Ko nga tikanga rapu rapoi he kaha ki te whakaputa i te nui o te waikawa karihi ma te whakanui i nga rahinga tohu e kitea ana i roto i nga tauira.Ahakoa he painga tenei mo te whakaahei i te rapunga tairongo, ka whakaatu ano i te tupono o te poke ma te horapa o nga aerosol whakakaha i roto i te taiao taiwhanga.I te wa e whakahaere ana i nga whakamatautau, ka taea te mahi ki te karo i te poke o nga reagents, nga taputapu taiwhanga me te waahi papa, na te mea tera pea ka puta nga hua he-tika (he kino-kino ranei).

Hei awhina i te whakaiti i te tupono o te poke, me mahi i nga Mahi Taiwhanga Pai i nga wa katoa.Ina koa, me mahi tupato mo nga waahanga e whai ake nei:

1. Te whakahaere i nga reagents
2. Whakaritenga mokowāmahi me nga taputapu
3. Te whakamahi me te horoi i nga tohutohu mo te waahi ngota i tohua
4. Tohutohu koiora irapoi whānui
5. Nga mana o roto
6. Te pukapuka pukapuka

1. Te whakahaere i nga reagents

Whakanuia poto nga ngongo reagent i mua i te whakatuwheratanga hei karo i te whakatipuranga aerosol.Ko nga reagents Aliquot hei karo i te maha o nga hukapapa me te poke o nga rakau rangatira.Maamaa te tapanga me te whakaingoatia nga ngongo reagent me nga ngongo tauhohenga me te pupuri i nga raarangi o te rota reagent me nga tau puranga e whakamahia ana i roto i nga whakamatautau katoa.Pipeto nga reagents me nga tauira katoa ma te whakamahi i nga tohutohu tātari.I mua i te hoko, he mea tika ki te whakau me te kaiwhakanao ko nga tohutohu tātari ka uru ki te waitohu paipa hei whakamahi.

2. Whakaritenga mokowāmahi me nga taputapu

Me whakarite te mokowāmahi ki te whakarite kia puta te rere o nga mahi ki tetahi huarahi, mai i nga waahi ma (i mua i te PCR) ki nga waahi paru (i muri i te PCR).Ko nga whakatupato whanui e whai ake nei ka awhina ki te whakaiti i te tupono o te poke.Me whai rūma motuhake, he iti rawa ranei nga waahi motuhake, mo: te whakarite i te ranunga matua, te tangohanga waikawa karihi me te taapiri tauira DNA, te whakakaha me te whakahaere i te hua whakakaha, me te tātari hua, penei i te gel electrophoresis.

I etahi waahi, he uaua te whai 4 ruma motuhake.Ko tetahi mea ka taea engari he iti ake te hiahia ko te whakarite i te ranunga matua i roto i te waahi pupuri, hei tauira, te rūnanga rerenga rama.Mo te whakakaha PCR kohanga, me whakarite te whakarite o te mastermix mo te tauhohenga a tawhio tuarua ki te waahi 'ma' mo te whakarite mastermix, engari ko te inoculation me te hua PCR tuatahi me mahi i roto i te ruma whakanui, a ki te taea. i roto i te waahi whakapumautanga (hei tauira, te rūnanga rerenga rama).

Kei ia rūma/rohe he huinga motuhake o nga pipette e marama ana te tapanga, nga tohutohu tātari, nga whata ngongo, nga vortexes, centrifuges (mehemea e tika ana), pene, reagents taiwhanga whanui, koti taiwhanga me nga pouaka karapu ka noho ki o raatau mahi.Me horoi nga ringaringa, me whakarereke nga karapu me nga koti taiwhanga ina neke ana i waenga i nga waahi kua tohua.Ko nga reagents me nga taputapu kaua e nekehia mai i te waahi paru ki te waahi ma.Mena ka ara ake he keehi tino nui e tika ana kia neke whakamuri tetahi reagent, tetahi taputapu taputapu ranei, me whakawetohia ki te 10% konutai hypochlorite, katahi ka muru ki te wai parakore.

Tuhipoka

Me hanga hou te wairewa konutai hypochlorite 10% ia ra.I te wa e whakamahia ana mo te whakakore i te poke, me u tonu te wa whakapiri mo te 10 meneti.
Ko etahi atu, ko nga hua e waatea ana ki te hokohoko e whakamanahia ana hei whakakino i te mata o te DNA ka taea te whakamahi mena karekau nga taunakitanga haumaru a-rohe e whakaae ki te whakamahi i te konutai hypochlorite, ki te kore ranei e pai te konutai hypochlorite mo te whakakore i nga waahanga konganuku o nga taputapu.

Ko te tikanga, me u nga kaimahi ki nga tikanga o te rerenga mahi kotahi, kaua hoki e hoki atu i nga waahi paru (muri-PCR) ki nga waahi ma (i mua i te PCR) i te ra kotahi.Heoi ano, tera pea etahi wa kaore e taea te karo.I te wa e pa ana, me tupato nga kaimahi ki te horoi ringaringa, ki te whakarereke i nga karapu, ki te whakamahi i te koti taiwhanga kua tohua me te kore e whakauru i nga taputapu e hiahia ana ratou ki te tango ano i waho o te ruma, penei i nga pukapuka taiwhanga.Ko enei tikanga whakahaere me whakanuia i roto i nga whakangungu a nga kaimahi mo nga tikanga ngota.

I muri i te whakamahinga, me horoi nga waahi papa ki te 10% konutai hypochlorite (ka whai i te wai parakore hei tango i te toenga o te hātea), 70% te waihano, he whakangao whakakino DNA ranei kua whakamanahia mo te hokohoko.Ko te mea pai, me whakauru nga rama ultra-violet (UV) kia taea ai te whakakore i te mate ma te whakamaarama.Heoi, me whakawhäitihia te whakamahinga o nga rama UV ki nga waahi mahi kati, hei tauira, i nga kaata haumaru, kia iti ai te kite o nga kaimahi taiwhanga UV.Kia mau ki nga tohutohu a nga kaihanga mo te tiaki rama UV, te whakamahana me te horoi kia pai ai nga rama.

Mēnā ka whakamahi i te 70% te waihā hei utu i te konutai hypochlorite, ka hiahiatia te whakamaarama me te rama UV hei whakaoti i te whakakino.
Kaua e horoi i te vortex me te centrifuge ki te konutai hypochlorite;engari, horoia ki te 70% te waihano me te whakaatu ki te rama UV, te whakamahi ranei i te whakakino DNA-whakangaro i te arumoni.Mo nga pakaru, tirohia me te kaihanga mo etahi atu tohutohu horoi.Mena ka whakaaetia e nga tohutohu a te kaiwhakanao, me whakahoroa nga pipette ki te autoclave.Ki te kore e taea te whakakii i nga pipettes, me horoi ki te 10% konutai hypochlorite (ka whai i te muru ki te wai parakore) me te whakangao whakakino DNA arumoni ka whai i te whakamararatanga o te UV.

Ko te horoi me te konutai puota-haurau teitei ka pakaru pea nga kirihou paipa me nga konganuku mena ka mahia i ia wa;tirohia nga taunakitanga mai i te kaihanga tuatahi.Ko nga taputapu katoa me whakatikatika i nga wa katoa kia rite ki te raarangi kua tohua e te kaiwhakanao.Ko te tangata kua tohua hei whakahaere mo te whakarite kia u ki te raarangi whakatikatika, kia mau tonu nga raarangi taipitopito, me nga tapanga ratonga ka whakaatuhia ki runga taputapu.

3. Te whakamahi me te horoi i nga tohutohu mo te waahi ngota i tohua

Pre-PCR: Reagent aliquoting / mastermix preparation: Ko tenei te mea tino ma rawa atu o nga waahi katoa e whakamahia ana mo te whakarite i nga whakamatautau irapo me te mea pai me waiho he rūnanga rerenga maramara kua mau ki te rama UV.Ko nga tauira, ko te waikawa karihi kua tangohia, me nga hua PCR kua whakakahatia me kaua e whakahaere i tenei waahi.Me pupuri nga reagents whakakaha ki roto i te pouaka tio (me te pouaka whakamatao ranei, e ai ki nga taunakitanga a nga kaihanga) i te waahi kua whakaritea, he pai ki te taha o te rūnanga rerenga rama, te waahi o mua i te PCR.Me huri nga karapu i ia wa ka uru atu koe ki te waahi o mua i te PCR, ki te rūnanga rerenga maramara ranei.

Ko te waahi i mua i te PCR, i te rūnanga rere maramara ranei me horoi i mua atu i muri i te whakamahi i enei e whai ake nei: Horoia nga mea katoa i roto i te rūnanga, hei tauira, pipettes, pouaka matamata, vortex, centrifuge, whata ngongo, pene, me etahi atu me te 70% te waihano ranei. te whakakino DNA arumoni, ka tuku kia maroke.Mënä he wähi mahi katia, hei tauira, he rūnanga rere rama, whakawhänuihia te uhi ki te rama UV mo te 30 meneti.

Tuhipoka

Kaua e tukuna nga reagents ki te rama UV;nuku noa ki roto i te rūnanga ina kua ma.Mena kei te mahi whakamuri i te PCR, he pai ano pea te muru i nga papa me nga taputapu me te otinga ka pakaru nga RNases ina pa atu.Ka awhina pea tenei ki te karo i nga hua kino-kore mai i te paheketanga o te RNA.Whai muri i te whakakorenga me i mua i te whakareri i te mastermix, me huri ano nga karapu, katahi ka reri te rūnanga ki te whakamahi.

Pre-PCR: Tangohanga waikawa nucleic/taapiri tauira:

Me tango te waikawa nucleic me te whakahaere i tetahi waahi kua tohua, ma te whakamahi i te huinga paipa, nga tohutohu tātari, nga whata ngongo, nga karapu hou, nga koti taiwhanga me etahi atu taputapu. ngongo mastermix pereti ranei.Hei karo i te poke o nga tauira waikawa karihi kua tangohia e wetewetehia ana, e taunaki ana kia whakarerekehia nga karapu i mua i te whakahaere i nga mana whakahaere pai, i nga paerewa pai ranei, me te whakamahi i tetahi huinga paipa.Ko nga reagents PCR me nga hua whakakaha me kaua e paipa ki tenei waahi.Me penapena nga tauira ki roto i nga pouaka pouaka kua tohua, ki roto ranei i nga pouaka tio i te waahi kotahi.Me horoi te tauira mokowāmahi kia rite ki te mokowā mastermix.

Post-PCR: Whakanuia me te whakahaere i te hua whakakaha

Ko tenei waahi kua tohua mo nga mahi i muri i te whakakaha, me wehe a tinana mai i nga waahi o mua i te PCR.I te nuinga o te wa kei roto i nga thermocyclers me nga papaa-wa-waa, me te mea pai me whai rūnanga rerenga rama mo te taapiri i te hua PCR a tawhio noa 1 ki te tauhohenga a tawhio 2, mena kei te mahia te PCR kohanga.Ko nga reagents PCR me te waikawa karihi kua tangohia me kaua e whakahaere i tenei waahi i te mea he nui te mate o te poke.Ko tenei waahi me whai huinga karapu motuhake, koti taiwhanga, papa pereti me te ngongo, pipettes, tohutohu tātari, ipu me etahi atu taputapu.Ko nga ngongo me centrifuge i mua i te whakatuwheratanga.Me horoi te tauira mokowāmahi kia rite ki te mokowā mastermix.

Post-PCR: Te tātari hua

Ko tenei rūma mo nga taputapu rapu hua, penei i nga taika reera electrophoresis, kete hiko, UV transilluminator me te punaha tuhinga reera.Me whai huinga karapu motuhake, koti taiwhanga, whatanga pereti me te ngongo, pipettes, tohutohu tātari, ipu me etahi atu taputapu.Karekau he reagents e taea te kawe mai ki roto i tenei waahi, haunga te waikano uta, te tohu irapoi me te rae agarose, me nga waahanga parepare.Me horoi te tauira mokowāmahi kia rite ki te mokowā mastermix.

Tuhipoka nui

Ko te mea pai, kia kaua e kuhu nga ruma i mua i te PCR i te ra kotahi mena kua oti te mahi i roto i nga ruma i muri i te PCR.Ki te kore rawa e taea te karo, me tino horoia nga ringaringa me te mau koti taiwhanga motuhake i roto i nga ruma.Kaua e haria nga pukapuka taiwhanga me nga pepa ki roto i nga ruma i mua i te PCR mena kua whakamahia i roto i nga ruma i muri i te PCR;mehemea e tika ana, tangohia nga taarua taarua o nga kawa/tauira ID, aha atu.

4. Tohutohu koiora irapoi whānui

Whakamahia nga karapu paura-kore hei karo i te aukati whakamatautau.Ko te tikanga paipa paipa he mea nui ki te whakaiti i te poke.Ko te paipa paipa he he ka puta ka pakaru i te tuku wai me te hanga aerosol.Ko nga tikanga pai mo te paipa paipa ka kitea i nga hononga e whai ake nei: He aratohu a Gilson mo te paipa, he ataata hangarau paipa Anachem, ngongo Centrifuge i mua i te whakatuwheratanga, ka ata whakatuwhera kia kore e pakaru.Katia nga ngongo i muri tonu i te whakamahinga hei karo i te whakaurunga o nga poke.

Ina mahia nga tauhohenga maha, whakareri kia kotahi te ranunga matua kei roto i nga reagents noa (hei tauira, te wai, nga dNTP, te buffer, te tuatahi me te enzyme) hei whakaiti i te maha o nga whakawhitinga reagent me te whakaiti i te riri o te poke.E taunaki ana ki te whakarite i te mastermix ki runga i te hukapapa, i te paraka makariri ranei.Ma te whakamahi i te whanakiki Hot Start ka awhina pea ki te whakaiti i te hanga hua kore-motuhake.Tiakihia nga reagents e mau ana i nga rangahau korakora mai i te marama kia kore ai e paheke.

5. Nga mana o roto

Whakauruhia nga mana pai me te mana kino kua tohua, kua whakapumautia, me te mana kore-tauira i roto i nga tauhohenga katoa, me te raina ia kua titrated-maha mo nga tauhohenga ine.Ko te mana pai kia kaua e tino kaha ka pa he mate poke.Whakauruhia nga mana tangohanga pai me te kino i te wa e mahi ana i te tangohanga waikawa karihi.

E taunaki ana kia whakairihia nga tohutohu marama ki ia waahi kia mohio ai nga kaiwhakamahi ki nga ture whakahaere.Ko nga taiwhanga taiwhanga e kitea ana nga taumata iti rawa o te DNA, te RNA ranei i roto i nga tauira haumanu ka hiahia ki te tango i te taapiri haumarutanga o te whai punaha whakahaere hau motuhake me te pehanga hau pai i roto i nga ruuma i mua i te PCR me te pehanga hau paku kino i roto i nga ruma whai muri i te PCR.

Ka mutu, he pai te whakawhanake i te mahere whakapumautanga kounga (QA).Ko taua mahere me uru ki nga rarangi o nga rakau reagent master me nga rakau mahi, nga ture mo te rokiroki kete me nga reagents, te ripoata mo nga hua whakahaere, nga kaupapa whakangungu kaimahi, nga rapurongoa algorithm, me nga mahi whakaora ina hiahiatia.

6. Te pukapuka pukapuka

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Upoko 3: Te whakatu i tetahi taiwhanga qPCR.He tuhinga aratohu mo te whakamatautau i nga wai whakangahau ma te whakamahi tikanga USEPA qPCR 1611. Lansing- Michigan State University.

Hauora Tūmatanui Ingarangi, NHS.Ko nga paerewa UK mo nga tirotirohanga moroiti: He Mahinga Taiwhanga Pai i te wa e mahi ana i nga whakamatautau whakakaha rapoi).Arataki Kounga.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Whakaritea he taiwhanga PCR.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Te tiaki i nga wa katoa o te centrifuges: te horoi, te tiaki me te whakakore i nga centrifuges, nga rotors me nga taputapu (Pepa White Nama 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Mahinga Taiwhanga Haumanu Pai (GCLP) mo nga whakamatautau i runga i te ngota i whakamahia i roto i nga taiwhanga tātaritanga, I: Akyar I, ētita.Te whānuitanga o te mana kounga.Rijeka, Croatia: Intech;2011: 29–52.