserte PCR-produkter skal ikke håndteres i dette området.Amplifikasjonsreagenser bør oppbevares i en fryser (eller kjøleskap, i henhold til produsentens anbefalinger) på samme utpekte plass, ideelt ved siden av laminar flow-kabinettet eller pre-PCR-området.Hansker bør skiftes hver gang når du går inn i pre-PCR-området eller laminar flow-kabinettet.

Pre-PCR-området eller laminar flow-kabinettet bør rengjøres før og etter bruk som følger: Tørk av alle gjenstander i skapet, f.eks. pipetter, spissbokser, vortex, sentrifuger, rørstativ, penner osv. med 70 % etanol eller en kommersiell DNA-ødeleggende dekontaminant, og la tørke.Ved et lukket arbeidsområde, f.eks. et laminært strømningsskap, utsett hetten for UV-lys i 30 minutter.

Merk

Ikke utsett reagenser for UV-lys;bare flytt dem inn i skapet når det er rent.Hvis du utfører revers transkripsjons-PCR, kan det også være nyttig å tørke ned overflater og utstyr med en løsning som bryter ned RNaser ved kontakt.Dette kan bidra til å unngå falske negative resultater fra enzymnedbrytning av RNA.Etter dekontaminering og før klargjøring av mastermix, bør hanskene skiftes en gang til, og deretter er skapet klart til bruk.

Pre-PCR: Nukleinsyreekstraksjon/maltilsetning:

Nukleinsyre må ekstraheres og håndteres i et annet angitt område, ved hjelp av et separat sett med pipetter, filterspisser, rørstativer, ferske hansker, laboratoriefrakker og annet utstyr. Dette området er også for å legge til mal, kontroller og trendlinjer til mastermix rør eller plater.For å unngå kontaminering av de ekstraherte nukleinsyreprøvene som analyseres, anbefales det å skifte hansker før håndtering av positive kontroller eller standarder og å bruke et separat sett med pipetter.PCR-reagenser og amplifiserte produkter må ikke pipetteres i dette området.Prøver bør oppbevares i anviste kjøleskap eller frysere i samme område.Prøvearbeidsområdet bør rengjøres på samme måte som mastermix-området.

Post-PCR: Amplifikasjon og håndtering av det amplifiserte produktet

Denne utpekte plassen er for post-amplifikasjonsprosesser og bør være fysisk atskilt fra pre-PCR-områdene.Den inneholder vanligvis termosyklere og sanntidsplattformer, og bør ideelt sett ha et laminært strømningsskap for å legge til runde 1 PCR-produktet til runde 2-reaksjonen, hvis nestet PCR utføres.PCR-reagenser og ekstrahert nukleinsyre må ikke håndteres i dette området siden risikoen for kontaminering er høy.Dette området bør ha et eget sett med hansker, laboratoriefrakker, plate- og rørstativ, pipetter, filterspisser, binger og annet utstyr.Rørene må sentrifugeres før åpning.Prøvearbeidsområdet bør rengjøres på samme måte som mastermix-området.

Post-PCR: Produktanalyse

Dette rommet er for produktdeteksjonsutstyr, f.eks. gelelektroforesetanker, kraftpakker, UV-transilluminator og geldokumentasjonssystemet.Dette området bør ha separate sett med hansker, laboratoriefrakker, plate- og rørstativ, pipetter, filterspisser, binger og annet utstyr.Ingen andre reagenser kan bringes inn i dette området, unntatt lasting av fargestoff, molekylær markør og agarosegel og bufferkomponenter.Prøvearbeidsområdet bør rengjøres på samme måte som mastermix-området.

Viktig notat

Ideelt sett bør ikke pre-PCR-rommene gå inn samme dag hvis det allerede er utført arbeid i post-PCR-rommene.Hvis dette er helt uunngåelig, sørg for at hendene først vaskes grundig og at spesifikke laboratoriekåper brukes i rommene.Laboratoriebøker og papirer må ikke tas med inn i pre-PCR-rommene hvis de har vært brukt i post-PCR-rommene;om nødvendig ta dupliserte utskrifter av protokoller/prøve-IDer osv.

4. Generelle molekylærbiologiske råd

Bruk pudderfrie hansker for å unngå analysehemming.Riktig pipeteringsteknikk er avgjørende for å redusere forurensning.Feil pipettering kan føre til sprut ved dispensering av væsker og dannelse av aerosoler.God praksis for korrekt pipettering finner du på følgende lenker: Gilson guide til pipettering, Anachem pipetteringsteknikkvideoer, Sentrifugerør før åpning, og åpne dem forsiktig for å unngå sprut.Lukk rørene umiddelbart etter bruk for å unngå innføring av forurensninger.

Når du utfører flere reaksjoner, tilbered én mastermix som inneholder vanlige reagenser (f.eks. vann, dNTP-er, buffer, primere og enzym) for å minimere antallet reagensoverføringer og redusere faren for kontaminering.Det anbefales å sette opp mastermixen på is eller en kald blokk.Bruk av et Hot Start-enzym kan bidra til å redusere produksjonen av ikke-spesifikke produkter.Beskytt reagenser som inneholder fluorescerende prober mot lys for å unngå nedbrytning.

5. Internkontroll

Inkluder godt karakteriserte, bekreftede positive og negative kontroller, sammen med en kontroll uten mal i alle reaksjoner, og en titrert trendlinje med flere punkter for kvantitative reaksjoner.Den positive kontrollen bør ikke være så sterk at den utgjør en forurensningsrisiko.Inkluder positive og negative ekstraksjonskontroller når du utfører nukleinsyreekstraksjon.

Det anbefales at det legges ut tydelige instrukser på hvert av områdene slik at brukerne er kjent med atferdsregler.Diagnostiske laboratorier som oppdager svært lave nivåer av DNA eller RNA i kliniske prøver kan være lurt å ta i bruk det ekstra sikkerhetstiltaket med å ha separate luftbehandlingssystemer med svakt positivt lufttrykk i pre-PCR-rommene og svakt negativt lufttrykk i post-PCR-rommene.

Til slutt er det nyttig å utvikle en kvalitetssikringsplan (QA).En slik plan bør inkludere lister over reagensmasterlager og arbeidslager, regler for oppbevaring av sett og reagenser, rapportering av kontrollresultater, opplæringsprogrammer for personalet, feilsøkingsalgoritmer og utbedrende tiltak ved behov.

6. Bibliografi

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapittel 3: Sette opp et qPCR-laboratorium.Et veiledningsdokument for testing av rekreasjonsvann ved bruk av USEPA qPCR-metode 1611. Lansing- Michigan State University.

Folkehelse England, NHS.Storbritannias standarder for mikrobiologiske undersøkelser: god laboratoriepraksis ved utførelse av molekylære amplifikasjonsanalyser).Kvalitetsveiledning.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Sette opp et PCR-laboratorium.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Rutinemessig vedlikehold av sentrifuger: rengjøring, vedlikehold og desinfeksjon av sentrifuger, rotorer og adaptere (White paper nr. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) for molekylærbaserte tester brukt i diagnostiske laboratorier, I: Akyar I, redaktør.Bredt spektra av kvalitetskontroll.Rijeka, Kroatia: Intech;2011: 29–52.