आणविक पत्ता लगाउने विधिहरूमा नमूनाहरूमा पाइने ट्रेस मात्राहरूको प्रवर्धन मार्फत न्यूक्लिक एसिडको ठूलो मात्रा उत्पादन गर्ने क्षमता हुन्छ।जबकि यो संवेदनशील पहिचान सक्षम गर्न को लागी फायदेमंद छ, यसले प्रयोगशाला वातावरणमा एम्प्लीफिकेशन एरोसोलको फैलावट मार्फत दूषित हुने सम्भावनालाई पनि परिचय गराउँछ।प्रयोगहरू सञ्चालन गर्दा, अभिकर्मकहरू, प्रयोगशाला उपकरणहरू र बेन्च स्पेसको प्रदूषणबाट बच्न उपायहरू गर्न सकिन्छ, किनकि यस्तो प्रदूषणले गलत-सकारात्मक (वा गलत-नकारात्मक) परिणामहरू उत्पन्न गर्न सक्छ।

प्रदूषणको सम्भावना कम गर्न मद्दत गर्न, राम्रो प्रयोगशाला अभ्यास सधैं अभ्यास गर्नुपर्छ।विशेष गरी, निम्न बिन्दुहरूमा सावधानी अपनाउनु पर्छ:

1. अभिकर्मक ह्यान्डलिंग
2. कार्यस्थल र उपकरणहरूको संगठन
3. निर्दिष्ट आणविक ठाउँको लागि प्रयोग र सफाई सल्लाह
4. सामान्य आणविक जीवविज्ञान सल्लाह
5. आन्तरिक नियन्त्रणहरू
६. ग्रन्थसूची

1. अभिकर्मक ह्यान्डलिंग

एरोसोलको उत्पादनबाट बच्न खोल्नु अघि संक्षेपमा सेन्ट्रीफ्यूज अभिकर्मक ट्यूबहरू।एलीकोट अभिकर्मकहरू धेरै फ्रिज-थाउ र मास्टर स्टकहरूको प्रदूषणबाट बच्न।सबै अभिकर्मक र प्रतिक्रिया ट्यूबहरू स्पष्ट रूपमा लेबल गर्नुहोस् र मिति दिनुहोस् र सबै प्रयोगहरूमा प्रयोग गरिएका अभिकर्मक लट र ब्याच नम्बरहरूको लगहरू राख्नुहोस्।फिल्टर सुझावहरू प्रयोग गरेर सबै अभिकर्मक र नमूनाहरू पिपेट गर्नुहोस्।खरिद गर्नु अघि, यो निर्मातासँग पुष्टि गर्न सल्लाह दिइन्छ कि फिल्टर सुझावहरू पिपेटको ब्रान्ड प्रयोग गर्न मिल्छ।

2. कार्यस्थल र उपकरणहरूको संगठन

कामको प्रवाह एउटै दिशामा हुन्छ भनी सुनिश्चित गर्न कार्यस्थललाई व्यवस्थित गरिनुपर्छ, सफा क्षेत्रहरू (प्रि-पीसीआर) देखि फोहोर क्षेत्रहरू (पीसीआर पछि)।निम्न सामान्य सावधानीहरूले प्रदूषणको सम्भावना कम गर्न मद्दत गर्नेछ।मास्टरमिक्स तयारी, न्यूक्लिक एसिड निकासी र डीएनए टेम्प्लेट थप्ने, एम्प्लीफाइड उत्पादनको प्रवर्द्धन र ह्यान्डलिंग, र उत्पादन विश्लेषण, जस्तै जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसको लागि छुट्टै तोकिएको कोठा, वा न्यूनतम भौतिक रूपमा छुट्टै क्षेत्रहरू।

केही सेटिङहरूमा, 4 अलग कोठा हुन गाह्रो छ।सम्भावित तर कम वांछनीय विकल्प भनेको कन्टेनमेन्ट क्षेत्रमा मास्टरमिक्सको तयारी गर्नु हो, जस्तै लामिनार फ्लो क्याबिनेट।नेस्टेड पीसीआर एम्प्लिफिकेशनको अवस्थामा, मास्टरमिक्सको तयारीको लागि दोस्रो राउन्ड प्रतिक्रियाको लागि मास्टरमिक्सको तयारी 'स्वच्छ' क्षेत्रमा गर्नुपर्छ, तर प्राथमिक पीसीआर उत्पादनको साथ इनोकुलेशन एम्प्लीफिकेशन कोठामा गर्नुपर्छ, र सम्भव भएमा। एक समर्पित कन्टेनमेन्ट क्षेत्रमा (जस्तै लामिनार प्रवाह क्याबिनेट)।

प्रत्येक कोठा/क्षेत्रलाई स्पष्ट रूपमा लेबल गरिएको पाइपेट, फिल्टर टिप्स, ट्यूब र्याक, भोर्टेक्स, सेन्ट्रीफ्यूज (यदि सान्दर्भिक भएमा), कलम, जेनेरिक प्रयोगशाला अभिकर्मक, प्रयोगशाला कोट र पन्जाको बक्सहरू आवश्यक पर्दछ जुन तिनीहरूको सम्बन्धित कार्यस्थानहरूमा रहनेछन्।तोकिएको क्षेत्रहरू बीचमा हिंड्दा हात धुनुपर्छ र पञ्जा र प्रयोगशाला कोटहरू परिवर्तन गर्नुपर्छ।अभिकर्मक र उपकरणहरू फोहोर क्षेत्रबाट सफा क्षेत्रमा सार्नु हुँदैन।यदि कुनै चरम अवस्था उत्पन्न भएमा जहाँ एक अभिकर्मक वा उपकरणको टुक्रालाई पछाडि सार्न आवश्यक छ, यसलाई पहिले 10% सोडियम हाइपोक्लोराइटले प्रशोधन गर्नुपर्दछ, त्यसपछि बाँझ पानीले सफा गर्नुहोस्।

नोट

10% सोडियम हाइपोक्लोराइट घोल दैनिक ताजा बनाउनु पर्छ।विशुद्धीकरणको लागि प्रयोग गर्दा, न्यूनतम 10 मिनेटको सम्पर्क समय पालन गर्नुपर्छ।
वैकल्पिक रूपमा, यदि स्थानीय सुरक्षा सिफारिसहरूले सोडियम हाइपोक्लोराइटको प्रयोगलाई अनुमति दिँदैन भने वा सोडियम हाइपोक्लोराइट उपकरणका धातुका भागहरू डिकन्टेमिनट गर्न उपयुक्त नभएमा DNA-नाश गर्ने सतह डिकन्टामिनन्टहरूको रूपमा प्रमाणित व्यावसायिक रूपमा उपलब्ध उत्पादनहरू प्रयोग गर्न सकिन्छ।

आदर्श रूपमा, कर्मचारीहरूले दिशाहीन कार्य प्रवाह नीतिको पालना गर्नुपर्छ र फोहोर क्षेत्रहरू (PCR पछि) बाट एकै दिन सफा क्षेत्रहरूमा (पूर्व-PCR) जानु हुँदैन।यद्यपि, त्यहाँ अवसरहरू हुन सक्छन् जब यो अपरिहार्य छ।यस्तो अवसर आउँदा, कर्मचारीहरूले राम्ररी हात धुने, पन्जा फेर्ने, तोकिएको ल्याब कोट प्रयोग गर्ने र ल्याब पुस्तकहरू जस्ता उनीहरूले फेरि कोठाबाट बाहिर निकाल्न चाहेको कुनै पनि उपकरणहरू परिचय नगर्न ख्याल गर्नुपर्छ।त्यस्ता नियन्त्रण उपायहरूलाई आणविक विधिहरूमा कर्मचारी प्रशिक्षणमा जोड दिनु पर्छ।

प्रयोग पछि, बेन्च स्पेसहरू 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट (अवशिष्ट ब्लीच हटाउन बाँझ पानी पछि), 70% इथानोल, वा व्यावसायिक रूपमा उपलब्ध DNA-नाश गर्ने डिकन्टामिनेन्टले सफा गर्नुपर्छ।आदर्श रूपमा, विकिरणद्वारा विकिरणलाई सक्षम पार्न अल्ट्रा-वायलेट (UV) बत्तीहरू जडान गरिनुपर्छ।यद्यपि, प्रयोगशाला कर्मचारीहरूको पराबैंगनी एक्सपोजरलाई सीमित गर्न UV बत्तीहरूको प्रयोग बन्द काम गर्ने ठाउँहरूमा, जस्तै सुरक्षा क्याबिनेटहरूमा सीमित हुनुपर्छ।कृपया UV बत्तीको हेरचाह, भेन्टिलेसन र सरसफाईको लागि बत्तीहरू प्रभावकारी रहन सुनिश्चित गर्न निर्माताको निर्देशनहरूको पालना गर्नुहोस्।

यदि सोडियम हाइपोक्लोराइटको सट्टा 70% इथानोल प्रयोग गरिन्छ भने, पराबैंगनी प्रकाशको साथ विकिरणको आवश्यकता पर्नेछ।
सोडियम हाइपोक्लोराइटको साथ भोर्टेक्स र सेन्ट्रीफ्यूज सफा नगर्नुहोस्;यसको सट्टा, 70% इथेनोलले मेटाउनुहोस् र UV प्रकाशमा पर्दाफास गर्नुहोस्, वा व्यावसायिक DNA-नाश गर्ने डिकन्टामिनेन्ट प्रयोग गर्नुहोस्।स्पिलहरूको लागि, थप सफाई सल्लाहको लागि निर्मातासँग जाँच गर्नुहोस्।यदि निर्माता निर्देशनहरूले यसलाई अनुमति दिन्छ भने, पाइपेटहरू नियमित रूपमा अटोक्लेभद्वारा बाँझ गर्नुपर्छ।यदि पिपेटहरू अटोक्लेभ गर्न सकिँदैन भने, तिनीहरूलाई 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट (बाँकी पानीले राम्ररी पखाल्नुहोस्) वा व्यावसायिक DNA-नाश गर्ने डिकन्टामिनेन्टले UV एक्सपोजर पछि सफा गर्न पर्याप्त हुनुपर्छ।

उच्च-प्रतिशत सोडियम हाइपोक्लोराइटको साथ सफाई नियमित रूपमा गरिएमा अन्ततः पिपेट प्लास्टिक र धातुहरूलाई क्षति पुर्याउन सक्छ;पहिले निर्माताबाट सिफारिसहरू जाँच गर्नुहोस्।सबै उपकरणहरू निर्माता-सिफारिस गरिएको तालिका अनुसार नियमित रूपमा क्यालिब्रेट गर्न आवश्यक छ।क्यालिब्रेसन तालिका पालना गरिएको छ, विस्तृत लगहरू राखिएको छ, र उपकरणहरूमा सेवा लेबलहरू स्पष्ट रूपमा देखाइएको छ भनी सुनिश्चित गर्न एक तोकिएको व्यक्तिको जिम्मेवारी हुनुपर्छ।

3. निर्दिष्ट आणविक ठाउँको लागि प्रयोग र सफाई सल्लाह

प्रि-पीसीआर: अभिकर्मक अलिकोटिंग / मास्टरमिक्स तयारी: यो आणविक प्रयोगहरूको तयारीको लागि प्रयोग गरिने सबै ठाउँहरूमध्ये सबैभन्दा सफा हुनुपर्छ र आदर्श रूपमा यूभी प्रकाशले सुसज्जित एक तोकिएको लामिनार फ्लो क्याबिनेट हुनुपर्छ।नमूनाहरू, निकालिएको न्यूक्लिक एसिड र एम्प्लीफाइड PCR उत्पादनहरू यस क्षेत्रमा ह्यान्डल गर्नु हुँदैन।एम्प्लीफिकेशन अभिकर्मकहरूलाई फ्रिजर (वा फ्रिज, निर्माताको सिफारिस अनुसार) समान तोकिएको ठाउँमा राख्नुपर्छ, आदर्श रूपमा लामिनार फ्लो क्याबिनेट वा प्रि-पीसीआर क्षेत्रको छेउमा।प्रि-पीसीआर क्षेत्र वा लामिनार फ्लो क्याबिनेटमा प्रवेश गर्दा पन्जाहरू प्रत्येक पटक परिवर्तन गर्नुपर्छ।

प्रि-पीसीआर क्षेत्र वा लामिनार फ्लो क्याबिनेट प्रयोग गर्नु अघि र पछि निम्नानुसार सफा गर्नुपर्छ: क्याबिनेटमा रहेका सबै वस्तुहरू, जस्तै पिपेट, टिप बक्स, भोर्टेक्स, सेन्ट्रीफ्यूज, ट्युब र्याक, पेन, इत्यादि ७०% इथानोल वा एथेनोलले सफा गर्नुहोस्। व्यावसायिक डीएनए-विनाशकारी नष्ट गर्ने, र सुक्न अनुमति दिन्छ।बन्द कार्य क्षेत्रको अवस्थामा, जस्तै लामिनार फ्लो क्याबिनेट, हुडलाई ३० मिनेटको लागि UV प्रकाशमा पर्दाफास गर्नुहोस्।

नोट

यूवी प्रकाशमा अभिकर्मकहरू उजागर नगर्नुहोस्;सफा भएपछि मात्र तिनीहरूलाई क्याबिनेटमा सार्नुहोस्।यदि रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शन PCR प्रदर्शन गर्दै, यो सम्पर्कमा RNases बिच्छेदन गर्ने समाधानको साथ सतहहरू र उपकरणहरू मेटाउन पनि उपयोगी हुन सक्छ।यसले RNA को इन्जाइम गिरावटबाट गलत-नकारात्मक परिणामहरूबाट बच्न मद्दत गर्न सक्छ।विशुद्धीकरण पछि र मास्टरमिक्स तयार गर्नु अघि, पन्जाहरू फेरि एक पटक परिवर्तन गर्नुपर्छ, र त्यसपछि क्याबिनेट प्रयोगको लागि तयार छ।

Pre-PCR: न्यूक्लिक एसिड निकासी/टेम्प्लेट थप:

पिपेट, फिल्टर टिप्स, ट्युब र्याक, ताजा पन्जा, ल्याब कोट र अन्य उपकरणहरू प्रयोग गरी दोस्रो तोकिएको क्षेत्रमा न्यूक्लिक एसिड निकाल्न र ह्यान्डल गर्नुपर्छ। यो क्षेत्र टेम्प्लेट, नियन्त्रण र ट्रेन्डलाइनहरू थप्नको लागि पनि हो। मास्टरमिक्स ट्यूब वा प्लेटहरू।विश्लेषण गरिँदै आएका निकालिएका न्यूक्लिक एसिड नमूनाहरूको प्रदूषणबाट बच्न, सकारात्मक नियन्त्रण वा मापदण्डहरू ह्यान्डल गर्नु अघि पन्जाहरू परिवर्तन गर्न र पिपेटहरूको छुट्टै सेट प्रयोग गर्न सिफारिस गरिन्छ।PCR अभिकर्मकहरू र एम्प्लीफाइड उत्पादनहरू यस क्षेत्रमा पाइप गरिएको हुनु हुँदैन।नमूनाहरू एउटै क्षेत्रमा तोकिएको फ्रिज वा फ्रिजरहरूमा भण्डारण गर्नुपर्छ।नमूना कार्यस्थान मास्टरमिक्स स्पेस जस्तै सफा गर्नुपर्छ।

पोस्ट-पीसीआर: एम्प्लीफाइड उत्पादनको प्रवर्धन र ह्यान्डलिंग

यो तोकिएको ठाउँ पोस्ट-प्रवर्द्धन प्रक्रियाहरूको लागि हो र भौतिक रूपमा पूर्व-PCR क्षेत्रहरूबाट अलग हुनुपर्छ।यसले सामान्यतया थर्मोसाइकलरहरू र वास्तविक-समय प्लेटफर्महरू समावेश गर्दछ, र आदर्श रूपमा राउन्ड 1 PCR उत्पादन राउन्ड 2 प्रतिक्रियामा थप्नको लागि एक लामिनार फ्लो क्याबिनेट हुनुपर्छ, यदि नेस्टेड PCR प्रदर्शन भइरहेको छ।PCR अभिकर्मक र निकालिएको न्यूक्लिक एसिड यस क्षेत्रमा ह्यान्डल गर्नु हुँदैन किनभने प्रदूषणको जोखिम उच्च छ।यस क्षेत्रमा पन्जा, प्रयोगशाला कोट, प्लेट र ट्यूब र्याक, पाइपेट, फिल्टर टिप्स, बिन र अन्य उपकरणहरूको छुट्टै सेट हुनुपर्छ।ट्यूबहरू खोल्नु अघि सेन्ट्रीफ्यूज हुनुपर्छ।नमूना कार्यस्थान मास्टरमिक्स स्पेस जस्तै सफा गर्नुपर्छ।

पोस्ट-पीसीआर: उत्पादन विश्लेषण

यो कोठा उत्पादन पत्ता लगाउने उपकरण, जस्तै जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस ट्याङ्की, पावर प्याक, यूभी ट्रान्सिल्युमिनेटर र जेल कागजात प्रणालीको लागि हो।यस क्षेत्रमा पन्जा, ल्याब कोट, प्लेट र ट्यूब र्याक, पाइपेट, फिल्टर टिप्स, बिन र अन्य उपकरणहरूको छुट्टै सेट हुनुपर्छ।लोडिङ डाई, मोलिक्युलर मार्कर र एगारोज जेल, र बफर कम्पोनेन्टहरू बाहेक यस क्षेत्रमा कुनै अन्य अभिकर्मकहरू ल्याउन सकिँदैन।नमूना कार्यस्थान मास्टरमिक्स स्पेस जस्तै सफा गर्नुपर्छ।

महत्त्वपूर्ण नोट

आदर्श रूपमा, PCR पछिको कोठाहरूमा पहिले नै काम सम्पन्न भइसकेको खण्डमा सोही दिन प्रि-पीसीआर कोठाहरूमा प्रवेश गर्नु हुँदैन।यदि यो पूर्णतया अपरिहार्य छ भने, सुनिश्चित गर्नुहोस् कि हातहरू पहिले राम्ररी धुनुहोस् र कोठाहरूमा विशेष प्रयोगशाला कोटहरू लगाइएका छन्।ल्याब पुस्तकहरू र कागजी कार्यहरू PCR-पछिको कोठाहरूमा प्रयोग गरिएको भए पूर्व-PCR कोठाहरूमा लैजानु हुँदैन;आवश्यक भएमा, प्रोटोकल/नमूना आईडी, आदिको नक्कल प्रिन्ट-आउटहरू लिनुहोस्।

4. सामान्य आणविक जीवविज्ञान सल्लाह

परख निषेधबाट बच्न पाउडर-मुक्त पन्जाहरू प्रयोग गर्नुहोस्।सही पाइपिङ प्रविधि प्रदूषण कम गर्न सर्वोपरि छ।तरल पदार्थहरू वितरण गर्दा र एरोसोलहरू सिर्जना गर्दा गलत पाइपिङले स्प्ल्याश हुन सक्छ।सही पाइपिङको लागि राम्रो अभ्यास निम्न लिङ्कहरूमा फेला पार्न सकिन्छ: पाइपिङको लागि गिल्सन गाइड, एनाकेम पाइपिङ प्रविधि भिडियोहरू, सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबहरू खोल्नु अघि, र छिट्टैबाट बच्न तिनीहरूलाई सावधानीपूर्वक खोल्नुहोस्।दूषित पदार्थहरूको परिचयबाट बच्न प्रयोग पछि तुरुन्तै ट्यूबहरू बन्द गर्नुहोस्।

धेरै प्रतिक्रियाहरू प्रदर्शन गर्दा, अभिकर्मक स्थानान्तरणको संख्या कम गर्न र प्रदुषणको खतरा कम गर्न साझा अभिकर्मकहरू (जस्तै पानी, dNTPs, बफर, प्राइमर र इन्जाइम) भएको एउटा मास्टरमिक्स तयार गर्नुहोस्।यो बर्फ वा चिसो ब्लक मा मास्टरमिक्स सेटअप गर्न सिफारिस गरिएको छ।हट स्टार्ट इन्जाइमको प्रयोगले गैर-विशिष्ट उत्पादनहरूको उत्पादन कम गर्न मद्दत गर्न सक्छ।फ्लोरोसेन्ट प्रोबहरू भएका अभिकर्मकहरूलाई प्रकाशबाट जोगाउनको लागि डिग्रेडेशनबाट बच्न।

5. आन्तरिक नियन्त्रणहरू

सबै प्रतिक्रियाहरूमा नो-टेम्प्लेट नियन्त्रण, र मात्रात्मक प्रतिक्रियाहरूको लागि बहु-बिन्दु टायट्रेट ट्रेन्डलाइनको साथमा राम्रो-विशेष, पुष्टि गरिएको सकारात्मक र नकारात्मक नियन्त्रणहरू समावेश गर्नुहोस्।सकारात्मक नियन्त्रण यति बलियो हुनु हुँदैन कि यसले प्रदुषण जोखिम निम्त्याउँछ।न्यूक्लिक एसिड निकासी गर्दा सकारात्मक र नकारात्मक निकासी नियन्त्रणहरू समावेश गर्नुहोस्।

यो सिफारिस गरिन्छ कि प्रत्येक क्षेत्रमा स्पष्ट निर्देशनहरू पोस्ट गरिनु पर्छ ताकि प्रयोगकर्ताहरू आचरण नियमहरू बारे सचेत छन्।क्लिनिकल नमूनाहरूमा DNA वा RNA को धेरै कम स्तरहरू पत्ता लगाउने डायग्नोस्टिक प्रयोगशालाहरूले PCR पूर्व कोठाहरूमा थोरै सकारात्मक हावाको चाप र PCR पछिको कोठाहरूमा थोरै नकारात्मक हावाको चापको साथ छुट्टै एयर ह्यान्डलिंग प्रणालीहरू राख्ने अतिरिक्त सुरक्षा उपाय अपनाउन चाहन्छन्।

अन्तमा, गुणस्तर आश्वासन (QA) योजना विकास गर्नु उपयोगी हुन्छ।यस्तो योजनामा ​​अभिकर्मक मास्टर स्टक र काम गर्ने स्टकहरूको सूची, किटहरू र अभिकर्मकहरू भण्डारण गर्ने नियमहरू, नियन्त्रण परिणामहरूको रिपोर्टिङ, कर्मचारी प्रशिक्षण कार्यक्रमहरू, समस्या निवारण एल्गोरिदमहरू, र आवश्यक पर्दा उपचारात्मक कार्यहरू समावेश हुनुपर्छ।

६. ग्रन्थसूची

Aslan A, Kinzelman J, Drelin E, Anan'eva T, Lavander J. अध्याय 3: qPCR प्रयोगशाला स्थापना गर्दै।USEPA qPCR विधि 1611 प्रयोग गरेर मनोरञ्जनात्मक पानी परीक्षण गर्नको लागि मार्गदर्शन कागजात। Lansing- Michigan State University।

सार्वजनिक स्वास्थ्य इङ्गल्याण्ड, NHS।माइक्रोबायोलोजी अनुसन्धानका लागि युके मापदण्डहरू: आणविक प्रवर्धन assess प्रदर्शन गर्दा राम्रो प्रयोगशाला अभ्यास)।गुणस्तर निर्देशन।२०१३;४(४):१–१५।

Mifflin T. PCR प्रयोगशाला स्थापना गर्दै।कोल्ड स्प्रिंग हार्ब प्रोटोक।2007; 7।

Schroeder S 2013. सेन्ट्रीफ्यूजको नियमित मर्मतसम्भार: सेन्ट्रीफ्यूज, रोटर र एडेप्टरहरूको सफाई, मर्मत र कीटाणुशोधन (सेतो कागज नम्बर 14)।ह्याम्बर्ग: Eppendorf;२०१३।

वियाना आरवी, वालिस सीएल।डायग्नोस्टिक प्रयोगशालाहरूमा प्रयोग हुने आणविक आधारित परीक्षणहरूको लागि राम्रो क्लिनिकल प्रयोगशाला अभ्यास (GCLP), In: Akyar I, सम्पादक।गुणस्तर नियन्त्रणको फराकिलो स्पेक्ट्रा।रिजेका, क्रोएसिया: इन्टेक;2011: 29-52।