Molekulārās noteikšanas metodēm ir iespēja ražot lielu daudzumu nukleīnskābes, pastiprinot paraugos atrastos daudzumus.Lai gan tas ir izdevīgi, lai nodrošinātu jutīgu noteikšanu, tas arī rada piesārņojuma iespēju, izplatot amplifikācijas aerosolus laboratorijas vidē.Veicot eksperimentus, var veikt pasākumus, lai izvairītos no reaģentu, laboratorijas aprīkojuma un stenda telpu piesārņošanas, jo šāds piesārņojums var radīt kļūdaini pozitīvus (vai viltus negatīvus) rezultātus.

Lai palīdzētu samazināt piesārņojuma iespējamību, vienmēr ir jāievēro laba laboratorijas prakse.Konkrēti, piesardzības pasākumi jāveic attiecībā uz šādiem punktiem:

1. Darbības ar reaģentiem
2. Darba telpas un aprīkojuma organizācija
3. Norādītās molekulārās telpas lietošanas un tīrīšanas ieteikumi
4. Vispārīgi molekulārās bioloģijas padomi
5. Iekšējā kontrole
6. Bibliogrāfija

1. Darbības ar reaģentiem

Pirms atvēršanas īsi centrifugējiet reaģenta mēģenes, lai izvairītos no aerosolu veidošanās.Sadaliet reaģentus alikvotā veidā, lai izvairītos no vairākkārtējas sasaldēšanas un atkausēšanas un galveno krājumu piesārņošanas.Skaidri marķējiet un datējiet visas reaģentu un reakcijas mēģenes un saglabājiet visos eksperimentos izmantoto reaģentu partiju un partiju numuru žurnālus.Izmantojot filtru uzgaļus, ar pipeti ievadiet visus reaģentus un paraugus.Pirms iegādes ieteicams pārliecināties ar ražotāju, vai filtra uzgaļi atbilst izmantojamās pipetes zīmolam.

2. Darba telpas un aprīkojuma organizācija

Darba vieta ir jāorganizē tā, lai nodrošinātu, ka darba plūsma notiek vienā virzienā, no tīrām zonām (pirms PCR) līdz netīrajām zonām (pēc PCR).Sekojošie vispārīgie piesardzības pasākumi palīdzēs samazināt piesārņojuma iespējamību.Jābūt atsevišķām telpām vai vismaz fiziski nošķirtām zonām, lai sagatavotu galveno maisījumu, nukleīnskābju ekstrahētu un pievienotu DNS veidnes, pastiprinātu un apstrādātu pastiprinātu produktu, kā arī produkta analīzi, piemēram, gēla elektroforēzi.

Dažos apstākļos ir grūti izveidot 4 atsevišķas telpas.Iespējama, bet mazāk vēlama iespēja ir veikt mastermix sagatavošanu norobežotā zonā, piemēram, laminārās plūsmas skapī.Nested PCR amplifikācijas gadījumā mastermix sagatavošana otrās kārtas reakcijai jāsagatavo 'tīrajā' zonā mastermix sagatavošanai, bet inokulācija ar primāro PCR produktu jāveic amplifikācijas telpā un, ja iespējams. speciālā norobežojuma zonā (piemēram, laminārās plūsmas skapī).

Katrai telpai/zonai ir nepieciešams atsevišķs skaidri marķētu pipešu komplekts, filtru uzgaļi, mēģeņu statīvi, virpuļi, centrifūgas (ja nepieciešams), pildspalvas, vispārīgi laboratorijas reaģenti, laboratorijas mēteļi un cimdu kastes, kas paliks attiecīgajās darbstacijās.Pārvietojoties starp norādītajām vietām, ir jānomazgā rokas un jāmaina cimdi un laboratorijas mēteļi.Reaģentus un aprīkojumu nedrīkst pārvietot no netīras vietas uz tīru vietu.Ja rodas ārkārtējs gadījums, kad reaģents vai aprīkojums ir jāpārvieto atpakaļ, tas vispirms ir jāattīra ar 10% nātrija hipohlorītu un pēc tam jānoslauka ar sterilu ūdeni.

Piezīme

10% nātrija hipohlorīta šķīdums katru dienu jāsagatavo svaigs.Lietojot dekontaminācijai, jāievēro minimālais kontakta laiks 10 minūtes.
Alternatīvi var izmantot komerciāli pieejamus produktus, kas ir apstiprināti kā DNS iznīcinoši virsmas dekontaminanti, ja vietējie drošības ieteikumi neļauj izmantot nātrija hipohlorītu vai ja nātrija hipohlorīts nav piemērots aprīkojuma metālisko daļu dekontaminācijai.

Ideālā gadījumā personālam vajadzētu ievērot vienvirziena darba plūsmas principu un tajā pašā dienā no netīrajām zonām (pēc PCR) atgriezties tīrās zonās (pirms PCR).Tomēr var būt gadījumi, kad tas ir neizbēgami.Ja rodas šāds gadījums, personālam ir rūpīgi jānomazgā rokas, jānomaina cimdi, jālieto tam paredzētais laboratorijas mētelis un nedrīkst ievietot nekādu aprīkojumu, ko viņi vēlēsies izņemt no telpas, piemēram, laboratorijas grāmatas.Šādi kontroles pasākumi būtu jāuzsver personāla apmācībā par molekulārajām metodēm.

Pēc lietošanas sola telpas jānotīra ar 10% nātrija hipohlorītu (pēc tam ar sterilu ūdeni, lai noņemtu atlikušo balinātāju), 70% etanolu vai apstiprinātu komerciāli pieejamu DNS iznīcinošu dekontaminatoru.Ideālā gadījumā būtu jāaprīko ultravioletās (UV) lampas, lai nodrošinātu dekontamināciju ar apstarošanu.Tomēr UV lampu izmantošana būtu jāierobežo slēgtās darba zonās, piemēram, drošības skapjos, lai ierobežotu laboratorijas personāla UV iedarbību.Lūdzu, ievērojiet ražotāja norādījumus par UV lampu kopšanu, ventilāciju un tīrīšanu, lai nodrošinātu, ka lampas joprojām ir efektīvas.

Ja nātrija hipohlorīta vietā izmantojat 70% etanolu, dekontaminācijas pabeigšanai būs nepieciešama apstarošana ar UV gaismu.
Netīriet virpuli un centrifūgu ar nātrija hipohlorītu;tā vietā noslaukiet ar 70% etanolu un pakļaujiet UV gaismai vai izmantojiet komerciālu DNS iznīcinošu dekontaminatoru.Ja nav noplūdes, sazinieties ar ražotāju, lai saņemtu papildu ieteikumus par tīrīšanu.Ja ražotāja norādījumi to atļauj, pipetes regulāri jāsterilizē autoklāvā.Ja pipetes nevar ievietot autoklāvā, pietiek ar to notīrīšanu ar 10% nātrija hipohlorītu (pēc tam rūpīgi noslaukot ar sterilu ūdeni) vai ar komerciālu DNS iznīcinošu dekontaminatoru, kam seko UV iedarbība.

Tīrīšana ar augstu nātrija hipohlorīta procentuālo daudzumu var sabojāt pipetes plastmasu un metālus, ja to veic regulāri;vispirms pārbaudiet ražotāja ieteikumus.Visas iekārtas ir regulāri jākalibrē saskaņā ar ražotāja ieteikto grafiku.Izraudzītai personai ir jābūt atbildīgai par to, lai nodrošinātu, ka tiek ievērots kalibrēšanas grafiks, tiek uzturēti detalizēti žurnāli un uz aprīkojuma ir skaidri redzamas servisa etiķetes.

3. Norādītās molekulārās telpas lietošanas un tīrīšanas ieteikumi

Iepriekšēja PCR: reaģenta alikvotā sadale / galvenā maisījuma sagatavošana: tai ir jābūt tīrākajai no visām molekulāro eksperimentu sagatavošanai izmantotajām telpām, un ideālā gadījumā tai vajadzētu būt laminārai plūsmas skapim, kas aprīkots ar UV gaismu.Šajā zonā nedrīkst apstrādāt paraugus, ekstrahētu nukleīnskābi un amplificētus PCR produktus.Amplifikācijas reaģenti jāuzglabā saldētavā (vai ledusskapī, saskaņā ar ražotāja ieteikumiem) tajā pašā paredzētajā vietā, ideālā gadījumā blakus laminārās plūsmas skapim vai pirms-PCR zonai.Cimdi jāmaina katru reizi, ieejot pirms-PCR zonā vai laminārās plūsmas skapī.

Pirms PCR zona vai laminārās plūsmas skapis pirms un pēc lietošanas ir jātīra šādi: Noslaukiet visus korpusā esošos priekšmetus, piemēram, pipetes, uzgaļu kastes, virpuļvadu, centrifūgu, mēģeņu statīvus, pildspalvas utt. ar 70% etanolu vai komerciālu DNS iznīcinošu dekontaminantu un ļauj nožūt.Slēgtas darba zonas gadījumā, piemēram, laminārās plūsmas skapis, 30 minūtes pakļaujiet nosūcēju UV gaismai.

Piezīme

Nepakļaujiet reaģentus UV gaismas iedarbībai;ievietojiet tos skapī tikai tad, kad tas ir tīrs.Veicot reversās transkripcijas PCR, var būt noderīgi arī noslaucīt virsmas un aprīkojumu ar šķīdumu, kas saskarē noārda RNāzes.Tas var palīdzēt izvairīties no kļūdaini negatīviem RNS enzīmu sadalīšanās rezultātiem.Pēc dekontaminācijas un pirms mastermix sagatavošanas cimdi jānomaina vēlreiz, un tad skapis ir gatavs lietošanai.

Pirms PCR: nukleīnskābes ekstrakcija/veidnes pievienošana:

Nukleīnskābe ir jāekstrahē un ar to jārīkojas otrā noteiktā vietā, izmantojot atsevišķu pipešu komplektu, filtru uzgaļus, cauruļu statīvus, svaigus cimdus, laboratorijas mēteļus un citu aprīkojumu. Šī zona ir paredzēta arī veidnes, vadības ierīču un tendenču līniju pievienošanai Mastermix caurules vai plāksnes.Lai izvairītos no analizējamo ekstrahēto nukleīnskābju paraugu piesārņošanas, pirms pozitīvas kontroles vai standartu apstrādes ieteicams nomainīt cimdus un izmantot atsevišķu pipešu komplektu.PCR reaģentus un pastiprinātos produktus nedrīkst pipetēt šajā zonā.Paraugi jāuzglabā paredzētos ledusskapjos vai saldētavās tajā pašā vietā.Parauga darbvieta ir jātīra tāpat kā mastermix telpa.

Pēc-PCR: amplifikācija un amplificētā produkta apstrāde

Šī paredzētā vieta ir paredzēta pēcpastiprināšanas procesiem, un tai jābūt fiziski atdalītai no pirms-PCR zonām.Parasti tajā ir termocikleri un reāllaika platformas, un ideālā gadījumā tam vajadzētu būt lamināras plūsmas skapim, lai 1. kārtas PCR produktu pievienotu 2. kārtas reakcijai, ja tiek veikta ligzdotā PCR.Šajā zonā nedrīkst rīkoties ar PCR reaģentiem un ekstrahētu nukleīnskābi, jo ir augsts piesārņojuma risks.Šajā zonā jābūt atsevišķam cimdu komplektam, laboratorijas mēteļiem, šķīvju un cauruļu statīviem, pipetēm, filtru uzgaļiem, tvertnēm un citam aprīkojumam.Caurules pirms atvēršanas jācentrifugē.Parauga darbvieta ir jātīra tāpat kā mastermix telpa.

Pēc PCR: produkta analīze

Šī telpa ir paredzēta produktu noteikšanas aprīkojumam, piemēram, gēla elektroforēzes tvertnēm, barošanas blokiem, UV transiluminatoram un gēla dokumentācijas sistēmai.Šajā zonā jābūt atsevišķiem cimdu komplektiem, laboratorijas mēteļiem, plākšņu un cauruļu statīviem, pipetēm, filtru uzgaļiem, tvertnēm un citam aprīkojumam.Šajā zonā nevar ienest citus reaģentus, izņemot iekraušanas krāsvielu, molekulāro marķieri un agarozes želeju un bufera komponentus.Parauga darbvieta ir jātīra tāpat kā mastermix telpa.

Svarīga piezīme

Ideālā gadījumā telpās pirms PCR nevajadzētu iekļūt tajā pašā dienā, ja darbs pēc PCR telpās jau ir veikts.Ja tas ir pilnīgi neizbēgami, vispirms rūpīgi nomazgājiet rokas un telpās valkājiet īpašus laboratorijas mēteļus.Laboratorijas grāmatas un dokumentus nedrīkst ienest telpās pirms PCR, ja tās ir izmantotas telpās pēc PCR;ja nepieciešams, paņem dublētus protokolu/ID paraugus utt.

4. Vispārīgi molekulārās bioloģijas padomi

Izmantojiet cimdus bez pūdera, lai izvairītos no testa kavēšanas.Pareiza pipetēšanas tehnika ir vissvarīgākā, lai samazinātu piesārņojumu.Nepareiza pipetēšana var izraisīt izšļakstīšanos šķidrumu izdalīšanas laikā un aerosolu veidošanos.Labu praksi pareizai pipetēšanai var atrast šādās saitēs: Gilson pipetēšanas rokasgrāmata, Anachem pipetēšanas tehnikas video, Centrifūgas mēģenes pirms atvēršanas un uzmanīgi atveriet tās, lai izvairītos no izšļakstīšanās.Tūlīt pēc lietošanas aizveriet mēģenes, lai izvairītos no piesārņotāju iekļūšanas.

Veicot vairākas reakcijas, sagatavojiet vienu galveno maisījumu, kas satur parastos reaģentus (piemēram, ūdeni, dNTP, buferšķīdumu, praimerus un fermentu), lai samazinātu reaģentu pārneses skaitu un samazinātu piesārņojuma draudus.Mastermix ieteicams uzstādīt uz ledus vai auksta bloka.Hot Start fermenta izmantošana var palīdzēt samazināt nespecifisku produktu ražošanu.Reaģentus, kas satur fluorescējošās zondes, aizsargājiet no gaismas, lai izvairītos no degradācijas.

5. Iekšējā kontrole

Iekļaujiet labi raksturotas, apstiprinātas pozitīvās un negatīvās kontroles, kā arī kontroli bez šablona visās reakcijās un daudzpunktu titrētu tendences līniju kvantitatīvajām reakcijām.Pozitīvajai kontrolei nevajadzētu būt tik spēcīgai, ka tā rada piesārņojuma risku.Veicot nukleīnskābju ekstrakciju, iekļaujiet pozitīvas un negatīvas ekstrakcijas kontroles.

Ieteicams katrā zonā ievietot skaidrus norādījumus, lai lietotāji būtu informēti par uzvedības noteikumiem.Diagnostikas laboratorijas, kas konstatē ļoti zemu DNS vai RNS līmeni klīniskajos paraugos, iespējams, vēlēsies pieņemt papildu drošības pasākumu, proti, atsevišķas gaisa apstrādes sistēmas ar nedaudz pozitīvu gaisa spiedienu telpās pirms PCR un nedaudz negatīvu gaisa spiedienu telpās pēc PCR.

Visbeidzot, ir noderīgi izstrādāt kvalitātes nodrošināšanas (QA) plānu.Šādā plānā jāiekļauj reaģentu galveno krājumu un darba krājumu saraksti, komplektu un reaģentu uzglabāšanas noteikumi, kontroles rezultātu ziņošana, personāla apmācības programmas, problēmu novēršanas algoritmi un korektīvie pasākumi, ja nepieciešams.

6. Bibliogrāfija

Aslans A, Kinzelmans J, Dreelins E, Ananjeva T, Lavanders J. 3. nodaļa: qPCR laboratorijas iestatīšana.Vadlīniju dokuments atpūtas ūdeņu testēšanai, izmantojot USEPA qPCR metodi 1611. Lansing-Michigan State University.

Sabiedrības veselība Anglijā, NHS.Apvienotās Karalistes standarti mikrobioloģijas pētījumiem: laba laboratorijas prakse, veicot molekulārās amplifikācijas testus).Kvalitātes vadlīnijas.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. PCR laboratorijas izveide.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Regulārā centrifūgu apkope: centrifūgu, rotoru un adapteru tīrīšana, apkope un dezinfekcija (Baltais papīrs Nr. 14).Hamburga: Eppendorfa;2013. gads.

Viana RV, Wallis CL.Laba klīniskā laboratorijas prakse (GCLP) molekulāriem testiem, ko izmanto diagnostikas laboratorijās, In: Akyar I, redaktors.Plašs kvalitātes kontroles spektrs.Rijeka, Horvātija: Intech;2011: 29–52.