Moleculaire detectiemethoden hebben het vermogen om een ​​groot volume nucleïnezuur te produceren door de amplificatie van sporenhoeveelheden die in monsters worden aangetroffen.Hoewel dit gunstig is voor het mogelijk maken van gevoelige detectie, introduceert het ook de mogelijkheid van besmetting door de verspreiding van amplificatie-aerosolen in de laboratoriumomgeving.Bij het uitvoeren van experimenten kunnen maatregelen worden genomen om verontreiniging van reagentia, laboratoriumapparatuur en werkbankruimte te voorkomen, aangezien een dergelijke verontreiniging fout-positieve (of fout-negatieve) resultaten kan opleveren.

Om de kans op besmetting te verkleinen, moeten te allen tijde goede laboratoriumpraktijken worden toegepast.Concreet moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen met betrekking tot de volgende punten:

1. Omgaan met reagentia
2. Organisatie van werkruimte en apparatuur
3. Gebruiks- en schoonmaakadvies voor de daarvoor bestemde moleculaire ruimte
4. Algemeen moleculair biologisch advies
5. Interne controles
6. Bibliografie

1. Omgaan met reagentia

Centrifugeer de reagensbuisjes voor het openen kort om het ontstaan ​​van aerosolen te voorkomen.Aliquot reagentia om meerdere vries-ontdooien en de verontreiniging van mastervoorraden te voorkomen.Label en dateer duidelijk alle reagens- en reageerbuisjes en houd logboeken bij van de reagenslot- en batchnummers die in alle experimenten zijn gebruikt.Pipetteer alle reagentia en monsters met behulp van filtertips.Voorafgaand aan de aankoop is het raadzaam om bij de fabrikant na te gaan of de filtertips passen bij het merk van de te gebruiken pipet.

2. Organisatie van werkruimte en apparatuur

De werkruimte moet zo worden georganiseerd dat de werkstroom in één richting plaatsvindt, van schone gebieden (pre-PCR) naar vuile gebieden (post-PCR).De volgende algemene voorzorgsmaatregelen helpen de kans op besmetting te verkleinen.Zorg voor aparte ruimtes, of op zijn minst fysiek gescheiden ruimtes, voor: mastermixbereiding, nucleïnezuurextractie en toevoeging van DNA-template, amplificatie en hantering van geamplificeerd product, en productanalyse, bijv. gelelektroforese.

In sommige situaties is het moeilijk om 4 aparte kamers te hebben.Een mogelijke maar minder wenselijke optie is om de mastermix te bereiden in een afgesloten ruimte, bijvoorbeeld een laminaire flowkast.In het geval van geneste PCR-amplificatie moet de mastermix voor de tweede reactieronde worden voorbereid in de 'schone' ruimte voor mastermixbereiding, maar de inoculatie met het primaire PCR-product moet in de amplificatiekamer worden gedaan, en indien mogelijk in een speciale opvangruimte (bijv. een laminaire flowkast).

Elke kamer/ruimte heeft een aparte set duidelijk gelabelde pipetten, filtertips, buizenrekken, vortexen, centrifuges (indien relevant), pennen, generieke laboratoriumreagentia, laboratoriumjassen en dozen met handschoenen nodig die op hun respectieve werkstations blijven.Handen moeten worden gewassen en handschoenen en laboratoriumjassen moeten worden vervangen bij het verplaatsen tussen de aangewezen gebieden.Reagentia en apparatuur mogen niet van een vuile naar een schone ruimte worden verplaatst.Mocht zich in een extreem geval een reagens of een apparaat naar achteren moeten verplaatsen, dan moet het eerst worden ontsmet met 10% natriumhypochloriet, gevolgd door afnemen met steriel water.

Opmerking

De 10% natriumhypochlorietoplossing moet dagelijks vers worden bereid.Bij gebruik voor decontaminatie dient een minimale contacttijd van 10 minuten aangehouden te worden.
Als alternatief kunnen in de handel verkrijgbare producten die zijn gevalideerd als DNA-vernietigende oppervlakteontsmettingsmiddelen worden gebruikt als lokale veiligheidsaanbevelingen het gebruik van natriumhypochloriet niet toestaan ​​of als natriumhypochloriet niet geschikt is voor het ontsmetten van metalen onderdelen van apparatuur.

Idealiter zou het personeel zich moeten houden aan de unidirectionele werkstroomethos en niet op dezelfde dag van vuile gebieden (post-PCR) naar schone gebieden (pre-PCR) gaan.Er kunnen zich echter situaties voordoen waarin dit onvermijdelijk is.Wanneer een dergelijke gelegenheid zich voordoet, moet het personeel ervoor zorgen dat de handen grondig worden gewassen, handschoenen worden verwisseld, de aangewezen laboratoriumjas wordt gebruikt en geen apparatuur wordt meegenomen die ze de kamer uit willen nemen, zoals laboratoriumboeken.Dergelijke controlemaatregelen moeten worden benadrukt in de opleiding van het personeel over moleculaire methoden.

Na gebruik moeten de bankruimten worden gereinigd met 10% natriumhypochloriet (gevolgd door steriel water om bleekmiddelresten te verwijderen), 70% ethanol of een gevalideerd, in de handel verkrijgbaar, DNA-vernietigend ontsmettingsmiddel.Idealiter zouden ultraviolette (UV) lampen moeten worden gemonteerd om ontsmetting door bestraling mogelijk te maken.Het gebruik van UV-lampen moet echter worden beperkt tot gesloten werkruimten, bijv. veiligheidskasten, om de UV-blootstelling van het laboratoriumpersoneel te beperken.Houd u aan de instructies van de fabrikant voor onderhoud, ventilatie en reiniging van de UV-lamp om ervoor te zorgen dat de lampen effectief blijven.

Als u 70% ethanol gebruikt in plaats van natriumhypochloriet, is bestraling met UV-licht nodig om de ontsmetting te voltooien.
Maak de vortex en centrifuge niet schoon met natriumhypochloriet;veeg in plaats daarvan af met 70% ethanol en stel het bloot aan UV-licht, of gebruik een commercieel DNA-vernietigend ontsmettingsmiddel.Neem bij morsen contact op met de fabrikant voor verder reinigingsadvies.Als de instructies van de fabrikant dit toelaten, moeten pipetten routinematig worden gesteriliseerd in een autoclaaf.Als pipetten niet kunnen worden geautoclaveerd, zou het voldoende moeten zijn om ze te reinigen met 10% natriumhypochloriet (gevolgd door grondig afvegen met steriel water) of met een in de handel verkrijgbare DNA-vernietigende ontsmettingsmiddel gevolgd door UV-blootstelling.

Reiniging met natriumhypochloriet met een hoog percentage kan uiteindelijk plastic en metalen van pipetten beschadigen als dit regelmatig wordt gedaan;controleer eerst de aanbevelingen van de fabrikant.Alle apparatuur moet regelmatig worden gekalibreerd volgens het door de fabrikant aanbevolen schema.Een aangewezen persoon moet ervoor zorgen dat het kalibratieschema wordt nageleefd, gedetailleerde logboeken worden bijgehouden en servicelabels duidelijk op de apparatuur worden weergegeven.

3. Gebruiks- en schoonmaakadvies voor de daarvoor bestemde moleculaire ruimte

Pre-PCR: Reagens aliquoting / mastermix voorbereiding: Dit zou de schoonste van alle ruimtes moeten zijn die worden gebruikt voor de voorbereiding van moleculaire experimenten en zou idealiter een aangewezen laminaire flowkast moeten zijn die is uitgerust met een UV-lamp.Monsters, geëxtraheerd nucleïnezuur en geamplificeerde PCR-producten mogen in deze ruimte niet worden gehanteerd.Amplificatiereagentia moeten in een vriezer (of koelkast, volgens de aanbevelingen van de fabrikant) worden bewaard in dezelfde daarvoor bestemde ruimte, bij voorkeur naast de laminaire flowkast of het pre-PCR-gebied.Handschoenen moeten elke keer worden vervangen bij het betreden van het pre-PCR-gebied of de laminaire flowkast.

De pre-PCR-ruimte of laminaire flowkast moet voor en na gebruik als volgt worden gereinigd: Veeg alle items in de kast, bijv. pipetten, tipdozen, vortex, centrifuge, buisjesrekken, pennen enz. commerciële DNA-vernietigende ontsmettingsmiddel en laat drogen.In het geval van een gesloten werkruimte, bijv. een laminaire flowkast, stelt u de kap gedurende 30 minuten bloot aan UV-licht.

Opmerking

Stel reagentia niet bloot aan UV-licht;plaats ze pas in de kast als deze schoon is.Bij het uitvoeren van reverse transcriptie-PCR kan het ook nuttig zijn om oppervlakken en apparatuur schoon te vegen met een oplossing die RNases bij contact afbreekt.Dit kan helpen om vals-negatieve resultaten van enzymafbraak van RNA te voorkomen.Na decontaminatie en voor het bereiden van de mastermix moeten de handschoenen nog een keer worden gewisseld en is de kast klaar voor gebruik.

Pre-PCR: extractie van nucleïnezuur/toevoeging van sjabloon:

Nucleïnezuur moet worden geëxtraheerd en gehanteerd in een tweede aangewezen ruimte, met behulp van een aparte set pipetten, filtertips, buizenrekken, verse handschoenen, laboratoriumjassen en andere apparatuur. Deze ruimte is ook voor het toevoegen van sjabloon, controles en trendlijnen aan de mastermix buizen of platen.Om verontreiniging van de geëxtraheerde nucleïnezuurmonsters die worden geanalyseerd te voorkomen, wordt aanbevolen de handschoenen te vervangen voordat u positieve controles of standaarden aanraakt en een aparte set pipetten te gebruiken.PCR-reagentia en geamplificeerde producten mogen in dit gebied niet worden gepipetteerd.Monsters moeten in de daarvoor bestemde koelkasten of diepvriezers in dezelfde ruimte worden bewaard.De voorbeeldwerkruimte moet op dezelfde manier worden schoongemaakt als de mastermixruimte.

Post-PCR: amplificatie en behandeling van het geamplificeerde product

Deze aangewezen ruimte is voor post-amplificatieprocessen en moet fysiek gescheiden zijn van de pre-PCR-gebieden.Het bevat meestal thermocyclers en real-time platforms, en zou idealiter een laminaire flowkast moeten hebben om het ronde 1 PCR-product toe te voegen aan de ronde 2-reactie, als geneste PCR wordt uitgevoerd.PCR-reagentia en geëxtraheerd nucleïnezuur mogen in dit gebied niet worden gehanteerd, aangezien het risico op besmetting groot is.Deze ruimte moet beschikken over een aparte set handschoenen, laboratoriumjassen, platen- en buizenrekken, pipetten, filtertips, bakken en andere apparatuur.Buizen moeten worden gecentrifugeerd voordat ze worden geopend.De voorbeeldwerkruimte moet op dezelfde manier worden schoongemaakt als de mastermixruimte.

Post-PCR: productanalyse

Deze ruimte is voor productdetectieapparatuur, zoals gelelektroforesetanks, powerpacks, UV-transilluminator en het geldocumentatiesysteem.In deze ruimte moeten afzonderlijke sets handschoenen, laboratoriumjassen, platen- en buizenrekken, pipetten, filtertips, bakken en andere apparatuur aanwezig zijn.Er mogen geen andere reagentia in dit gebied worden gebracht, met uitzondering van laadkleurstof, moleculaire marker en agarosegel en buffercomponenten.De voorbeeldwerkruimte moet op dezelfde manier worden schoongemaakt als de mastermixruimte.

Belangrijke notitie

Idealiter worden de pre-PCR-kamers niet op dezelfde dag betreden als er al werkzaamheden in de post-PCR-kamers zijn uitgevoerd.Als dit echt niet te vermijden is, zorg er dan voor dat eerst de handen grondig worden gewassen en dat er specifieke labojassen in de kamers worden gedragen.Labboeken en papierwerk mogen niet worden meegenomen in de pre-PCR-kamers als ze zijn gebruikt in de post-PCR-kamers;maak indien nodig dubbele afdrukken van protocollen/monster-ID's, enz.

4. Algemeen moleculair biologisch advies

Gebruik poedervrije handschoenen om testremming te voorkomen.De juiste pipetteertechniek is van het grootste belang om verontreiniging te verminderen.Onjuist pipetteren kan leiden tot spatten bij het doseren van vloeistoffen en het ontstaan ​​van aerosolen.Goede praktijken voor correct pipetteren zijn te vinden via de volgende links: Gilson-gids voor pipetteren, video's over Anachem-pipetteertechniek, centrifugeerbuisjes voor openen en open ze voorzichtig om spatten te voorkomen.Sluit de tubes onmiddellijk na gebruik om het binnendringen van verontreinigingen te voorkomen.

Bij het uitvoeren van meerdere reacties, bereidt u één mastermix met gemeenschappelijke reagentia (bijv. water, dNTP's, buffer, primers en enzym) om het aantal reagensoverdrachten te minimaliseren en de kans op verontreiniging te verminderen.Het wordt aanbevolen om de mastermix op ijs of een koud blok op te zetten.Het gebruik van een Hot Start-enzym kan helpen om de productie van niet-specifieke producten te verminderen.Bescherm reagentia die fluorescerende sondes bevatten tegen licht om degradatie te voorkomen.

5. Interne controles

Neem goed gekarakteriseerde, bevestigde positieve en negatieve controles op, samen met een controle zonder sjabloon in alle reacties, en een meerpunts getitreerde trendlijn voor kwantitatieve reacties.De positieve controle mag niet zo sterk zijn dat er een besmettingsrisico ontstaat.Neem positieve en negatieve extractiecontroles op bij het uitvoeren van nucleïnezuurextractie.

Het verdient aanbeveling om in elk van de ruimtes duidelijke instructies te plaatsen zodat gebruikers op de hoogte zijn van de gedragsregels.Diagnostische laboratoria die zeer lage niveaus van DNA of RNA in klinische monsters detecteren, willen misschien de aanvullende veiligheidsmaatregel toepassen om aparte luchtbehandelingssystemen te hebben met licht positieve luchtdruk in de pre-PCR-kamers en licht negatieve luchtdruk in de post-PCR-kamers.

Ten slotte is het nuttig om een ​​plan voor kwaliteitsborging (QA) te ontwikkelen.Zo'n plan moet lijsten bevatten met hoofdvoorraden reagentia en werkvoorraden, regels voor het opslaan van kits en reagentia, rapportage van controleresultaten, trainingsprogramma's voor personeel, algoritmen voor het oplossen van problemen en herstelmaatregelen indien nodig.

6. Bibliografie

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Hoofdstuk 3: Het opzetten van een qPCR-laboratorium.Een document met richtlijnen voor het testen van recreatiewateren met behulp van USEPA qPCR-methode 1611. Lansing-Michigan State University.

Volksgezondheid Engeland, NHS.Britse normen voor microbiologisch onderzoek: goede laboratoriumpraktijken bij het uitvoeren van moleculaire amplificatietesten).Kwaliteitsbegeleiding.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Opzetten van een PCR-laboratorium.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Routineonderhoud van centrifuges: reiniging, onderhoud en desinfectie van centrifuges, rotors en adapters (Witboek nr. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) voor moleculair gebaseerde tests die worden gebruikt in diagnostische laboratoria, In: Akyar I, redacteur.Brede spectra van kwaliteitscontrole.Rijeka, Kroatië: Intech;2011: 29-52.