Kaedah pengesanan molekul mempunyai keupayaan untuk menghasilkan sejumlah besar asid nukleik melalui penguatan kuantiti surih yang terdapat dalam sampel.Walaupun ini bermanfaat untuk membolehkan pengesanan sensitif, ia juga memperkenalkan kemungkinan pencemaran melalui penyebaran aerosol amplifikasi dalam persekitaran makmal.Semasa menjalankan eksperimen, langkah boleh diambil untuk mengelakkan pencemaran reagen, peralatan makmal dan ruang bangku, kerana pencemaran tersebut boleh menjana keputusan positif palsu (atau negatif palsu).

Untuk membantu mengurangkan kebarangkalian pencemaran, Amalan Makmal yang Baik hendaklah dilaksanakan pada setiap masa.Secara khusus, langkah berjaga-jaga harus diambil mengenai perkara berikut:

1. Mengendalikan reagen
2. Organisasi ruang kerja dan peralatan
3. Nasihat penggunaan dan pembersihan untuk ruang molekul yang ditetapkan
4. Nasihat biologi molekul am
5. Kawalan dalaman
6. Bibliografi

1. Mengendalikan reagen

Sentrifuge tiub reagen secara ringkas sebelum dibuka untuk mengelakkan penjanaan aerosol.Reagen Aliquot untuk mengelakkan pencairan beku berganda dan pencemaran stok induk.Labelkan dan tarikh dengan jelas semua reagen dan tiub tindak balas dan kekalkan log bilangan reagen dan nombor kelompok yang digunakan dalam semua eksperimen.Pipet semua reagen dan sampel menggunakan petua penapis.Sebelum membeli, adalah dinasihatkan untuk mengesahkan dengan pengilang bahawa petua penapis sesuai dengan jenama pipet yang akan digunakan.

2. Organisasi ruang kerja dan peralatan

Ruang kerja hendaklah teratur bagi memastikan aliran kerja berlaku dalam satu arah iaitu dari kawasan bersih (pre-PCR) ke kawasan kotor (post-PCR).Langkah berjaga-jaga am berikut akan membantu mengurangkan kemungkinan pencemaran.Mempunyai bilik yang ditetapkan berasingan, atau sekurang-kurangnya kawasan yang berasingan secara fizikal, untuk: penyediaan mastermix, pengekstrakan asid nukleik dan penambahan templat DNA, penguatan dan pengendalian produk yang dikuatkan, dan analisis produk, cth elektroforesis gel.

Dalam sesetengah tetapan, mempunyai 4 bilik berasingan adalah sukar.Pilihan yang mungkin tetapi kurang diingini ialah melakukan penyediaan mastermix di kawasan pembendungan, contohnya kabinet aliran laminar.Dalam kes amplifikasi PCR bersarang, penyediaan mastermix untuk tindak balas pusingan kedua perlu disediakan di kawasan 'bersih' untuk penyediaan mastermix, tetapi inokulasi dengan produk PCR utama perlu dilakukan di bilik amplifikasi, dan jika boleh. dalam kawasan pembendungan khusus (cth kabinet aliran laminar).

Setiap bilik/kawasan memerlukan set berasingan pipet berlabel jelas, petua penapis, rak tiub, pusaran air, emparan (jika berkaitan), pen, reagen makmal generik, kot makmal dan kotak sarung tangan yang akan kekal di stesen kerja masing-masing.Tangan mesti dibasuh dan sarung tangan dan kot makmal ditukar apabila bergerak antara kawasan yang ditetapkan.Reagen dan peralatan tidak boleh dialihkan dari kawasan yang kotor ke kawasan yang bersih.Sekiranya berlaku kes yang melampau di mana reagen atau peralatan perlu digerakkan ke belakang, ia mesti terlebih dahulu dinyahcemar dengan 10% natrium hipoklorit, diikuti dengan lap dengan air steril.

Catatan

Larutan natrium hipoklorit 10% mesti dibuat segar setiap hari.Apabila digunakan untuk dekontaminasi, masa sentuhan minimum 10 minit hendaklah dipatuhi.
Sebagai alternatif, produk yang tersedia secara komersial yang disahkan sebagai dekontaminasi permukaan yang memusnahkan DNA boleh digunakan jika pengesyoran keselamatan tempatan tidak membenarkan penggunaan natrium hipoklorit atau jika natrium hipoklorit tidak sesuai untuk menyahcemar bahagian logam peralatan.

Sebaik-baiknya, kakitangan harus mematuhi etos aliran kerja satu arah dan tidak pergi dari kawasan kotor (pasca-PCR) kembali ke kawasan bersih (pra-PCR) pada hari yang sama.Walau bagaimanapun, mungkin terdapat keadaan di mana ini tidak dapat dielakkan.Apabila keadaan seperti itu timbul, kakitangan mesti berhati-hati untuk mencuci tangan dengan teliti, menukar sarung tangan, menggunakan kot makmal yang ditetapkan dan tidak memperkenalkan sebarang peralatan yang mereka ingin bawa keluar dari bilik semula, seperti buku makmal.Langkah-langkah kawalan tersebut harus dititikberatkan dalam latihan kakitangan mengenai kaedah molekul.

Selepas digunakan, ruang bangku hendaklah dibersihkan dengan 10% natrium hipoklorit (diikuti dengan air steril untuk membuang sisa peluntur), 70% etanol, atau dekontaminasi pemusnah DNA yang boleh didapati secara komersial.Sebaik-baiknya, lampu ultra-ungu (UV) hendaklah dipasang untuk membolehkan penyahcemaran melalui penyinaran.Walau bagaimanapun, penggunaan lampu UV hendaklah dihadkan kepada kawasan kerja tertutup, contohnya kabinet keselamatan, untuk mengehadkan pendedahan UV kakitangan makmal.Sila patuhi arahan pengilang untuk penjagaan lampu UV, pengudaraan dan pembersihan untuk memastikan lampu kekal berkesan.

Jika menggunakan etanol 70% dan bukannya natrium hipoklorit, penyinaran dengan cahaya UV akan diperlukan untuk menyelesaikan penyahcemaran.
Jangan bersihkan pusaran dan emparan dengan natrium hipoklorit;sebaliknya, lap dengan 70% etanol dan dedahkan kepada cahaya UV, atau gunakan dekontaminasi pemusnah DNA komersial.Untuk tumpahan, semak dengan pengilang untuk mendapatkan nasihat pembersihan lanjut.Jika arahan pengilang membenarkannya, pipet hendaklah disterilkan secara rutin dengan autoklaf.Jika pipet tidak boleh diautoklaf, ia sepatutnya cukup untuk membersihkannya dengan 10% natrium hipoklorit (diikuti dengan sapuan menyeluruh dengan air steril) atau dengan dekontaminasi pemusnah DNA komersial diikuti dengan pendedahan UV.

Pembersihan dengan peratusan tinggi natrium hipoklorit akhirnya boleh merosakkan plastik dan logam pipet jika dilakukan secara tetap;semak cadangan daripada pengilang terlebih dahulu.Semua peralatan perlu ditentukur dengan kerap mengikut jadual yang disyorkan pengeluar.Orang yang ditetapkan hendaklah bertanggungjawab memastikan jadual penentukuran dipatuhi, log terperinci diselenggara, dan label perkhidmatan dipaparkan dengan jelas pada peralatan.

3. Nasihat penggunaan dan pembersihan untuk ruang molekul yang ditetapkan

Pra-PCR: Penyediaan aliquoting / mastermix reagen: Ini hendaklah yang paling bersih daripada semua ruang yang digunakan untuk penyediaan eksperimen molekul dan idealnya ialah kabinet aliran laminar yang ditetapkan dilengkapi dengan cahaya UV.Sampel, asid nukleik yang diekstrak dan produk PCR yang diperkuatkan tidak boleh dikendalikan di kawasan ini.Reagen penguat hendaklah disimpan di dalam peti sejuk beku (atau peti sejuk, mengikut saranan pengilang) dalam ruang yang ditetapkan yang sama, sebaik-baiknya di sebelah kabinet aliran laminar atau kawasan pra-PCR.Sarung tangan hendaklah ditukar setiap kali apabila memasuki kawasan pra-PCR atau kabinet aliran laminar.

Kawasan pra-PCR atau kabinet aliran laminar hendaklah dibersihkan sebelum dan selepas digunakan seperti berikut: Lap semua item dalam kabinet, cth pipet, kotak hujung, vorteks, emparan, rak tiub, pen, dsb. dengan 70% etanol atau dekontaminasi pemusnah DNA komersial, dan biarkan kering.Dalam kes kawasan kerja tertutup, cth kabinet aliran laminar, dedahkan hud kepada cahaya UV selama 30 minit.

Catatan

Jangan dedahkan reagen kepada cahaya UV;hanya pindahkannya ke dalam kabinet setelah ia bersih.Jika melakukan PCR transkripsi terbalik, ia juga boleh membantu untuk mengelap permukaan dan peralatan dengan penyelesaian yang memecahkan RNases apabila bersentuhan.Ini boleh membantu untuk mengelakkan keputusan negatif palsu daripada degradasi enzim RNA.Selepas dekontaminasi dan sebelum menyediakan mastermix, sarung tangan perlu ditukar sekali lagi, dan kemudian kabinet sedia untuk digunakan.

Pra-PCR: Pengekstrakan asid nukleik/penambahan templat:

Asid nukleik mesti diekstrak dan dikendalikan di kawasan kedua yang ditetapkan, menggunakan set pipet berasingan, petua penapis, rak tiub, sarung tangan segar, kot makmal dan peralatan lain. Kawasan ini juga untuk penambahan templat, kawalan dan garis arah aliran pada tiub atau pinggan mastermix.Untuk mengelakkan pencemaran sampel asid nukleik yang diekstrak yang sedang dianalisis, adalah disyorkan untuk menukar sarung tangan sebelum mengendalikan kawalan atau piawaian positif dan menggunakan set pipet yang berasingan.Reagen PCR dan produk yang dikuatkan tidak boleh dipipet di kawasan ini.Sampel hendaklah disimpan di dalam peti sejuk atau peti sejuk yang ditetapkan di kawasan yang sama.Ruang kerja sampel hendaklah dibersihkan dengan cara yang sama seperti ruang mastermix.

Pasca-PCR: Penguatan dan pengendalian produk yang dikuatkan

Ruang yang ditetapkan ini adalah untuk proses pasca penguatan dan harus secara fizikal berasingan daripada kawasan pra-PCR.Ia biasanya mengandungi termocyclers dan platform masa nyata, dan sebaiknya mempunyai kabinet aliran laminar untuk menambah produk PCR pusingan 1 pada tindak balas pusingan 2, jika PCR bersarang sedang dilakukan.Reagen PCR dan asid nukleik yang diekstrak tidak boleh dikendalikan di kawasan ini kerana risiko pencemaran adalah tinggi.Kawasan ini hendaklah mempunyai set sarung tangan, kot makmal, rak pinggan dan tiub yang berasingan, pipet, hujung penapis, tong sampah dan peralatan lain.Tiub mesti disentrifugasi sebelum dibuka.Ruang kerja sampel hendaklah dibersihkan dengan cara yang sama seperti ruang mastermix.

Pasca-PCR: Analisis produk

Bilik ini adalah untuk peralatan pengesanan produk, contohnya tangki elektroforesis gel, pek kuasa, transilluminator UV dan sistem dokumentasi gel.Kawasan ini harus mempunyai set berasingan sarung tangan, kot makmal, rak pinggan dan tiub, pipet, hujung penapis, tong sampah dan peralatan lain.Tiada reagen lain boleh dibawa ke kawasan ini, tidak termasuk pewarna pemuatan, penanda molekul dan gel agarose, dan komponen penimbal.Ruang kerja sampel hendaklah dibersihkan dengan cara yang sama seperti ruang mastermix.

Nota PENTING

Sebaik-baiknya, bilik pra-PCR tidak boleh dimasukkan pada hari yang sama jika kerja telah dilakukan di bilik pasca-PCR.Jika ini benar-benar tidak dapat dielakkan, pastikan tangan dibasuh terlebih dahulu dan kot makmal tertentu dipakai di dalam bilik.Buku dan kertas makmal tidak boleh dibawa ke bilik pra-PCR jika ia telah digunakan di dalam bilik pasca-PCR;jika perlu, ambil salinan salinan protokol/ID sampel, dsb.

4. Nasihat biologi molekul am

Gunakan sarung tangan bebas serbuk untuk mengelakkan perencatan ujian.Teknik paip yang betul adalah penting untuk mengurangkan pencemaran.Pemipetan yang salah boleh mengakibatkan percikan semasa mendispens cecair dan penciptaan aerosol.Amalan baik untuk paip yang betul boleh didapati di pautan berikut: Panduan Gilson untuk pipet, video teknik pipet Anachem, Tiub Centrifuge sebelum dibuka, dan buka dengan berhati-hati untuk mengelakkan percikan.Tutup tiub dengan segera selepas digunakan untuk mengelakkan kemasukan bahan cemar.

Apabila melakukan pelbagai tindak balas, sediakan satu campuran induk yang mengandungi reagen biasa (cth air, dNTP, penimbal, primer dan enzim) untuk meminimumkan bilangan pemindahan reagen dan mengurangkan ancaman pencemaran.Adalah disyorkan untuk menyediakan mastermix pada ais atau blok sejuk.Penggunaan enzim Hot Start boleh membantu mengurangkan pengeluaran produk tidak khusus.Lindungi reagen yang mengandungi probe pendarfluor daripada cahaya untuk mengelakkan degradasi.

5. Kawalan dalaman

Sertakan kawalan positif dan negatif yang dicirikan dengan baik, disahkan, bersama-sama dengan kawalan tanpa templat dalam semua tindak balas, dan garis arah aliran dititrasi berbilang titik untuk tindak balas kuantitatif.Kawalan positif tidak seharusnya begitu kuat sehingga menimbulkan risiko pencemaran.Sertakan kawalan pengekstrakan positif dan negatif semasa melakukan pengekstrakan asid nukleik.

Adalah disyorkan supaya arahan yang jelas disiarkan di setiap kawasan supaya pengguna mengetahui peraturan kelakuan.Makmal diagnostik yang mengesan tahap DNA atau RNA yang sangat rendah dalam sampel klinikal mungkin mahu menggunakan langkah keselamatan tambahan iaitu mempunyai sistem pengendalian udara yang berasingan dengan tekanan udara yang sedikit positif di dalam bilik pra-PCR dan tekanan udara yang sedikit negatif di dalam bilik pasca-PCR.

Akhir sekali, membangunkan pelan jaminan kualiti (QA) sangat membantu.Pelan sedemikian hendaklah termasuk senarai stok induk reagen dan stok kerja, peraturan untuk menyimpan kit dan reagen, pelaporan keputusan kawalan, program latihan kakitangan, algoritma penyelesaian masalah, dan tindakan pemulihan apabila diperlukan.

6. Bibliografi

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Bab 3: Menyediakan makmal qPCR.Dokumen panduan untuk menguji perairan rekreasi menggunakan kaedah qPCR USEPA 1611. Lansing- Michigan State University.

Kesihatan Awam England, NHS.Piawaian UK untuk penyiasatan mikrobiologi: Amalan Makmal Baik semasa menjalankan ujian penguatan molekul).Bimbingan Kualiti.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Menyediakan makmal PCR.Protokok Pelabuhan Cold Spring.2007;7.

Schroeder S 2013. Penyelenggaraan rutin emparan: pembersihan, penyelenggaraan dan pembasmian kuman emparan, pemutar dan penyesuai (Kertas putih No. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) untuk ujian berasaskan molekul yang digunakan dalam makmal diagnostik, Dalam: Akyar I, editor.Spektrum kawalan kualiti yang luas.Rijeka, Croatia: Intech;2011: 29–52.