Методите за молекуларна детекција имаат способност да произведат голем волумен на нуклеинска киселина преку амплификација на траги од количини пронајдени во примероците. Иако ова е корисно за овозможување на чувствителна детекција, исто така воведува можност за контаминација преку ширење на аеросоли за амплификација во лабораториската средина. При спроведување на експерименти, може да се преземат мерки за да се избегне контаминација на реагенси, лабораториска опрема и простор на клупата, бидејќи таквата контаминација може да генерира лажно позитивни (или лажно негативни) резултати.
За да се намали веројатноста за контаминација, треба постојано да се практикува Добрата лабораториска пракса. Поточно, треба да се преземат мерки на претпазливост во врска со следниве точки:
1. Ракување со реагенси
2. Организација на работен простор и опрема
3. Совет за употреба и чистење за назначениот молекуларен простор
4. Општи совети за молекуларна биологија
5. Внатрешни контроли
6. Библиографија
1. Ракување со реагенси
Накратко центрифугирајте ги епруветите со реагенс пред да ги отворите за да избегнете создавање на аеросоли. Аликвотирајте ги реагенсите за да избегнете повеќекратно замрзнување-одмрзнување и контаминација на главните залихи. Јасно етикетирајте и датирајте ги сите епрувети со реагенс и реакција и водете евиденција за броевите на сериите и сериите на реагенсите што се користеле во сите експерименти. Пипетирајте ги сите реагенси и примероци користејќи врвови за филтрирање. Пред купувањето, препорачливо е да потврдите со производителот дека врвовите за филтрирање одговараат на марката на пипетата што ќе се користи.
2. Организација на работен простор и опрема
Работниот простор треба да биде организиран така што ќе се обезбеди текот на работата да се одвива во една насока, од чисти области (пред-PCR) до валкани области (по-PCR). Следните општи мерки на претпазливост ќе помогнат да се намали можноста за контаминација. Имајте посебни назначени простории, или барем физички одвоени области, за: подготовка на мастермикс, екстракција на нуклеинска киселина и додавање на ДНК шаблон, амплификација и ракување со амплифициран производ и анализа на производот, на пр. гел електрофореза.
Во некои услови, тешко е да се имаат 4 одделни простории. Можна, но помалку пожелна опција е подготовката на мастермиксот да се прави во просторија за складирање, на пр. кабинет со ламинарен проток. Во случај на вгнездена PCR амплификација, подготовката на мастермиксот за реакцијата од вториот круг треба да се подготви во „чистата“ област за подготовка на мастермиксот, но инокулацијата со примарниот PCR производ треба да се направи во просторијата за амплификација, а доколку е можно и во посебна просторија за складирање (на пр. кабинет со ламинарен проток).
Секоја соба/просторија има потреба од посебен сет јасно означени пипети, врвови за филтрирање, држачи за епрувети, вртлози, центрифуги (доколку е релевантно), пенкала, генерички лабораториски реагенси, лабораториски мантили и кутии со ракавици кои ќе останат на нивните соодветни работни станици. Рацете мора да се мијат, а ракавиците и лабораториските мантили да се менуваат при движење помеѓу назначените области. Реагенсите и опремата не треба да се преместуваат од валкана во чиста област. Доколку се појави екстремен случај каде што реагенсот или дел од опремата треба да се премести наназад, прво мора да се деконтаминира со 10% натриум хипохлорит, а потоа да се избрише со стерилна вода.
Забелешка
10% раствор од натриум хипохлорит мора да се подготвува свежо секојдневно. Кога се користи за деконтаминација, треба да се почитува минимално време на контакт од 10 минути.
Алтернативно, комерцијално достапните производи кои се валидирани како средства за деконтаминација на површини кои ја уништуваат ДНК може да се користат ако локалните безбедносни препораки не дозволуваат употреба на натриум хипохлорит или ако натриум хипохлоритот не е погоден за деконтаминација на металните делови од опремата.
Идеално, персоналот треба да се придржува до етосот на еднонасочен работен тек и да не се враќа од валкани области (пост-PCR) назад во чисти области (пред-PCR) истиот ден. Сепак, може да има случаи кога ова е неизбежно. Кога ќе се појави таква пригода, персоналот мора да внимава темелно да ги измие рацете, да ги смени ракавиците, да го користи назначениот лабораториски мантил и да не внесува никаква опрема што ќе сака повторно да ја извади од просторијата, како што се лабораториски книги. Ваквите контролни мерки треба да се нагласат при обуката на персоналот за молекуларни методи.
По употреба, работните површини треба да се исчистат со 10% натриум хипохлорит (проследено со стерилна вода за отстранување на преостанатото белило), 70% етанол или валидиран комерцијално достапен деконтаминант за уништување на ДНК. Идеално, треба да се постават ултравиолетови (UV) ламби за да се овозможи деконтаминација со зрачење. Сепак, употребата на UV ламби треба да се ограничи на затворени работни површини, на пр. безбедносни кабинети, со цел да се ограничи изложеноста на лабораторискиот персонал на UV зрачење. Ве молиме почитувајте ги упатствата на производителот за нега, вентилација и чистење на UV ламбите за да се осигурате дека ламбите остануваат ефикасни.
Доколку се користи 70% етанол наместо натриум хипохлорит, ќе биде потребно зрачење со УВ светлина за да се заврши деконтаминацијата.
Не го чистете вртлогот и центрифугата со натриум хипохлорит; наместо тоа, избришете со 70% етанол и изложете на УВ светлина или користете комерцијален деконтаминант за уништување на ДНК. Во случај на истурање, проверете кај производителот за дополнителни совети за чистење. Доколку упатствата на производителот го дозволуваат тоа, пипетите треба рутински да се стерилизираат во автоклав. Доколку пипетите не можат да се автоклавираат, доволно е да се исчистат со 10% натриум хипохлорит (по што следува темелно бришење со стерилна вода) или со комерцијален деконтаминант за уништување на ДНК, а потоа изложување на УВ зрачење.
Чистењето со висок процент на натриум хипохлорит може на крајот да ги оштети пластиката и металите на пипетата ако се прави редовно; прво проверете ги препораките од производителот. Целата опрема треба редовно да се калибрира според распоредот препорачан од производителот. Овластено лице треба да биде задолжено да обезбеди дека се почитува распоредот за калибрација, дека се водат детални логови и дека сервисните етикети се јасно прикажани на опремата.
3. Совет за употреба и чистење за назначениот молекуларен простор
Пред-PCR: Аликвотирање на реагенси / подготовка на мастермикс: Ова треба да биде најчистиот од сите простори што се користат за подготовка на молекуларни експерименти и идеално треба да биде назначен кабинет за ламинарен проток опремен со UV светлина. Примероците, екстрахираната нуклеинска киселина и амплифицираните PCR производи не смеат да се ракуваат во оваа област. Реагенсите за амплификација треба да се чуваат во замрзнувач (или фрижидер, според препораките на производителот) во истиот назначен простор, идеално веднаш до кабинетот за ламинарен проток или просторот за пред-PCR. Ракавиците треба да се менуваат секој пат при влегување во просторот за пред-PCR или кабинетот за ламинарен проток.
Просторот за пред-PCR или кабинетот за ламинарен проток треба да се чисти пред и по употреба на следниов начин: Избришете ги сите предмети во кабинетот, на пр. пипети, кутии за врвови, вртлог, центрифуга, полици за епрувети, пенкала итн. со 70% етанол или комерцијален деконтаминант за уништување на ДНК и оставете да се исуши. Во случај на затворена работна површина, на пр. кабинет за ламинарен проток, изложете го капакот на UV светлина 30 минути.
Забелешка
Не ги изложувајте реагенсите на УВ светлина; преместете ги во кабинетот само откако ќе биде чист. Доколку вршите PCR со обратна транскрипција, може да биде корисно да ги избришете површините и опремата со раствор кој ги разградува RNases при контакт. Ова може да помогне да се избегнат лажно негативни резултати од ензимска деградација на РНК. По деконтаминацијата и пред подготовката на мастермиксот, ракавиците треба повторно да се сменат, а потоа кабинетот е подготвен за употреба.
Пред-PCR: Екстракција на нуклеинска киселина/додавање на шаблон:
Нуклеинската киселина мора да се екстрахира и ракува во втора означена област, со користење на посебен сет пипети, врвови за филтрирање, држачи за епрувети, свежи ракавици, лабораториски мантили и друга опрема. Оваа област е исто така за додавање на шаблон, контроли и линии на трендот на епруветите или плочите од мастермиксот. За да се избегне контаминација на екстрахираните примероци од нуклеинска киселина што се анализираат, се препорачува да се сменат ракавиците пред да се ракува со позитивни контроли или стандарди и да се користи посебен сет пипети. PCR реагенсите и амплифицираните производи не смеат да се пипетираат во оваа област. Примероците треба да се чуваат во означени фрижидери или замрзнувачи во истата област. Работниот простор за примероци треба да се чисти на ист начин како и просторот за мастермиксот.
Пост-PCR: Амплификација и ракување со амплифицираниот производ
Овој означен простор е за процеси по амплификацијата и треба да биде физички одделен од областите пред PCR. Обично содржи термоциклатори и платформи во реално време, а идеално треба да има кабинет за ламинарен проток за додавање на PCR производот од првата рунда во реакцијата од втората рунда, ако се изведува вгнездена PCR. PCR реагенсите и екстрахираната нуклеинска киселина не смеат да се ракуваат во оваа област бидејќи ризикот од контаминација е висок. Оваа област треба да има посебен сет ракавици, лабораториски мантили, полици за плочи и епрувети, пипети, врвови за филтрирање, канти и друга опрема. Епруветите мора да се центрифугираат пред отворањето. Работниот простор за примероци треба да се исчисти на ист начин како и просторот за мастермикс.
Пост-PCR: Анализа на производот
Оваа просторија е наменета за опрема за детекција на производи, на пр. резервоари за гел електрофореза, полначи за напојување, УВ трансилуминатор и систем за документација на гел. Оваа просторија треба да има посебни комплети ракавици, лабораториски мантили, полици за плочи и епрувети, пипети, врвови за филтрирање, контејнери и друга опрема. Во оваа просторија не смеат да се внесуваат други реагенси, освен боја за полнење, молекуларен маркер и агарозен гел, како и компоненти на пуфер. Работниот простор за примероци треба да се чисти на ист начин како и просторот за мастермикс.
Важна забелешка
Идеално, во просториите пред PCR не треба да се влегува истиот ден ако веќе е извршена работа во просториите по PCR. Ако ова е сосема неизбежно, осигурајте се дека рацете прво се темелно измиени и дека во просториите се носат специфични лабораториски мантили. Лабораториските книги и документацијата не смеат да се внесуваат во просториите пред PCR ако се користеле во просториите по PCR; доколку е потребно, земете дупликати од протоколи/идентификации на примероци итн.
4. Општи совети за молекуларна биологија
Користете ракавици без пудра за да избегнете инхибиција на анализата. Правилната техника на пипетирање е од клучно значење за намалување на контаминацијата. Неправилното пипетирање може да резултира со прскање при дозирање течности и создавање на аеросоли. Добра практика за правилно пипетирање може да се најде на следните линкови: Водич за пипетирање на Гилсон, видеа за техника на пипетирање на Анакем, Центрифугирајте ги цевките пред да ги отворите и внимателно отворете ги за да избегнете прскање. Затворете ги цевките веднаш по употреба за да избегнете внесување на загадувачи.
Кога изведувате повеќе реакции, подгответе една мастер-смеса што содржи вообичаени реагенси (на пр. вода, dNTP, пуфер, прајмери и ензим) за да се минимизира бројот на трансфери на реагенси и да се намали заканата од контаминација. Се препорачува мастер-смесата да се постави на мраз или ладен блок. Употребата на ензим за топол старт може да помогне да се намали производството на неспецифични производи. Заштитете ги реагенсите што содржат флуоресцентни сонди од светлина за да се избегне деградација.
5. Внатрешни контроли
Вклучете добро карактеризирани, потврдени позитивни и негативни контроли, заедно со контрола без шаблон во сите реакции и титрирана линија на тренд со повеќе точки за квантитативни реакции. Позитивната контрола не треба да биде толку силна што да претставува ризик од контаминација. Вклучете позитивни и негативни контроли за екстракција при вршење екстракција на нуклеинска киселина.
Се препорачува да се постават јасни упатства во секоја од областите, така што корисниците ќе бидат запознаени со правилата на однесување. Дијагностичките лаборатории кои детектираат многу ниски нивоа на ДНК или РНК во клинички примероци можеби ќе сакаат да усвојат дополнителна безбедносна мерка со тоа што ќе имаат посебни системи за ракување со воздух со малку позитивен воздушен притисок во просториите пред PCR и малку негативен воздушен притисок во просториите по PCR.
Конечно, корисно е да се развие план за обезбедување квалитет (QA). Таквиот план треба да вклучува листи на основни залихи на реагенси и работни залихи, правила за складирање на комплети и реагенси, известување за резултатите од контролата, програми за обука на персоналот, алгоритми за решавање проблеми и корективни мерки кога е потребно.
6. Библиографија
Аслан А, Кинзелман Ј, Дрилин Е, Ананева Т, Лавандер Ј. Поглавје 3: Воспоставување на qPCR лабораторија. Документ со упатства за тестирање на рекреативни води со користење на qPCR методот 1611 на USEPA. Државен универзитет во Лансинг - Мичиген.
Јавно здравство на Англија, NHS. Стандарди на Велика Британија за микробиолошки испитувања: Добра лабораториска пракса при вршење на анализи за молекуларна амплификација). Упатство за квалитет. 2013;4(4):1–15.
Мифлин Т. Воспоставување на PCR лабораторија. Cold Spring Harb Protoc. 2007;7.
Шредер С 2013. Рутинско одржување на центрифуги: чистење, одржување и дезинфекција на центрифуги, ротори и адаптери (Бела книга бр. 14). Хамбург: Епендорф; 2013.
Вијана Р.В., Валис К.Л. Добра клиничка лабораториска пракса (GCLP) за молекуларно базирани тестови што се користат во дијагностички лаборатории, Во: Акјар И, уредник. Широк спектар на контрола на квалитетот. Риека, Хрватска: Intech; 2011: 29–52.
Време на објавување: 16 јули 2020 година
