Методите на молекуларна детекција имаат способност да произведат голем волумен на нуклеинска киселина преку засилување на количините во трагови кои се наоѓаат во примероците.Иако ова е корисно за овозможување чувствително откривање, исто така воведува можност за контаминација преку ширење на засилувачки аеросоли во лабораториската средина.При спроведување на експерименти, може да се преземат мерки за да се избегне контаминација на реагенси, лабораториска опрема и простор на клупата, бидејќи таквата контаминација може да генерира лажно-позитивни (или лажно-негативни) резултати.

За да се намали веројатноста за контаминација, треба постојано да се применува Добра лабораториска пракса.Поточно, треба да се преземат мерки на претпазливост во врска со следниве точки:

1. Ракување со реагенси
2. Организација на работен простор и опрема
3. Совети за употреба и чистење за назначениот молекуларен простор
4. Општи совети за молекуларна биологија
5. Внатрешни контроли
6. Библиографија

1. Ракување со реагенси

Накратко центрифугирајте ги цевките за реагенс пред да ги отворите за да избегнете создавање на аеросоли.Аликвотни реагенси за да се избегне повеќекратно замрзнување-одмрзнување и контаминација на главните резерви.Јасно означете ги и означете датум за сите цевки за реагенс и реакција и одржувајте дневници на множеството реагенс и броевите на сериите што се користат во сите експерименти.Пипетирајте ги сите реагенси и примероци користејќи врвови за филтер.Пред купувањето, препорачливо е да потврдите кај производителот дека врвовите на филтерот одговараат на марката на пипетата што ќе се користи.

2. Организација на работен простор и опрема

Работниот простор треба да се организира за да се осигура дека текот на работата се одвива во една насока, од чисти области (пред-PCR) до валкани области (пост-PCR).Следниве општи мерки на претпазливост ќе помогнат да се намалат шансите за контаминација.Имајте посебни назначени простории, или барем физички одделни области, за: подготовка на мастермикс, екстракција на нуклеинска киселина и додавање на шаблон ДНК, засилување и ракување со засилениот производ и анализа на производот, на пр. гел електрофореза.

Во некои поставки, тешко е да се има 4 посебни соби.Можна, но помалку пожелна опција е подготовката на мастермиксот да се направи во затворен простор, на пр. кабинет со ламинарен проток.Во случај на вгнездено PCR засилување, подготовката на мастермиксот за реакцијата од вториот круг треба да се подготви во „чистата“ област за подготовка на мастермикс, но инокулацијата со примарниот PCR производ треба да се направи во просторијата за засилување, и ако е можно во посветен простор за задржување (на пр. кабинет со ламинарен проток).

Секоја соба/област има потреба од посебен сет на јасно означени пипети, врвови за филтри, лавици за цевки, вртлози, центрифуги (доколку е релевантно), пенкала, генерички лабораториски реагенси, лабораториски мантили и кутии со ракавици кои ќе останат на нивните работни станици.Рацете мора да се мијат и да се менуваат ракавиците и лабораториските мантили кога се движите помеѓу назначените области.Реагенсите и опремата не треба да се преместуваат од валкана област во чиста област.Доколку се појави екстремен случај кога реагенсот или дел од опремата треба да се поместат наназад, прво мора да се деконтаминира со 10% натриум хипохлорит, а потоа да се избрише со стерилна вода.

Забелешка

10% раствор на натриум хипохлорит мора да се приготвува свеж дневно.Кога се користи за деконтаминација, треба да се почитува минималното време на контакт од 10 минути.
Алтернативно, комерцијално достапните производи кои се потврдени како површински деконтаминанти кои ја уништуваат ДНК може да се користат доколку локалните безбедносни препораки не дозволуваат употреба на натриум хипохлорит или ако натриум хипохлоритот не е погоден за деконтаминација на металните делови од опремата.

Идеално, персоналот треба да се придржува до етосот на еднонасочниот работен тек и да не оди од валкани области (пост-PCR) назад во чисти области (пред-PCR) истиот ден.Сепак, може да има прилики кога тоа е неизбежно.Кога ќе се појави таква прилика, персоналот мора да се грижи темелно да ги мие рацете, да ги смени ракавиците, да го користи назначениот лабораториски мантил и да не внесува опрема што ќе сака да ја извади од просторијата повторно, како што се лабораториски книги.Ваквите контролни мерки треба да се нагласат при обуката на персоналот за молекуларни методи.

По употребата, просторите за клупи треба да се исчистат со 10% натриум хипохлорит (проследено со стерилна вода за да се отстрани преостанатото белило), 70% етанол или валидиран комерцијално достапен деконтаминант за уништување на ДНК.Идеално, треба да се вградат ултравиолетови (УВ) светилки за да се овозможи деконтаминација со зрачење.Сепак, употребата на УВ ламби треба да се ограничи на затворени работни места, на пр. безбедносни кабинети, со цел да се ограничи изложеноста на УВ на лабораторискиот персонал.Ве молиме придржувајте се до упатствата на производителот за нега, вентилација и чистење на УВ ламбите за да се осигурате дека светилките остануваат ефективни.

Ако се користи 70% етанол наместо натриум хипохлорит, ќе биде потребно зрачење со УВ светлина за да се заврши деконтаминацијата.
Не чистете го вителот и центрифугирајте со натриум хипохлорит;наместо тоа, избришете го со 70% етанол и изложете го на УВ светлина или користете комерцијален деконтаминант што уништува ДНК.За истекување, проверете кај производителот за дополнителни совети за чистење.Ако упатството на производителот го дозволува тоа, пипетите треба рутински да се стерилизираат со автоклав.Ако пипетите не можат да се автоклавираат, доволно е да се исчистат со 10% натриум хипохлорит (проследено со темелно бришење со стерилна вода) или со комерцијален деконтаминант што ја уништува ДНК проследено со изложување на УВ.

Чистењето со натриум хипохлорит со висок процент на крајот може да ја оштети пластиката и металите од пипетата ако се прави на редовна основа;прво проверете ги препораките од производителот.Целата опрема треба редовно да се калибрира според распоредот препорачан од производителот.Назначеното лице треба да биде задолжено да се погрижи да се придржува до распоредот за калибрација, да се одржуваат детални дневници и етикетите за сервисирање се јасно прикажани на опремата.

3. Совети за употреба и чистење за назначениот молекуларен простор

Пред-ПЦР: Издвојување на реагенс / подготовка на мастермикс: Ова треба да биде најчистиот од сите простори што се користат за подготовка на молекуларни експерименти и идеално треба да биде назначен кабинет со ламинарен проток опремен со УВ светлина.Примероците, екстрахираната нуклеинска киселина и производите со засилена PCR не смеат да се ракуваат во оваа област.Реагенсите за засилување треба да се чуваат во замрзнувач (или фрижидер, според препораките на производителот) на истиот одреден простор, идеално до кабинетот за ламинарен проток или пред-PCR областа.Ракавиците треба да се менуваат секој пат кога ќе влезете во пред-ПЦР-областа или во кабинетот за ламинарен проток.

Областа пред PCR или кабинетот за ламинарен проток треба да се исчистат пред и по употреба на следниов начин: Избришете ги сите предмети во кабинетот, на пр. пипети, кутии со врвови, вител, центрифуга, држачи за цевки, пенкала итн. со 70% етанол или комерцијален деконтаминант што ја уништува ДНК и оставете да се исуши.Во случај на затворена работна површина, на пр. кабинет со ламинарен проток, изложете ја аспираторот на УВ светлина 30 минути.

Забелешка

Не изложувајте ги реагенсите на УВ светлина;само преместете ги во кабинетот откако ќе се исчисти.Ако вршите PCR со обратна транскрипција, може да биде корисно и да ги избришете површините и опремата со раствор што ги разградува RN-азите при контакт.Ова може да помогне да се избегнат лажно-негативни резултати од ензимската деградација на РНК.По деконтаминацијата и пред подготовката на мастермиксот, ракавиците треба да се сменат уште еднаш, а потоа кабинетот е подготвен за употреба.

Pre-PCR: екстракција на нуклеинска киселина/додавање шаблон:

Нуклеинската киселина мора да се екстрахира и да се ракува во втора одредена област, со користење на посебен сет на пипети, врвови за филтри, лавици за цевки, свежи ракавици, лабораториски мантили и друга опрема. мастермикс цевки или плочи.За да се избегне контаминација на извадените примероци на нуклеинска киселина кои се анализираат, се препорачува да се сменат ракавиците пред да се ракува со позитивни контроли или стандарди и да се користи посебен сет на пипети.PCR реагенси и засилени производи не смеат да се пипетираат во оваа област.Примероците треба да се чуваат во одредени фрижидери или замрзнувачи во истата област.Работниот простор на примерокот треба да се исчисти на ист начин како и просторот за мастермикс.

Пост-ПЦР: Засилување и ракување со засилениот производ

Овој назначен простор е за пост-засилување процеси и треба да биде физички одвоен од областите пред PCR.Обично содржи термоциклери и платформи во реално време, и идеално би требало да има кабинет за ламинарен проток за додавање на круг 1 PCR производ во реакцијата на кругот 2, доколку се врши вгнездена PCR.Во оваа област не смеат да се ракуваат со PCR реагенси и екстрахирана нуклеинска киселина бидејќи ризикот од контаминација е висок.Оваа област треба да има посебен сет на ракавици, лабораториски мантили, лавици за чинии и цевки, пипети, врвови за филтри, канти и друга опрема.Цевките мора да се центрифугираат пред да се отворат.Работниот простор на примерокот треба да се исчисти на ист начин како и просторот за мастермикс.

Пост-ПЦР: Анализа на производот

Оваа просторија е наменета за опрема за детекција на производи, на пр. резервоари за електрофореза со гел, пакети за напојување, УВ трансилуминатор и систем за документација со гел.Оваа област треба да има посебни комплети на ракавици, лабораториски мантили, лавици за чинии и цевки, пипети, врвови за филтри, канти и друга опрема.Ниту еден друг реагенс не може да се внесе во оваа област, со исклучок на бојата за полнење, молекуларниот маркер и агарозниот гел и пуферските компоненти.Работниот простор на примерокот треба да се исчисти на ист начин како и просторот за мастермикс.

Важна забелешка

Идеално, во просториите за пред-ПЦР не треба да се влегува истиот ден ако веќе е извршена работа во просториите за пост-ПЦР.Ако ова е сосема неизбежно, погрижете се прво темелно да се измијат рацете и да се носат специфични лабораториски мантили во собите.Лабораториските книги и документите не смеат да се внесуваат во просториите за пред-ПЦР доколку се користени во просториите по ПЦР;доколку е потребно, направете дупликат отпечатоци на протоколи/примероци за идентификација, итн.

4. Општи совети за молекуларна биологија

Користете ракавици без прашок за да избегнете инхибиција на анализата.Правилната техника на пипетирање е најважна за намалување на контаминацијата.Неправилното пипетирање може да резултира со прскање при издавање течности и создавање на аеросоли.Добрата практика за правилно поставување на пипета може да се најде на следните линкови: Гилсон водич за пипетирање, видеа со техниката на пипетирање на Анахем, Центрифугирајте ги цевките пред да ги отворите и отворете ги внимателно за да избегнете прскање.Затворете ги цевките веднаш по употребата за да избегнете внесување на загадувачи.

При изведување на повеќе реакции, подгответе една мастермикс што содржи вообичаени реагенси (на пр. вода, dNTP, пуфер, прајмери ​​и ензими) за да се минимизира бројот на трансфери на реагенси и да се намали заканата од контаминација.Се препорачува мастермиксот да се постави на мраз или ладен блок.Употребата на ензимот Hot Start може да помогне да се намали производството на неспецифични производи.Заштитете ги реагенсите што содржат флуоресцентни сонди од светлина за да избегнете деградација.

5. Внатрешни контроли

Вклучете добро карактеризирани, потврдени позитивни и негативни контроли, заедно со контрола без шаблон во сите реакции и титрирана линија на тренд со повеќе точки за квантитативни реакции.Позитивната контрола не треба да биде толку силна што да претставува ризик од контаминација.Вклучете позитивни и негативни контроли за екстракција при изведување на екстракција на нуклеинска киселина.

Се препорачува да се постават јасни упатства во секоја од областите за корисниците да бидат свесни за правилата на однесување.Дијагностичките лаборатории кои детектираат многу ниски нивоа на ДНК или РНК во клиничките примероци можеби ќе сакаат да усвојат дополнителна безбедносна мерка да имаат посебни системи за ракување со воздухот со малку позитивен воздушен притисок во просториите пред PCR и малку негативен воздушен притисок во просториите по PCR.

На крајот, развојот на план за обезбедување квалитет (QA) е корисен.Таквиот план треба да вклучува списоци на основни резерви на реагенси и работни залихи, правила за складирање комплети и реагенси, известување за резултатите од контролата, програми за обука на персоналот, алгоритми за отстранување проблеми и поправни дејства кога е потребно.

6. Библиографија

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Поглавје 3: Поставување на qPCR лабораторија.Документ за насоки за тестирање на рекреативни води со методот USEPA qPCR 1611. Лансинг- Државниот универзитет во Мичиген.

Јавно здравство Англија, NHS.Стандарди на Обединетото Кралство за микробиолошки испитувања: Добра лабораториска пракса при изведување на молекуларни амплификација анализи).Упатство за квалитет.2013; 4 (4): 1-15.

Mifflin T. Поставување на PCR лабораторија.Cold Spring Harb Protoc.2007; 7.

Schroeder S 2013. Рутинско одржување на центрифугите: чистење, одржување и дезинфекција на центрифуги, ротори и адаптери (Бела хартија бр. 14).Хамбург: Епендорф;2013 година.

Виана Р.В., Волис КЛ.Добра клиничка лабораториска пракса (GCLP) за молекуларни тестови кои се користат во дијагностички лаборатории, Во: Akyar I, уредник.Широк спектар на контрола на квалитетот.Риека, Хрватска: Интех;2011: 29–52.