Metodi ta 'skoperta molekulari għandhom il-kapaċità li jipproduċu volum kbir ta' aċidu nuklejku permezz tal-amplifikazzjoni ta 'kwantitajiet ta' traċċi misjuba fil-kampjuni.Filwaqt li dan huwa ta 'benefiċċju biex jippermetti skoperta sensittiva, jintroduċi wkoll il-possibbiltà ta' kontaminazzjoni permezz tat-tixrid ta 'aerosols ta' amplifikazzjoni fl-ambjent tal-laboratorju.Meta jsiru esperimenti, jistgħu jittieħdu miżuri biex tiġi evitata l-kontaminazzjoni ta 'reaġenti, tagħmir tal-laboratorju u spazju fuq il-bank, peress li tali kontaminazzjoni tista' tiġġenera riżultati pożittivi foloz (jew negattivi foloz).

Biex tgħin titnaqqas il-probabbiltà ta' kontaminazzjoni, għandha tiġi eżerċitata Prattika Tajba tal-Laboratorju f'kull ħin.Speċifikament, għandhom jittieħdu prekawzjonijiet rigward il-punti li ġejjin:

1. Immaniġġjar tar-reaġenti
2. Organizzazzjoni ta 'spazju tax-xogħol u tagħmir
3. Pariri dwar l-użu u t-tindif għall-ispazju molekulari magħżul
4. Parir ġenerali dwar il-bijoloġija molekulari
5. Kontrolli interni
6. Biblijografija

1. Immaniġġjar tar-reaġenti

Iċċentrifuga fil-qosor tubi tar-reaġent qabel jinfetħu biex tevita l-ġenerazzjoni ta 'aerosols.Reaġenti alikwot biex jiġu evitati ffriżar-tidwib multipli u l-kontaminazzjoni tal-ħażniet prinċipali.Ittikkettja u ddata b'mod ċar it-tubi tar-reaġent u tar-reazzjoni kollha u żomm ir-reġistri tan-numri tal-lott tar-reaġenti u tal-lott użati fl-esperimenti kollha.Ippetta r-reaġenti u l-kampjuni kollha billi tuża l-ponot tal-filtri.Qabel ix-xiri, huwa rakkomandabbli li tikkonferma mal-manifattur li l-ponot tal-filtru jaqblu mal-marka tal-pipetta li għandha tintuża.

2. Organizzazzjoni ta 'spazju tax-xogħol u tagħmir

L-ispazju tax-xogħol għandu jiġi organizzat biex jiġi żgurat li l-fluss tax-xogħol iseħħ f'direzzjoni waħda, minn żoni nodfa (pre-PCR) għal żoni maħmuġin (post-PCR).Il-prekawzjonijiet ġenerali li ġejjin se jgħinu biex jitnaqqas iċ-ċans ta 'kontaminazzjoni.Ikollhom kmamar magħżula separati, jew għall-inqas żoni fiżikament separati, għal: preparazzjoni ta' mastermix, estrazzjoni ta' aċidu nuklejku u żieda ta' mudell tad-DNA, amplifikazzjoni u tqandil ta' prodott amplifikat, u analiżi tal-prodott, eż. elettroforeżi tal-ġel.

F'xi settings, li jkollok 4 kmamar separati huwa diffiċli.Għażla possibbli iżda inqas mixtieqa hija li tagħmel il-preparazzjoni tal-mastermix f'żona ta' trażżin, eż. kabinett tal-fluss laminari.Fil-każ ta 'amplifikazzjoni tal-PCR nested, il-preparazzjoni tal-mastermix għar-reazzjoni tat-tieni rawnd għandha tkun ippreparata fiż-żona 'nadifa' għall-preparazzjoni tal-mastermix, iżda l-inokulazzjoni mal-prodott primarju tal-PCR għandha ssir fil-kamra tal-amplifikazzjoni, u jekk possibbli f'żona dedikata għall-konteniment (eż. kabinett tal-fluss laminari).

Kull kamra/żona teħtieġ sett separat ta’ pipetti ttikkettjati b’mod ċar, ponot tal-filtri, xtillieri tat-tubi, vortiċi, ċentrifugi (jekk rilevanti), pinen, reaġenti ġeneriċi tal-laboratorju, kowtijiet tal-laboratorju u kaxxi tal-ingwanti li jibqgħu fil-postijiet tax-xogħol rispettivi tagħhom.L-idejn għandhom jinħaslu u l-ingwanti u l-kowtijiet tal-laboratorju jinbidlu meta jiċċaqilqu bejn iż-żoni magħżula.Ir-reaġenti u t-tagħmir m'għandhomx jiġu mċaqalqa minn żona maħmuġa għal żona nadifa.Jekk jinqala' każ estrem fejn reaġent jew biċċa tagħmir jeħtieġ li jiġi mċaqlaq lura, l-ewwel irid jiġi dekontaminat b'10% ipoklorit tas-sodju, segwit minn imsaħ b'ilma sterili.

Nota

Is-soluzzjoni ta' 10% ta' ipoklorit tas-sodju trid tkun magħmula friska kuljum.Meta jintuża għad-dekontaminazzjoni, għandu jiġi rispettat ħin ta' kuntatt minimu ta' 10 minuti.
Alternattivament, prodotti disponibbli kummerċjalment li huma validati bħala dekontaminanti tal-wiċċ li jeqirdu d-DNA jistgħu jintużaw jekk ir-rakkomandazzjonijiet tas-sikurezza lokali ma jippermettux l-użu ta 'ipoklorit tas-sodju jew jekk l-ipoklorit tas-sodju ma jkunx adattat għad-dekontaminazzjoni tal-partijiet metalliċi tat-tagħmir.

Idealment, il-persunal għandu jirrispetta l-ethos tal-fluss tax-xogħol unidirezzjonali u ma jmurx minn żoni maħmuġin (post-PCR) lura għal żoni nodfa (pre-PCR) fl-istess jum.Madankollu, jista 'jkun hemm okkażjonijiet meta dan ikun inevitabbli.Meta tinqala 'tali okkażjoni, il-persunal għandu jieħu ħsieb li jaħsel l-idejn sewwa, ibiddel l-ingwanti, juża l-kowt tal-laboratorju magħżul u ma jintroduċi ebda tagħmir li jkun irid jerġa' joħroġ mill-kamra, bħal kotba tal-laboratorju.Tali miżuri ta' kontroll għandhom jiġu enfasizzati fit-taħriġ tal-persunal dwar metodi molekulari.

Wara l-użu, l-ispazji tal-bank għandhom jitnaddfu b'10% ipoklorit tas-sodju (segwit minn ilma sterili biex jitneħħa l-bliċ residwu), 70% etanol, jew dekontaminant validat li jeqred id-DNA disponibbli kummerċjalment.Idealment, lampi ultra-vjola (UV) għandhom jitwaħħlu biex jippermettu d-dekontaminazzjoni bl-irradjazzjoni.Madankollu, l-użu ta' lampi UV għandu jkun ristrett għal żoni tax-xogħol magħluqa, eż. kabinetti tas-sigurtà, sabiex tiġi limitata l-espożizzjoni UV tal-persunal tal-laboratorju.Jekk jogħġbok żomm l-istruzzjonijiet tal-manifattur għall-kura, il-ventilazzjoni u t-tindif tal-bozoz UV sabiex tiżgura li l-lampi jibqgħu effettivi.

Jekk tuża 70% etanol minflok ipoklorit tas-sodju, tkun meħtieġa irradjazzjoni b'dawl UV biex titlesta d-dekontaminazzjoni.
Tnaddafx il-vortiċi u ċċentrifuga b'ipoklorit tas-sodju;minflok, imsaħ b'70% etanol u esponi għad-dawl UV, jew uża dekontaminant kummerċjali li jeqred id-DNA.Għal tixrid, iċċekkja mal-manifattur għal aktar pariri dwar it-tindif.Jekk l-istruzzjonijiet tal-manifattur jippermettu dan, il-pipetti għandhom jiġu sterilizzati regolarment b'awtoklavi.Jekk il-pipetti ma jistgħux jiġu awtoklavi, għandu jkun biżżejjed li jitnaddfu b'10% ipoklorit tas-sodju (segwit minn imsaħ bir-reqqa b'ilma sterili) jew b'dekontaminant kummerċjali li jeqred id-DNA segwit minn espożizzjoni għall-UV.

It-tindif b'ipoklorit tas-sodju b'perċentwal għoli jista' eventwalment jagħmel ħsara lill-plastiks u l-metalli tal-pipetta jekk isir fuq bażi regolari;l-ewwel iċċekkja r-rakkomandazzjonijiet mill-manifattur.It-tagħmir kollu jeħtieġ li jiġi kkalibrat regolarment skont l-iskeda rakkomandata mill-manifattur.Persuna maħtura għandha tkun inkarigata li tiżgura li l-iskeda tal-kalibrazzjoni tiġi rispettata, jinżammu r-reġistri dettaljati, u t-tikketti tas-servizz jintwerew b'mod ċar fuq it-tagħmir.

3. Pariri dwar l-użu u t-tindif għall-ispazju molekulari magħżul

Pre-PCR: Reagent aliquoting / mastermix preparazzjoni: Dan għandu jkun l-aktar nodfa mill-ispazji kollha użati għall-preparazzjoni ta 'esperimenti molekulari u idealment għandu jkun kabinett ta' fluss laminari nominat mgħammar b'dawl UV.Kampjuni, aċidu nuklejku estratt u prodotti PCR amplifikati m'għandhomx jiġu ttrattati f'din iż-żona.Ir-reaġenti ta 'amplifikazzjoni għandhom jinżammu fi friża (jew friġġ, skont ir-rakkomandazzjonijiet tal-manifattur) fl-istess spazju magħżul, idealment ħdejn il-kabinett tal-fluss laminari jew iż-żona ta' qabel il-PCR.L-ingwanti għandhom jinbidlu kull darba meta jidħlu fiż-żona pre-PCR jew fil-kabinett tal-fluss laminari.

Iż-żona ta' qabel il-PCR jew il-kabinett tal-fluss laminari għandhom jitnaddfu qabel u wara l-użu kif ġej: Imsaħ l-oġġetti kollha fil-kabinett, eż. pipetti, kaxxi tat-tarf, vortiċi, ċentrifugi, xtillieri tat-tubi, pinen, eċċ. b'70% etanol jew a dekontaminant kummerċjali li jeqred id-DNA, u ħallih jinxef.Fil-każ ta' żona tax-xogħol magħluqa, eż. kabinett tal-fluss laminari, esponi l-barnuża għad-dawl UV għal 30 minuta.

Nota

Tesponix ir-reaġenti għad-dawl UV;ċċaqlaqhom biss fil-kabinett ladarba jkun nadif.Jekk twettaq PCR tat-traskrizzjoni inversa, jista 'jkun utli wkoll li timsaħ l-uċuħ u t-tagħmir b'soluzzjoni li tkisser RNases mal-kuntatt.Dan jista' jgħin biex jiġu evitati riżultati negattivi foloz mid-degradazzjoni tal-enżimi tal-RNA.Wara d-dekontaminazzjoni u qabel ma tipprepara l-mastermix, l-ingwanti għandhom jinbidlu għal darba oħra, u mbagħad il-kabinett ikun lest biex jintuża.

Pre-PCR: Estrazzjoni ta' aċidu nuklejku/żieda ta' mudell:

L-aċidu nuklejku għandu jiġi estratt u mmaniġġjat fit-tieni żona magħżula, bl-użu ta 'sett separat ta' pipetti, ponot tal-filtri, xtillieri tat-tubi, ingwanti friski, kowtijiet tal-laboratorju u tagħmir ieħor.Dan iż-żona hija wkoll għaż-żieda ta 'mudelli, kontrolli u linji ta' tendenzi għall- tubi jew pjanċi mastermix.Biex tiġi evitata l-kontaminazzjoni tal-kampjuni estratti ta' l-aċidu nuklejku li qed jiġu analizzati, huwa rakkomandat li jinbidlu l-ingwanti qabel ma jiġu mmaniġġjati kontrolli jew standards pożittivi u li tuża sett separat ta' pipetti.Ir-reaġenti tal-PCR u l-prodotti amplifikati m'għandhomx jiġu pipettati f'din iż-żona.Il-kampjuni għandhom jinħażnu fi friġġijiet jew friżers magħżula fl-istess żona.L-ispazju tax-xogħol tal-kampjun għandu jitnaddaf bl-istess mod bħall-ispazju tal-mastermix.

Post-PCR: Amplifikazzjoni u tqandil tal-prodott amplifikat

Dan l-ispazju magħżul huwa għal proċessi ta' wara l-amplifikazzjoni u għandu jkun fiżikament separat miż-żoni ta' qabel il-PCR.Normalment ikun fih thermocyclers u pjattaformi f'ħin reali, u idealment għandu jkollu kabinett tal-fluss laminari biex iżżid il-prodott tal-PCR round 1 mar-reazzjoni round 2, jekk tkun qed titwettaq PCR nested.Ir-reaġenti tal-PCR u l-aċidu nuklejku estratt m'għandhomx jiġu ttrattati f'din iż-żona peress li r-riskju ta' kontaminazzjoni huwa għoli.Din iż-żona għandu jkollha sett separat ta 'ingwanti, kowtijiet tal-laboratorju, xtillieri tal-pjanċi u tubi, pipetti, ponot tal-filtri, bins u tagħmir ieħor.It-tubi għandhom jiġu ċentrifugati qabel jinfetħu.L-ispazju tax-xogħol tal-kampjun għandu jitnaddaf bl-istess mod bħall-ispazju tal-mastermix.

Post-PCR: Analiżi tal-prodott

Din il-kamra hija għal tagħmir ta' skoperta ta' prodotti, eż. tankijiet tal-elettroforeżi tal-ġel, pakketti tal-enerġija, transilluminatur UV u sistema ta' dokumentazzjoni tal-ġel.Din iż-żona għandu jkollha settijiet separati ta 'ingwanti, kowtijiet tal-laboratorju, xtillieri tal-pjanċa u tat-tubi, pipetti, ponot tal-filtri, bins u tagħmir ieħor.L-ebda reaġenti oħra ma jistgħu jiddaħħlu f'din iż-żona, esklużi żebgħa tat-tagħbija, markatur molekulari u ġel agarose, u komponenti buffer.L-ispazju tax-xogħol tal-kampjun għandu jitnaddaf bl-istess mod bħall-ispazju tal-mastermix.

Nota importanti

Idealment, il-kmamar ta' qabel il-PCR m'għandhomx jiddaħħlu fl-istess jum jekk ikun diġà sar xogħol fil-kmamar ta' wara l-PCR.Jekk dan ikun kompletament inevitabbli, kun żgur li l-idejn l-ewwel jinħaslu sewwa u li jintlibsu kowtijiet speċifiċi tal-laboratorju fil-kmamar.Il-kotba tal-laboratorju u l-burokrazija m'għandhomx jittieħdu fil-kmamar ta' qabel il-PCR jekk ikunu ntużaw fil-kmamar ta' wara l-PCR;jekk meħtieġ, ħu stampi duplikati tal-protokolli/IDs tal-kampjuni, eċċ.

4. Parir ġenerali dwar il-bijoloġija molekulari

Uża ingwanti mingħajr trab biex tevita l-inibizzjoni tal-assaġġ.It-teknika ta 'pipettar korretta hija importanti ħafna biex titnaqqas il-kontaminazzjoni.Pipettar mhux korrett jista 'jirriżulta fi titjir meta jitqassmu likwidi u l-ħolqien ta' aerosols.Prattika tajba għall-pipettar korrett tista 'tinstab fuq il-links li ġejjin: Gwida Gilson għall-pipettar, Vidjows tat-teknika tal-pipettar Anachem, Tubi taċ-ċentrifuga qabel ma jinfetħu, u iftaħhom bir-reqqa biex tevita t-titjir.Agħlaq it-tubi immedjatament wara l-użu biex tiġi evitata l-introduzzjoni ta 'kontaminanti.

Meta twettaq reazzjonijiet multipli, ipprepara mastermix waħda li jkun fiha reaġenti komuni (eż. ilma, dNTPs, buffer, primers u enżimi) biex timminimizza n-numru ta' trasferimenti ta' reaġenti u tnaqqas it-theddida ta' kontaminazzjoni.Huwa rakkomandat li titwaqqaf il-mastermix fuq is-silġ jew blokka kiesħa.L-użu ta' enzima Hot Start jista' jgħin biex titnaqqas il-produzzjoni ta' prodotti mhux speċifiċi.Ipproteġi r-reaġenti li jkun fihom sondi fluworexxenti mid-dawl sabiex tevita d-degradazzjoni.

5. Kontrolli interni

Inkludi kontrolli pożittivi u negattivi kkonfermati sew ikkaratterizzati, flimkien ma' kontroll bla mudell fir-reazzjonijiet kollha, u linja ta' xejra tittratta b'ħafna punti għal reazzjonijiet kwantitattivi.Il-kontroll pożittiv m'għandux ikun tant qawwi li joħloq riskju ta' kontaminazzjoni.Inkludi kontrolli ta 'estrazzjoni pożittivi u negattivi meta twettaq estrazzjoni ta' aċidu nuklejku.

Huwa rakkomandat li struzzjonijiet ċari jitpoġġew f'kull wieħed mill-oqsma sabiex l-utenti jkunu konxji tar-regoli ta' kondotta.Laboratorji dijanjostiċi li jiskopru livelli baxxi ħafna ta 'DNA jew RNA f'kampjuni kliniċi jistgħu jkunu jridu jadottaw il-miżura ta' sigurtà addizzjonali li jkollhom sistemi separati għall-immaniġġjar tal-arja bi pressjoni tal-arja kemmxejn pożittiva fil-kmamar ta 'qabel il-PCR u pressjoni tal-arja kemmxejn negattiva fil-kmamar ta' wara l-PCR.

Fl-aħħar nett, l-iżvilupp ta' pjan ta' assigurazzjoni tal-kwalità (QA) huwa ta' għajnuna.Pjan bħal dan għandu jinkludi listi ta’ ħażniet prinċipali tar-reaġenti u ħażniet ta’ ħidma, regoli għall-ħażna ta’ kits u reaġenti, rappurtar ta’ riżultati ta’ kontroll, programmi ta’ taħriġ tal-persunal, algoritmi ta’ soluzzjoni tal-problemi, u azzjonijiet ta’ rimedju meta meħtieġ.

6. Biblijografija

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitolu 3: Twaqqif ta 'laboratorju qPCR.Dokument ta 'gwida għall-ittestjar tal-ilmijiet ta' rikreazzjoni bl-użu tal-metodu qPCR tal-USEPA 1611. Lansing-Michigan State University....

Saħħa Pubblika Ingilterra, NHS.Standards tar-Renju Unit għall-investigazzjonijiet tal-mikrobijoloġija: Prattika Tajba tal-Laboratorju meta jsiru testijiet ta’ amplifikazzjoni molekulari).Gwida tal-Kwalità.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Twaqqif ta' laboratorju tal-PCR.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Manutenzjoni ta 'rutina ta' ċentrifugi: tindif, manutenzjoni u diżinfettazzjoni ta 'ċentrifugi, rotors u adapters (White paper Nru 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Prattika Klinika Tajba tal-Laboratorju (GCLP) għal testijiet ibbażati fuq molekulari użati fil-laboratorji dijanjostiċi, Fi: Akyar I, editur.Spettri wiesgħa ta 'kontroll tal-kwalità.Rijeka, il-Kroazja: Intech;2011: 29–52.