आण्विक शोध पद्धतींमध्ये नमुन्यांमध्ये सापडलेल्या ट्रेस प्रमाणांच्या प्रवर्धनाद्वारे मोठ्या प्रमाणात न्यूक्लिक अॅसिड तयार करण्याची क्षमता असते.हे संवेदनशील शोध सक्षम करण्यासाठी फायदेशीर असले तरी, प्रयोगशाळेच्या वातावरणात अॅम्प्लीफिकेशन एरोसोल्सच्या प्रसाराद्वारे दूषित होण्याची शक्यता देखील ओळखते.प्रयोग आयोजित करताना, अभिकर्मक, प्रयोगशाळा उपकरणे आणि बेंच स्पेसचे दूषितीकरण टाळण्यासाठी उपाय केले जाऊ शकतात, कारण अशा दूषिततेमुळे चुकीचे-सकारात्मक (किंवा खोटे-नकारात्मक) परिणाम येऊ शकतात.

दूषित होण्याची शक्यता कमी करण्यासाठी, चांगल्या प्रयोगशाळेचा सराव नेहमी केला पाहिजे.विशेषतः, खालील मुद्द्यांवर सावधगिरी बाळगली पाहिजे:

1. अभिकर्मक हाताळणे
2. कार्यक्षेत्र आणि उपकरणे यांचे संघटन
3. नियुक्त आण्विक जागेसाठी वापर आणि साफसफाईचा सल्ला
4. सामान्य आण्विक जीवशास्त्र सल्ला
5. अंतर्गत नियंत्रणे
6. ग्रंथसूची

1. अभिकर्मक हाताळणे

एरोसोलची निर्मिती टाळण्यासाठी उघडण्यापूर्वी थोडक्यात सेंट्रीफ्यूज अभिकर्मक नळ्या.मल्टीपल फ्रीझ-थॉ आणि मास्टर स्टॉक्सचे दूषित टाळण्यासाठी अलिकोट अभिकर्मक.सर्व अभिकर्मक आणि प्रतिक्रिया ट्यूब स्पष्टपणे लेबल करा आणि तारीख करा आणि सर्व प्रयोगांमध्ये वापरल्या जाणार्‍या अभिकर्मक लॉट आणि बॅच क्रमांकांचे लॉग राखून ठेवा.फिल्टर टिप्स वापरून सर्व अभिकर्मक आणि नमुने पिपेट करा.खरेदी करण्यापूर्वी, निर्मात्याशी पुष्टी करणे उचित आहे की फिल्टर टिपा वापरल्या जाणार्‍या पिपेटच्या ब्रँडमध्ये बसतात.

2. कार्यक्षेत्र आणि उपकरणे यांचे संघटन

स्वच्छ क्षेत्र (प्री-पीसीआर) ते गलिच्छ क्षेत्र (पीसीआर नंतर) कामाचा प्रवाह एका दिशेने होईल याची खात्री करण्यासाठी कार्यक्षेत्र आयोजित केले पाहिजे.खालील सामान्य खबरदारी दूषित होण्याची शक्यता कमी करण्यात मदत करेल.मास्टरमिक्स तयार करणे, न्यूक्लिक अॅसिड काढणे आणि डीएनए टेम्प्लेट जोडणे, प्रवर्धित उत्पादनाचे प्रवर्धन आणि हाताळणी, आणि उत्पादनाचे विश्लेषण, उदा. जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस यासाठी स्वतंत्र नियुक्त खोल्या किंवा किमान शारीरिकदृष्ट्या वेगळे क्षेत्र ठेवा.

काही सेटिंग्जमध्ये, 4 स्वतंत्र खोल्या असणे कठीण आहे.एक संभाव्य परंतु कमी इष्ट पर्याय म्हणजे मास्टरमिक्सची तयारी एखाद्या कंटेनमेंट एरियामध्ये करणे, उदा. लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट.नेस्टेड पीसीआर अॅम्प्लीफिकेशनच्या बाबतीत, मास्टरमिक्स तयार करण्यासाठी दुसऱ्या फेरीच्या प्रतिक्रियेसाठी मास्टरमिक्स तयार करणे 'स्वच्छ' भागात तयार केले पाहिजे, परंतु प्राथमिक पीसीआर उत्पादनासह इनोक्यूलेशन अॅम्प्लीफिकेशन रूममध्ये केले पाहिजे आणि शक्य असल्यास. समर्पित कंटेनमेंट एरियामध्ये (उदा. लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट).

प्रत्येक खोली/क्षेत्राला स्पष्टपणे लेबल केलेल्या पिपेट्स, फिल्टर टिप्स, ट्यूब रॅक, व्हर्टेक्सेस, सेंट्रीफ्यूज (संबंधित असल्यास), पेन, जेनेरिक लॅब अभिकर्मक, लॅब कोट आणि हातमोजे यांचे बॉक्स आवश्यक आहेत जे त्यांच्या संबंधित वर्कस्टेशन्सवर राहतील.नियुक्त केलेल्या भागांमध्ये फिरताना हात धुवावेत आणि हातमोजे आणि लॅब कोट बदलले पाहिजेत.अभिकर्मक आणि उपकरणे गलिच्छ भागातून स्वच्छ भागात हलवू नयेत.एखादा अभिकर्मक किंवा उपकरणाचा तुकडा मागे हलवण्याची आवश्यकता असल्यास, ते प्रथम 10% सोडियम हायपोक्लोराईटने निर्जंतुकीकरण केले पाहिजे, त्यानंतर निर्जंतुकीकरण केलेल्या पाण्याने पुसून टाकावे.

नोंद

10% सोडियम हायपोक्लोराईट द्रावण दररोज ताजे बनवले पाहिजे.निर्जंतुकीकरणासाठी वापरताना, कमीतकमी 10 मिनिटांचा संपर्क वेळ पाळला पाहिजे.
वैकल्पिकरित्या, स्थानिक सुरक्षा शिफारसी सोडियम हायपोक्लोराइट वापरण्यास परवानगी देत ​​नसतील किंवा उपकरणांचे धातूचे भाग निर्जंतुकीकरण करण्यासाठी सोडियम हायपोक्लोराइट योग्य नसल्यास डीएनए-नाश करणार्‍या पृष्ठभागावरील निर्जंतुकीकरण म्हणून प्रमाणित केलेली व्यावसायिकरित्या उपलब्ध उत्पादने वापरली जाऊ शकतात.

तद्वतच, कर्मचार्‍यांनी दिशाहीन कार्यप्रवाहाचे नियम पाळले पाहिजेत आणि त्याच दिवशी गलिच्छ भागातून (पीसीआर नंतर) स्वच्छ भागात (पीसीआरपूर्व) जाऊ नये.तथापि, असे प्रसंग येऊ शकतात जेव्हा हे अपरिहार्य असते.जेव्हा असे प्रसंग उद्भवतात तेव्हा, कर्मचार्‍यांनी काळजीपूर्वक हात धुणे, हातमोजे बदलणे, नियुक्त लॅब कोट वापरणे आणि त्यांना पुन्हा खोलीतून बाहेर काढायचे असेल असे कोणतेही उपकरण सादर करू नये, जसे की प्रयोगशाळेची पुस्तके.आण्विक पद्धतींवरील कर्मचारी प्रशिक्षणात अशा नियंत्रण उपायांवर जोर दिला पाहिजे.

वापर केल्यानंतर, बेंच स्पेस 10% सोडियम हायपोक्लोराईट (अवशिष्ट ब्लीच काढून टाकण्यासाठी निर्जंतुकीकरण पाण्याने), 70% इथेनॉल किंवा प्रमाणित व्यावसायिकरित्या उपलब्ध डीएनए-नाश करणार्‍या डिकंटामिनंटने स्वच्छ केले पाहिजे.तद्वतच, किरणोत्सर्गाद्वारे निर्जंतुकीकरण सक्षम करण्यासाठी अल्ट्रा-व्हायोलेट (UV) दिवे बसवले पाहिजेत.तथापि, प्रयोगशाळेतील कर्मचार्‍यांच्या अतिनील प्रदर्शनास मर्यादा घालण्यासाठी अतिनील दिवे वापरणे बंद कार्यक्षेत्रे, उदा. सुरक्षा कॅबिनेटपर्यंत मर्यादित असावे.दिवे प्रभावी राहतील याची खात्री करण्यासाठी कृपया UV दिव्यांची काळजी, वेंटिलेशन आणि साफसफाईसाठी निर्मात्याच्या सूचनांचे पालन करा.

सोडियम हायपोक्लोराइट ऐवजी 70% इथेनॉल वापरल्यास, निर्जंतुकीकरण पूर्ण करण्यासाठी अतिनील प्रकाशासह विकिरण आवश्यक असेल.
सोडियम हायपोक्लोराईटसह भोवरा आणि सेंट्रीफ्यूज साफ करू नका;त्याऐवजी, 70% इथेनॉलने पुसून टाका आणि अतिनील प्रकाशाच्या संपर्कात आणा, किंवा व्यावसायिक डीएनए-नाश करणारे डिकंटामिनंट वापरा.गळतीसाठी, पुढील साफसफाईच्या सल्ल्यासाठी निर्मात्याकडे तपासा.निर्मात्याच्या सूचनांनी परवानगी दिल्यास, पिपेट्स नियमितपणे ऑटोक्लेव्हद्वारे निर्जंतुकीकरण केल्या पाहिजेत.जर पिपेट्स ऑटोक्लेव्ह करता येत नसतील, तर 10% सोडियम हायपोक्लोराईटने (त्यानंतर निर्जंतुकीकरण पाण्याने पूर्णपणे पुसून टाका) किंवा व्यावसायिक DNA-नाश करणार्‍या डिकंटामिनंट नंतर अतिनील प्रदर्शनासह स्वच्छ करणे पुरेसे आहे.

उच्च-टक्केवारी सोडियम हायपोक्लोराईटसह साफसफाई नियमितपणे केल्यास शेवटी विंदुक प्लास्टिक आणि धातूंचे नुकसान होऊ शकते;प्रथम निर्मात्याकडून शिफारसी तपासा.सर्व उपकरणे निर्मात्याने शिफारस केलेल्या वेळापत्रकानुसार नियमितपणे कॅलिब्रेट करणे आवश्यक आहे.कॅलिब्रेशन शेड्यूलचे पालन केले गेले आहे, तपशीलवार नोंदी ठेवल्या गेल्या आहेत आणि उपकरणांवर सेवा लेबले स्पष्टपणे प्रदर्शित केली गेली आहेत याची खात्री करण्यासाठी नियुक्त केलेल्या व्यक्तीची जबाबदारी असावी.

3. नियुक्त आण्विक जागेसाठी वापर आणि साफसफाईचा सल्ला

प्री-पीसीआर: अभिकर्मक अलिकोटिंग / मास्टरमिक्स तयारी: हे आण्विक प्रयोगांच्या तयारीसाठी वापरल्या जाणार्‍या सर्व मोकळ्या जागांपैकी सर्वात स्वच्छ असावे आणि आदर्शपणे अतिनील प्रकाशाने सुसज्ज असलेले नियुक्त लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट असावे.नमुने, काढलेले न्यूक्लिक अॅसिड आणि अॅम्प्लीफाइड पीसीआर उत्पादने या भागात हाताळली जाऊ नयेत.अॅम्प्लीफिकेशन अभिकर्मक फ्रीजरमध्ये (किंवा रेफ्रिजरेटर, निर्मात्याच्या शिफारशीनुसार) समान नियुक्त जागेत, आदर्शपणे लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट किंवा प्री-पीसीआर क्षेत्राशेजारी ठेवावे.प्री-पीसीआर क्षेत्र किंवा लॅमिनर फ्लो कॅबिनेटमध्ये प्रवेश केल्यावर प्रत्येक वेळी हातमोजे बदलले पाहिजेत.

प्री-पीसीआर क्षेत्र किंवा लॅमिनर फ्लो कॅबिनेट वापरण्यापूर्वी आणि वापरल्यानंतर खालीलप्रमाणे साफ केले पाहिजे: कॅबिनेटमधील सर्व वस्तू, उदा. पिपेट, टिप बॉक्स, भोवरा, सेंट्रीफ्यूज, ट्यूब रॅक, पेन इत्यादी 70% इथेनॉलने पुसून टाका. व्यावसायिक डीएनए नष्ट करणारे दूषित पदार्थ, आणि कोरडे होऊ द्या.बंद कार्यक्षेत्राच्या बाबतीत, उदा. लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट, हूडला 30 मिनिटांसाठी अतिनील प्रकाशात उघड करा.

नोंद

अभिकर्मकांना अतिनील प्रकाशात उघड करू नका;ते स्वच्छ झाल्यावरच त्यांना कॅबिनेटमध्ये हलवा.रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन PCR करत असल्यास, संपर्कात असलेल्या RNases तोडणाऱ्या द्रावणाने पृष्ठभाग आणि उपकरणे पुसून टाकणे देखील उपयुक्त ठरू शकते.हे RNA च्या एंझाइमच्या ऱ्हासामुळे चुकीचे-नकारात्मक परिणाम टाळण्यास मदत करू शकते.निर्जंतुकीकरणानंतर आणि मास्टरमिक्स तयार करण्यापूर्वी, हातमोजे पुन्हा एकदा बदलले पाहिजेत आणि नंतर कॅबिनेट वापरण्यासाठी तयार आहे.

प्री-पीसीआर: न्यूक्लिक अॅसिड काढणे/टेम्पलेट जोडणे:

विंदुक, फिल्टर टिपा, ट्यूब रॅक, ताजे हातमोजे, लॅब कोट आणि इतर उपकरणे वापरून न्यूक्लिक अॅसिड दुसऱ्या नियुक्त केलेल्या भागात काढले आणि हाताळले जाणे आवश्यक आहे. हे क्षेत्र टेम्पलेट, नियंत्रणे आणि ट्रेंडलाइन जोडण्यासाठी देखील आहे. मास्टरमिक्स ट्यूब किंवा प्लेट्स.काढलेल्या न्यूक्लिक अॅसिडचे नमुने दूषित होऊ नयेत ज्यांचे विश्लेषण केले जात आहे, सकारात्मक नियंत्रणे किंवा मानके हाताळण्यापूर्वी हातमोजे बदलण्याची आणि पिपेट्सचा वेगळा संच वापरण्याची शिफारस केली जाते.या भागात पीसीआर अभिकर्मक आणि प्रवर्धित उत्पादने पाइपेट केली जाऊ नयेत.नमुने त्याच भागात नियुक्त केलेल्या फ्रीज किंवा फ्रीझरमध्ये साठवले पाहिजेत.नमुना कार्यक्षेत्र मास्टरमिक्स स्पेस प्रमाणेच स्वच्छ केले पाहिजे.

पोस्ट-पीसीआर: प्रवर्धित उत्पादनाचे प्रवर्धन आणि हाताळणी

ही नियुक्त केलेली जागा प्रवर्धनानंतरच्या प्रक्रियेसाठी आहे आणि ती PCR पूर्वीच्या भागांपासून भौतिकदृष्ट्या वेगळी असावी.यामध्ये सामान्यतः थर्मोसायकलर्स आणि रीअल-टाइम प्लॅटफॉर्म असतात आणि आदर्शपणे राउंड 2 रिअॅक्शनमध्ये राउंड 1 पीसीआर उत्पादन जोडण्यासाठी एक लॅमिनार फ्लो कॅबिनेट असणे आवश्यक आहे, जर नेस्टेड पीसीआर केले जात असेल.PCR अभिकर्मक आणि काढलेले न्यूक्लिक अॅसिड या भागात हाताळले जाऊ नये कारण दूषित होण्याचा धोका जास्त असतो.या भागात हातमोजे, लॅब कोट, प्लेट आणि ट्यूब रॅक, पिपेट्स, फिल्टर टिप्स, डब्बे आणि इतर उपकरणांचा वेगळा सेट असावा.नळ्या उघडण्यापूर्वी सेंट्रीफ्यूज करणे आवश्यक आहे.नमुना कार्यक्षेत्र मास्टरमिक्स स्पेस प्रमाणेच स्वच्छ केले पाहिजे.

पोस्ट-पीसीआर: उत्पादन विश्लेषण

ही खोली उत्पादन शोध उपकरणे, उदा. जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस टाक्या, पॉवर पॅक, यूव्ही ट्रान्सिल्युमिनेटर आणि जेल दस्तऐवजीकरण प्रणालीसाठी आहे.या भागात हातमोजे, लॅब कोट, प्लेट आणि ट्यूब रॅक, पिपेट्स, फिल्टर टिप्स, डब्बे आणि इतर उपकरणांचे वेगळे सेट असावेत.लोडिंग डाई, मॉलिक्युलर मार्कर आणि अॅग्रोज जेल आणि बफर घटक वगळता इतर कोणतेही अभिकर्मक या भागात आणले जाऊ शकत नाहीत.नमुना कार्यक्षेत्र मास्टरमिक्स स्पेस प्रमाणेच स्वच्छ केले पाहिजे.

महत्वाची नोंद

तद्वतच, PCR नंतरच्या खोल्यांमध्ये काम आधीच केले असल्यास त्याच दिवशी पीसीआरपूर्व खोल्यांमध्ये प्रवेश करू नये.हे पूर्णपणे अपरिहार्य असल्यास, प्रथम हात चांगले धुतले गेले आहेत आणि खोल्यांमध्ये विशिष्ट लॅब कोट घातलेले आहेत याची खात्री करा.प्रयोगशाळेची पुस्तके आणि कागदपत्रे पीसीआर-पूर्व खोल्यांमध्ये नेऊ नयेत, जर ती पीसीआरनंतरच्या खोल्यांमध्ये वापरली गेली असतील;आवश्यक असल्यास, प्रोटोकॉल/नमुना आयडी इत्यादींचे डुप्लिकेट प्रिंट-आउट घ्या.

4. सामान्य आण्विक जीवशास्त्र सल्ला

परख प्रतिबंध टाळण्यासाठी पावडर-मुक्त हातमोजे वापरा.दूषितता कमी करण्यासाठी योग्य पाइपिंग तंत्र सर्वोपरि आहे.चुकीच्या पाईपिंगमुळे द्रव वितरीत करताना आणि एरोसोल तयार करताना स्प्लॅशिंग होऊ शकते.योग्य पाइपिंगसाठी चांगला सराव खालील लिंक्सवर मिळू शकतो: गिल्सन गाईड टू पाइपिंग, अॅनाकेम पाइपटिंग तंत्राचे व्हिडिओ, उघडण्यापूर्वी सेंट्रीफ्यूज ट्यूब आणि स्प्लॅशिंग टाळण्यासाठी त्या काळजीपूर्वक उघडा.दूषित पदार्थांचा प्रवेश टाळण्यासाठी वापरल्यानंतर लगेच नळ्या बंद करा.

एकाधिक प्रतिक्रिया करत असताना, अभिकर्मक हस्तांतरणाची संख्या कमी करण्यासाठी आणि दूषित होण्याचा धोका कमी करण्यासाठी सामान्य अभिकर्मक (उदा. पाणी, dNTPs, बफर, प्राइमर्स आणि एन्झाइम) असलेले एक मास्टरमिक्स तयार करा.बर्फ किंवा कोल्ड ब्लॉकवर मास्टरमिक्स सेट करण्याची शिफारस केली जाते.हॉट स्टार्ट एंझाइमचा वापर गैर-विशिष्ट उत्पादनांचे उत्पादन कमी करण्यास मदत करू शकतो.ऱ्हास टाळण्यासाठी फ्लोरोसेंट प्रोब असलेल्या अभिकर्मकांचे प्रकाशापासून संरक्षण करा.

5. अंतर्गत नियंत्रणे

सर्व प्रतिक्रियांमध्ये टेम्प्लेट नसलेले नियंत्रण आणि परिमाणवाचक प्रतिक्रियांसाठी मल्टी-पॉइंट टायट्रेट ट्रेंडलाइनसह चांगले वैशिष्ट्यीकृत, पुष्टी केलेली सकारात्मक आणि नकारात्मक नियंत्रणे समाविष्ट करा.सकारात्मक नियंत्रण इतके मजबूत नसावे की त्यामुळे दूषित होण्याचा धोका निर्माण होईल.न्यूक्लिक अॅसिड काढताना सकारात्मक आणि नकारात्मक निष्कर्षण नियंत्रणे समाविष्ट करा.

प्रत्येक भागात स्पष्ट सूचना पोस्ट केल्या जाव्यात अशी शिफारस केली जाते जेणेकरून वापरकर्त्यांना आचार नियमांबद्दल माहिती असेल.क्लिनिकल नमुन्यांमध्ये DNA किंवा RNA ची अत्यंत कमी पातळी शोधणाऱ्या डायग्नोस्टिक प्रयोगशाळांना PCR पूर्वीच्या खोल्यांमध्ये थोडासा सकारात्मक हवेचा दाब आणि PCR नंतरच्या खोलीत थोडासा नकारात्मक हवेचा दाब असलेली स्वतंत्र हवा हाताळणी प्रणाली असण्याचा अतिरिक्त सुरक्षा उपाय स्वीकारायचा आहे.

शेवटी, गुणवत्ता हमी (QA) योजना विकसित करणे उपयुक्त आहे.अशा योजनेमध्ये अभिकर्मक मास्टर स्टॉक्स आणि कार्यरत स्टॉक्स, किट आणि अभिकर्मक संचयित करण्याचे नियम, नियंत्रण परिणामांचा अहवाल, कर्मचारी प्रशिक्षण कार्यक्रम, समस्यानिवारण अल्गोरिदम आणि आवश्यक असल्यास उपचारात्मक कृती यांचा समावेश असावा.

6. ग्रंथसूची

Aslan A, Kinzelman J, Drelin E, Anan'eva T, Lavander J. Chapter 3: QPCR प्रयोगशाळा सेट करणे.यूएसईपीए क्यूपीसीआर पद्धत 1611 वापरून मनोरंजनात्मक पाण्याच्या चाचणीसाठी मार्गदर्शन दस्तऐवज. लॅन्सिंग- मिशिगन स्टेट युनिव्हर्सिटी.

सार्वजनिक आरोग्य इंग्लंड, NHS.मायक्रोबायोलॉजी तपासणीसाठी यूके मानके: आण्विक प्रवर्धक तपासणी करताना चांगला प्रयोगशाळा सराव).गुणवत्ता मार्गदर्शन.2013;4(4):1–15.

मिफ्लिन टी. पीसीआर प्रयोगशाळा उभारणे.कोल्ड स्प्रिंग हार्ब प्रोटोकॉल.2007;7.

श्रोडर एस 2013. सेंट्रीफ्यूजची नियमित देखभाल: सेंट्रीफ्यूज, रोटर्स आणि अडॅप्टर्सची स्वच्छता, देखभाल आणि निर्जंतुकीकरण (श्वेतपत्र क्रमांक 14).हॅम्बुर्ग: एपेनडॉर्फ;2013.

वियाना आरव्ही, वॉलिस सीएल.निदान प्रयोगशाळांमध्ये वापरल्या जाणार्‍या आण्विक आधारित चाचण्यांसाठी चांगली क्लिनिकल लॅबोरेटरी प्रॅक्टिस (GCLP), इन: अक्यर I, संपादक.गुणवत्ता नियंत्रणाचे विस्तृत स्पेक्ट्रा.रिजेका, क्रोएशिया: इंटेक;2011: 29-52.