Ny fomba fitiliana molekiola dia manana fahafahana mamokatra asidra nokleika be dia be amin'ny alàlan'ny fanamafisana ny habetsaky ny trace hita ao amin'ny santionany.Na dia mahasoa aza izany amin'ny fampandehanana ny fitiliana saro-pady, dia mampiditra ny mety hisian'ny loto amin'ny alàlan'ny fiparitahan'ny aerosol fanamafisana ao amin'ny tontolo laboratoara.Rehefa manao andrana dia azo atao ny fepetra hisorohana ny fandotoana ny reagents, ny fitaovana laboratoara ary ny toerana dabilio, satria mety hiteraka vokatra diso (na diso) ny loto toy izany.

Mba hampihenana ny mety hisian'ny fandotoana dia tokony hampiharina amin'ny fotoana rehetra ny fanao tsara amin'ny laboratoara.Indrindra indrindra, tokony horaisina ny fitandremana momba ireto teboka manaraka ireto:

1. Fikarakarana reagents
2. Fandaminana ny toeram-piasana sy ny fitaovana
3. Torohevitra momba ny fampiasana sy fanadiovana ho an'ny habaka molekiola voatondro
4. Torohevitra momba ny biolojia molekiola ankapobeny
5. Fanaraha-maso anatiny
6. Bibliographie

1. Fikarakarana reagents

Apetaho vetivety ny fantsona reagent alohan'ny hanokafana mba hisorohana ny famokarana aerosol.Aliquot reagents mba hialana amin'ny fangatsiahana maro sy ny fandotoana ny tahiry master.Asio marika mazava sy asio daty ny fantsom-pamokarana rehetra sy ny fantsom-pandrefesana ary tazony ny diarin'ny reagent lot sy ny laharan'ny batch ampiasaina amin'ny fanandramana rehetra.Pipette ny reagents rehetra sy ny santionany amin'ny fampiasana toro-hevitra sivana.Alohan'ny hividianana dia tsara ny manamarina amin'ny mpanamboatra fa ny toro-hevitra sivana dia mifanaraka amin'ny marika pipette hampiasaina.

2. Fandaminana ny toeram-piasana sy ny fitaovana

Tokony halamina ny toeram-piasana mba hahazoana antoka fa mandeha amin'ny lalana iray ny fandehan'ny asa, manomboka amin'ny faritra madio (pre-PCR) mankany amin'ny faritra maloto (post-PCR).Ireto fepetra manaraka ireto dia hanampy amin'ny fampihenana ny mety hisian'ny loto.Manana efitrano voatokana manokana, na faritra misaraka ara-batana farafahakeliny, ho an'ny: fanomanana mastermix, fitrandrahana asidra nokleika sy fanampim-panazavana ADN, fanamafisam-peo sy fikarakarana ny vokatra nohamafisina, ary famakafakana ny vokatra, ohatra, ny electrophoresis gel.

Amin'ny toe-javatra sasany, sarotra ny manana efitrano 4 misaraka.Ny safidy azo atao nefa tsy dia tiana loatra dia ny fanaovana ny fanomanana mastermix amin'ny faritra misy fitoeran-drano, ohatra amin'ny kabinetran'ny laminar.Raha ny fanamafisam-peo PCR nested, ny fanomanana ny mastermix ho an'ny fanehoan-kevitra fihodinana faharoa dia tokony homanina ao amin'ny faritra 'madio' ho fanomanana mastermix, fa ny inoculation miaraka amin'ny vokatra PCR voalohany dia tokony hatao ao amin'ny efitrano fanamafisam-peo, ary raha azo atao. ao amin'ny faritra fitehirizana voatokana (oh: kabinetra mikoriana laminar).

Ny efitrano/faritra tsirairay dia mila pipettes misy marika mazava tsara, toro-hevitra amin'ny sivana, fitoeran'entana, vortex, centrifuges (raha ilaina), penina, reagents laboratoara, akanjo laboratoara ary boaty misy fonon-tanana izay hijanona ao amin'ny toeram-piasana tsirairay avy.Tsy maintsy sasana ny tanana ary ovaina ny fonon-tanana sy akanjo laboratoara rehefa mifindra eo anelanelan'ny faritra voatondro.Ny reagents sy ny fitaovana dia tsy tokony hafindra avy amin'ny faritra maloto mankany amin'ny toerana madio.Raha toa ka misy tranga faran'izay tsy maintsy afindra mihemotra ny reagent na fitaovana iray, dia tsy maintsy hodiovina amin'ny hypochlorite sodium 10% aloha ilay izy, ary avy eo fafana amin'ny rano maloto.

Fanamarihana

Ny vahaolana 10% sodium hypochlorite dia tsy maintsy amboarina vaovao isan'andro.Rehefa ampiasaina amin'ny fandotoana dia tokony harahina 10 minitra farafahakeliny ny fotoana fifandraisana.
Raha tsy izany dia azo ampiasaina ny vokatra azo amidy eny an-tsena izay voamarina ho fandotoana ny tany manimba ny ADN raha toa ka tsy mamela ny fampiasana ny sodium hypochlorite ny tolo-kevitry ny fiarovana eo an-toerana na raha tsy mety amin'ny fandotoana ny ampahany metaly amin'ny fitaovana.

Raha ny tokony ho izy, ny mpiasa dia tokony hanaraka ny fitsipiky ny asa tsy misy tari-dalana ary tsy hiala amin'ny faritra maloto (post-PCR) hiverina any amin'ny faritra madio (pre-PCR) amin'io andro io ihany.Na izany aza, mety misy fotoana tsy azo ihodivirana izany.Rehefa mitranga izany fotoana izany, ny mpiasa dia tsy maintsy mitandrina ny manasa tanana tsara, manova fonon-tanana, mampiasa ny akanjon'ny laboratoara voatondro ary tsy mampiditra fitaovana izay tian'izy ireo havoaka indray ao amin'ny efitrano, toy ny boky laboratoara.Ny fepetra fanaraha-maso toy izany dia tokony hamafisina amin'ny fanofanana mpiasa momba ny fomba molekiola.

Aorian'ny fampiasana dia tokony hodiovina amin'ny 10% sodium hypochlorite (arahin'ny rano sterile hanesorana ny bleach sisa tavela), éthanol 70%, na decontaminant manimba ADN azo amidy amin'ny varotra.Ny tsara indrindra dia ny jiro ultra-violet (UV) dia tokony hapetraka mba ahafahana manadio amin'ny alàlan'ny taratra.Na izany aza, ny fampiasana jiro UV dia tokony hoferana amin'ny faritra miasa mihidy, ohatra ny kabinetra fiarovana, mba hamerana ny taratra UV ataon'ny mpiasan'ny laboratoara.Azafady, araho ny torolalan'ny mpanamboatra momba ny fikarakarana jiro UV, ny rivotra ary ny fanadiovana mba hahazoana antoka fa mahomby ny jiro.

Raha mampiasa ethanol 70% fa tsy ny sodium hypochlorite, dia ilaina ny taratra UV mba hamitana ny fanadiovana.
Aza manadio ny vortex sy ny centrifuge amin'ny sodium hypochlorite;fafao kosa miaraka amin'ny ethanol 70% ary apetaho amin'ny taratra UV, na mampiasa fanafody manimba ADN ara-barotra.Ho an'ny fiparitahana dia miresaha amin'ny mpanamboatra raha mila torohevitra fanampiny momba ny fanadiovana.Raha avelan'ny mpanamboatra izany, dia tokony ho sterilized amin'ny autoclave ny pipettes.Raha tsy azo atao autoclave ny pipettes, dia ampy ny manadio azy ireo amin'ny 10% sodium hypochlorite (arahin'ny famafana tsara amin'ny rano sterile) na miaraka amin'ny fanafody manimba ADN ara-barotra arahin'ny taratra UV.

Ny fanadiovana amin'ny sodium hypochlorite avo lenta dia mety hanimba plastika sy metaly pipette amin'ny farany raha atao tsy tapaka;jereo aloha ny tolo-kevitry ny mpanamboatra.Ny fitaovana rehetra dia tokony hohamarinina tsy tapaka araka ny fandaharam-potoana atolotry ny mpanamboatra.Ny olona voatendry dia tokony ho tompon'andraikitra amin'ny fiantohana fa manaraka ny fandaharam-potoanan'ny calibration, voatazona ny logs amin'ny antsipiriany, ary ny mari-pamantarana serivisy dia aseho mazava amin'ny fitaovana.

3. Torohevitra momba ny fampiasana sy fanadiovana ho an'ny habaka molekiola voatondro

Pre-PCR: Fiomanana ho an'ny reagent aliquoting / mastermix: Ity no toerana madio indrindra amin'ny toerana rehetra ampiasaina amin'ny fanomanana ny andrana molekiola ary ny tena tsara dia tokony ho kabinetra fikorianan'ny laminar misy hazavana UV.Ny santionany, ny asidra nokleika nalaina ary ny vokatra PCR nohamafisina dia tsy tokony hokarakaraina amin'ity faritra ity.Tokony hotehirizina ao anaty vata fampangatsiahana (na vata fampangatsiahana, araka ny tolo-kevitry ny mpanamboatra) ao amin'ny toerana voatondro mitovy ny reagents fanamafisam-peo, tsara indrindra eo akaikin'ny kabinetran'ny laminar na ny faritra mialoha ny PCR.Tokony hovana ny fonon-tanana isaky ny miditra ao amin'ny faritra mialohan'ny PCR na kabinetran'ny laminar flow.

Tokony hodiovina mialoha sy aorian'ny fampiasana ny faritra alohan'ny PCR na ny kabinetra fikorianan'ny laminar toy izao manaraka izao: Fafao ny entana rehetra ao amin'ny kabinetra, ohatra, pipettes, boaty tendrony, vortex, centrifuge, racks tube, pen, sns miaraka amin'ny ethanol 70% na a decontaminant manimba ADN ara-barotra, ary avela ho maina.Raha misy faritra miasa mihidy, ohatra, kabinetra mikoriana laminar, apetaho amin'ny hazavana UV mandritra ny 30 minitra ny kapaoty.

Fanamarihana

Aza aseho amin'ny hazavana UV ny reagents;afindra ao anaty kabinetra fotsiny izy ireo rehefa madio.Raha manao PCR transcription mivadika, dia mety hanampy ihany koa ny famafana ny faritra sy ny fitaovana amin'ny vahaolana izay manimba ny RNases amin'ny fifandraisana.Mety hanampy amin'ny fisorohana ny voka-dratsy diso avy amin'ny fahapotehan'ny enzyme ny RNA izany.Aorian'ny fanadiovana ary alohan'ny hanomanana ny mastermix dia tokony hovana indray ny fonon-tanana, ary avy eo dia vonona ny hampiasaina ny kabinetra.

Pre-PCR: fitrandrahana asidra nukleika/fanampiana modely:

Ny asidra nukleika dia tsy maintsy alaina sy karakaraina ao amin'ny faritra voatondro faharoa, amin'ny fampiasana pipettes misaraka, toro-hevitra amin'ny sivana, fametahana fantsona, fonon-tanana vaovao, akanjo laboratoara ary fitaovana hafa. fantsona mastermix na takelaka.Mba hisorohana ny fandotoana ireo santionany amin'ny asidra nokleika nalaina izay anadihadiana, dia asaina manova fonon-tanana alohan'ny hikarakarana ny fanaraha-maso tsara na ny fenitra ary ny fampiasana pipettes manokana.Ny reagents PCR sy ny vokatra amplified dia tsy tokony hosotroina amin'ity faritra ity.Ny santionany dia tokony hotehirizina ao anaty vata fampangatsiahana na vata fampangatsiahana amin'ny faritra iray ihany.Ny toeram-piasana santionany dia tokony hodiovina amin'ny fomba mitovy amin'ny habaka mastermix.

Post-PCR: Fanamafisana sy fikarakarana ny vokatra nohamafisina

Ity toerana voatondro ity dia natao ho an'ny fizotran'ny fanamafisam-peo ary tokony hisaraka ara-batana amin'ny faritra mialoha ny PCR.Matetika izy io dia misy thermocyclers sy sehatra tena izy, ary ny tena tsara dia tokony hanana kabinetra fikorianan'ny laminar hanampiana ny vokatra PCR 1 amin'ny fihodinana 2, raha atao ny PCR nested.Ny reagents PCR sy ny asidra nokleika nalaina dia tsy tokony hokarakaraina amin'io faritra io satria avo lenta ny mety hisian'ny loto.Ity faritra ity dia tokony hanana fonon-tanana mitokana, akanjo laboratoara, fitoeran'ny takelaka sy fantsona, pipettes, toro-hevitra momba ny sivana, koba ary fitaovana hafa.Ny fantsona dia tsy maintsy atao centrifuge alohan'ny hanokafana.Ny toeram-piasana santionany dia tokony hodiovina amin'ny fomba mitovy amin'ny habaka mastermix.

Post-PCR: Famakafakana vokatra

Ity efitrano ity dia natao ho an'ny fitaovana fitiliana ny vokatra, ohatra ny fiara mifono vy electrophoresis gel, fonosana herinaratra, transilluminator UV ary ny rafitra fitahirizana gel.Ity faritra ity dia tokony hanana fonon-tanana misaraka, akanjo laboratoara, fitoeran'ny takelaka sy fantsona, pipettes, toro-hevitra amin'ny sivana, koba ary fitaovana hafa.Tsy misy reagents hafa azo entina ao amin'io faritra io, tsy tafiditra ao anatin'izany ny fandokoana entana, ny marika molekiola ary ny gel agarose, ary ny singa buffer.Ny toeram-piasana santionany dia tokony hodiovina amin'ny fomba mitovy amin'ny habaka mastermix.

Fanamarihana manan-danja

Raha ny tokony ho izy dia tsy tokony hidirana amin’io andro io ny efitrano mialoha ny fanaovana PCR raha toa ka efa vita ny asa ao amin’ny efitrano aorian’ny PCR.Raha toa ka tsy azo ihodivirana tanteraka izany, dia ataovy izay hahazoana antoka fa sasana tsara aloha ny tanana ary misy akanjo laboratoara manokana ao amin'ny efitrano.Ny bokin'ny laboratoara sy ny antontan-taratasy dia tsy tokony hampidirina ao amin'ny efitrano alohan'ny PCR raha efa nampiasaina tao amin'ny efitrano taorian'ny PCR;raha ilaina, makà dika mitovy amin'ny protocols/sample ID, sns.

4. Torohevitra momba ny biolojia molekiola ankapobeny

Mampiasà fonon-tanana tsy misy vovoka mba hialana amin'ny fanakanana fitiliana.Ny teknika pipetting marina no tena ilaina amin'ny fampihenana ny loto.Ny fametahana tsy mety dia mety hiteraka fiparitahana rehefa mamoaka ranon-javatra sy mamorona aerosol.Ny fanazaran-tena tsara ho an'ny fantsona tsara dia azo jerena ao amin'ireto rohy manaraka ireto: Torolàlana Gilson amin'ny fantsona, horonan-tsary momba ny teknikan'ny pipetting Anachem, fantsona centrifuge alohan'ny hanokafana azy, ary sokafy tsara mba tsy hiparitaka.Akatona ny fantsona avy hatrany aorian'ny fampiasana mba hisorohana ny fampidirana loto.

Rehefa manao fanehoan-kevitra maromaro dia manomana fangaro iray misy reagents mahazatra (ohatra ny rano, dNTPs, buffer, primers ary enzyme) mba hampihenana ny isan'ny famindrana reagent ary hampihenana ny loza ateraky ny loto.Amporisihina ny hametraka ny mastermix amin'ny gilasy na sakana mangatsiaka.Ny fampiasana anzima Hot Start dia mety hanampy amin'ny fampihenana ny famokarana vokatra tsy voafaritra.Arovy amin'ny hazavana ny reagents misy probe fluorescent mba hisorohana ny fahasimbana.

5. Fanaraha-maso anatiny

Ampidiro ny fanaraha-maso tsara voamarika tsara, voamarina tsara sy ratsy, miaraka amin'ny fanaraha-maso tsy misy template amin'ny fanehoan-kevitra rehetra, ary ny trendline misy teboka maromaro ho an'ny fanehoan-kevitra marobe.Ny fanaraha-maso tsara dia tsy tokony ho mafy loatra ka mety hiteraka fahalotoana.Ampidiro ny fanaraha-maso fitrandrahana tsara sy ratsy rehefa manao fitrandrahana asidra nukleika.

Amporisihina ny hametrahana toromarika mazava amin'ny faritra tsirairay mba hahafantaran'ny mpampiasa ny fitsipi-pitondrantena.Ny laboratoara diagnostika mahita ny haavon'ny ADN na RNA ambany dia ambany amin'ny santionany klinika dia mety te-hanao ny fepetra fiarovana fanampiny amin'ny fananana rafitra fitantanana rivotra misaraka miaraka amin'ny tsindry rivotra kely ao amin'ny efitrano mialoha ny PCR ary ny tsindrin-drivotra miiba kely ao amin'ny efitrano post-PCR.

Farany, manampy ny famolavolana drafitra momba ny kalitao (QA).Ny drafitra toy izany dia tokony ahitana lisitr'ireo tahirin-tsarimihetsika reagent sy tahiry miasa, fitsipika momba ny fitahirizana fitaovana sy reagents, tatitra momba ny vokatra fanaraha-maso, programa fanofanana mpiasa, algorithm famahana olana, ary hetsika fanarenana rehefa ilaina izany.

6. Bibliographie

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Toko 3: fametrahana laboratoara qPCR.Taratasy tari-dalana amin'ny fitiliana ny rano fialamboly amin'ny fampiasana ny fomba USEPA qPCR 1611. Lansing- Michigan State University.

Public Health England, NHS.Fenitry ny UK momba ny fanadihadiana mikraoba: Fampiharana tsara amin'ny laboratoara rehefa manao fitiliana amplification molecular).Torolàlana momba ny kalitao.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Fametrahana laboratoara PCR.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Fikojakojana tsy tapaka ny centrifuges: fanadiovana, fikojakojana ary famonoana ny centrifuges, rotors ary adapters (Taratasy fotsy No. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) ho an'ny fitsapana mifototra amin'ny molekiola ampiasaina amin'ny laboratoara diagnostika, In: Akyar I, tonian-dahatsoratra.Wide spectra ny fanaraha-maso ny kalitao.Rijeka, Kroasia: Intech;2011: 29–52.