Molekuliniai aptikimo metodai turi galimybę pagaminti didelį kiekį nukleino rūgšties, amplifikuojant mėginiuose rastus pėdsakus.Nors tai naudinga, kad būtų galima atlikti jautrų aptikimą, taip pat atsiranda užteršimo galimybė, kai laboratorijos aplinkoje pasklinda amplifikaciniai aerozoliai.Atliekant eksperimentus galima imtis priemonių, kad būtų išvengta reagentų, laboratorinės įrangos ir stendo užteršimo, nes toks užteršimas gali sukelti klaidingai teigiamus (arba klaidingai neigiamus) rezultatus.

Siekiant sumažinti užteršimo tikimybę, visada reikia laikytis geros laboratorinės praktikos.Visų pirma, reikia imtis atsargumo priemonių dėl šių punktų:

1. Reagentų tvarkymas
2. Darbo erdvės ir įrangos organizavimas
3. Nurodytos molekulinės erdvės naudojimo ir valymo patarimai
4. Bendrieji molekulinės biologijos patarimai
5. Vidaus kontrolė
6. Bibliografija

1. Reagentų tvarkymas

Prieš atidarydami reagento mėgintuvėlius trumpai centrifuguokite, kad nesusidarytų aerozoliai.Padalinkite reagentus, kad išvengtumėte daugkartinio užšalimo ir atšildymo ir pagrindinių atsargų užteršimo.Aiškiai pažymėkite visus reagentų ir reakcijos mėgintuvėlius ir datą bei veskite visuose eksperimentuose naudotų reagentų partijų ir partijų numerių žurnalus.Pipete supilkite visus reagentus ir mėginius naudodami filtro antgalius.Prieš perkant, patartina pasiteirauti su gamintoju, ar filtro antgaliai tinka naudotinos pipetės prekės ženklui.

2. Darbo erdvės ir įrangos organizavimas

Darbo erdvė turi būti organizuota taip, kad darbas vyktų viena kryptimi, nuo švarių zonų (prieš PGR) į nešvarias vietas (po PGR).Šios bendrosios atsargumo priemonės padės sumažinti užteršimo tikimybę.Įrengti atskiras patalpas arba bent fiziškai atskirtas zonas: pagrindinio mišinio paruošimui, nukleorūgščių ekstrakcijai ir DNR šablono pridėjimui, amplifikuoto produkto amplifikacijai ir tvarkymui bei produkto analizei, pvz., gelio elektroforezei.

Kai kuriais atvejais sunku turėti 4 atskirus kambarius.Galimas, bet mažiau pageidautinas pasirinkimas yra paruošti pagrindinį mišinį izoliacinėje zonoje, pvz., laminarinėje srauto spintoje.Kai atliekama įdėtos PGR amplifikacija, pagrindinio mišinio ruošimas antrojo raundo reakcijai turi būti ruošiamas „švarioje“ pagrindinio mišinio paruošimo vietoje, tačiau pirminio PGR produkto inokuliacija turi būti atliekama amplifikacijos patalpoje ir, jei įmanoma. tam skirtoje izoliavimo zonoje (pvz., laminarinio srauto spintoje).

Kiekvienam kambariui / sričiai reikalingas atskiras aiškiai pažymėtų pipečių, filtrų antgalių, mėgintuvėlių lentynų, sūkurių, centrifugų (jei reikia), rašiklių, bendrųjų laboratorinių reagentų, laboratorinių apsiaustų ir pirštinių dėžučių rinkinio, kurie liks atitinkamose darbo vietose.Judant tarp tam skirtų vietų būtina nusiplauti rankas, pasikeisti pirštines ir laboratorinius chalatus.Reagentų ir įrangos negalima perkelti iš nešvarios vietos į švarią.Jei atsirastų ekstremalus atvejis, kai reagentą ar įrangą reikia perkelti atgal, pirmiausia jį reikia nukenksminti 10 % natrio hipochloritu, o po to nuvalyti steriliu vandeniu.

Pastaba

10 % natrio hipochlorito tirpalas turi būti ruošiamas šviežias kasdien.Kai naudojamas dezaktyvavimui, turi būti laikomasi mažiausiai 10 minučių sąlyčio laiko.
Arba galima naudoti parduodamus produktus, kurie patvirtinti kaip DNR ardantys paviršiaus dezaktyvatoriai, jei vietinės saugos rekomendacijos neleidžia naudoti natrio hipochlorito arba jei natrio hipochloritas netinka metalinėms įrangos dalims nukenksminti.

Idealiu atveju darbuotojai turėtų laikytis vienakrypčio darbo etoso ir tą pačią dieną negrįžti iš nešvarių vietų (po PGR) į švarias zonas (prieš PGR).Tačiau gali būti atvejų, kai tai neišvengiama.Atsiradus tokiai progai, darbuotojai turi pasirūpinti, kad kruopščiai nusiplautų rankas, pasikeistų pirštines, vilkėtų tam skirtą laboratorinį chalatą ir neįneštų jokios įrangos, kurią jie norėtų vėl išnešti iš patalpos, pavyzdžiui, laboratorinių knygų.Tokios kontrolės priemonės turėtų būti akcentuojamos mokant personalą molekulinių metodų srityje.

Panaudojus suoliukų erdves reikia nuvalyti 10 % natrio hipochloritu (po to steriliu vandeniu, kad būtų pašalintas baliklio likutis), 70 % etanoliu arba patvirtinta, DNR naikinančia dezaktyvuojančia priemone.Idealiu atveju turėtų būti įrengtos ultravioletinės (UV) lempos, kad būtų galima nukenksminti švitinant.Tačiau UV lempos turėtų būti naudojamos tik uždarose darbo vietose, pvz., saugos spintose, siekiant apriboti laboratorijos personalo UV poveikį.Laikykitės gamintojo nurodymų dėl UV lempos priežiūros, vėdinimo ir valymo, kad lempos išliktų veiksmingos.

Jei vietoj natrio hipochlorito naudojamas 70 % etanolis, norint užbaigti nukenksminimą, reikės švitinti UV šviesa.
Nevalykite sūkurio ir centrifuguokite natrio hipochloritu;vietoj to nuvalykite 70% etanoliu ir padėkite UV spinduliams arba naudokite komercinę DNR naikinančią dezaktyvavimo priemonę.Dėl išsiliejimo kreipkitės į gamintoją dėl tolesnių valymo patarimų.Jei gamintojo instrukcijos leidžia, pipetės turi būti reguliariai sterilizuojamos autoklave.Jei pipetės negali būti dedamos į autoklavą, jas turėtų pakakti nuvalyti 10 % natrio hipochloritu (po to kruopščiai nuvalyti steriliu vandeniu) arba komercine DNR naikinančia dezinfekavimo priemone, o po to apšviesti UV spinduliais.

Valymas didelio procento natrio hipochloritu gali sugadinti pipetės plastiką ir metalus, jei tai daroma reguliariai;pirmiausia patikrinkite gamintojo rekomendacijas.Visa įranga turi būti reguliariai kalibruojama pagal gamintojo rekomenduojamą grafiką.Paskirtas asmuo turėtų būti atsakingas už tai, kad būtų laikomasi kalibravimo grafiko, būtų tvarkomi išsamūs žurnalai ir ant įrangos būtų aiškiai rodomos priežiūros etiketės.

3. Nurodytos molekulinės erdvės naudojimo ir valymo patarimai

Išankstinis PGR: Reagento alikvotinis paskirstymas / pagrindinio mišinio paruošimas: Tai turėtų būti švariausia iš visų molekuliniams eksperimentams ruošti naudojamų erdvių ir idealiu atveju turėtų būti paskirta laminarinio srauto spinta su UV šviesa.Šioje vietoje negalima tvarkyti mėginių, ekstrahuotų nukleino rūgščių ir amplifikuotų PGR produktų.Amplifikacijos reagentai turi būti laikomi šaldiklyje (arba šaldytuve, kaip nurodyta gamintojo rekomendacijose) toje pačioje tam skirtoje vietoje, idealiu atveju šalia laminarinio srauto spintelės arba zonos prieš PGR.Pirštines reikia keisti kiekvieną kartą įeinant į prieš-PGR arba laminarinio srauto spintelę.

Prieš naudojant PGR arba laminarinio srauto spintelę reikia išvalyti prieš ir po naudojimo taip: Nuvalykite visus spintelėje esančius daiktus, pvz., pipetes, antgalių dėžutes, sūkurį, centrifugą, mėgintuvėlių stovus, rašiklius ir kt. 70 % etanoliu arba komercinio DNR naikinančio dekontaminatoriaus ir leiskite išdžiūti.Jei dirbate uždaroje zonoje, pvz., laminarinėje spintelėje, gaubtą 30 minučių palaikykite UV šviesoje.

Pastaba

Nelaikykite reagentų UV spindulių;Įdėkite juos į spintelę tik tada, kai ji bus švari.Atliekant atvirkštinės transkripcijos PGR, taip pat gali būti naudinga nuvalyti paviršius ir įrangą tirpalu, kuris susilietus suardo RNazes.Tai gali padėti išvengti klaidingai neigiamų RNR skilimo fermentų rezultatų.Po nukenksminimo ir prieš ruošiant mastermix pirštines reikia dar kartą pasikeisti, o tada spintelė yra paruošta naudoti.

Prieš PGR: nukleino rūgšties ekstrahavimas / šablono pridėjimas:

Nukleino rūgštis turi būti ekstrahuojama ir tvarkoma antroje tam skirtoje vietoje, naudojant atskirą pipečių rinkinį, filtrų antgalius, mėgintuvėlių stovus, šviežias pirštines, laboratorinius chalatus ir kitą įrangą. Ši sritis taip pat skirta šablonui, valdikliams ir tendencijų linijoms pridėti prie mastermix vamzdeliai arba plokštės.Siekiant išvengti analizuojamų ekstrahuotų nukleorūgščių mėginių užteršimo, prieš pradedant dirbti su teigiamomis kontrolėmis ar etalonais, rekomenduojama pasikeisti pirštines ir naudoti atskirą pipečių rinkinį.PGR reagentų ir amplifikuotų produktų šioje srityje negalima lašinti pipete.Mėginiai turi būti laikomi tam skirtuose šaldytuvuose arba šaldikliuose toje pačioje vietoje.Pavyzdinė darbo vieta turi būti valoma taip pat, kaip ir mastermix vieta.

Po PGR: amplifikuoto produkto amplifikacija ir tvarkymas

Ši vieta skirta procesams po amplifikacijos ir turi būti fiziškai atskirta nuo zonų prieš PGR.Paprastai jame yra termocikleriai ir realaus laiko platformos, o idealiu atveju turėtų būti laminarinio srauto spinta, skirta 1 apvaliam PGR produktui pridėti prie 2 raundo reakcijos, jei atliekama įdėta PGR.Šioje vietoje negalima tvarkyti PGR reagentų ir ekstrahuotos nukleino rūgšties, nes užteršimo rizika yra didelė.Šioje zonoje turėtų būti atskiras pirštinių, laboratorinių chalatų, plokštelių ir mėgintuvėlių lentynų, pipečių, filtrų antgalių, šiukšliadėžių ir kitos įrangos rinkinys.Prieš atidarant mėgintuvėlius reikia centrifuguoti.Pavyzdinė darbo vieta turi būti valoma taip pat, kaip ir mastermix vieta.

Po PGR: produkto analizė

Ši patalpa skirta produktų aptikimo įrangai, pvz., gelio elektroforezės bakams, maitinimo blokams, UV transiliuminatoriui ir gelio dokumentų sistemai.Šioje zonoje turėtų būti atskiri pirštinių, laboratorinių chalatų, plokštelių ir mėgintuvėlių lentynų, pipečių, filtrų antgalių, šiukšliadėžių ir kitos įrangos rinkiniai.Į šią sritį negalima įnešti jokių kitų reagentų, išskyrus įkrovimo dažus, molekulinį žymeklį ir agarozės gelį bei buferio komponentus.Pavyzdinė darbo vieta turi būti valoma taip pat, kaip ir mastermix vieta.

Svarbi pastaba

Idealiu atveju į patalpas prieš PGR negalima patekti tą pačią dieną, jei patalpose po PGR jau buvo atliktas darbas.Jei tai visiškai neišvengiama, pirmiausia pasirūpinkite, kad rankos būtų kruopščiai nuplaunamos ir patalpose būtų dėvimi specialūs laboratoriniai chalatai.Laboratorinių knygų ir dokumentų negalima nešti į patalpas prieš PGR, jei jos buvo naudojamos patalpose po PGR;jei reikia, paimkite dublikatus protokolų/pavyzdžių ID ir pan.

4. Bendrieji molekulinės biologijos patarimai

Mūvėkite pirštines be miltelių, kad išvengtumėte tyrimo slopinimo.Tinkama pipetavimo technika yra svarbiausia siekiant sumažinti užterštumą.Neteisingai pilant pipetę, išleidžiant skysčius gali išsitaškyti ir susidaryti aerozoliai.Gerą teisingo pipetavimo praktiką rasite šiose nuorodose: Gilson pipetavimo vadovas, Anachem pipetavimo technikos vaizdo įrašai, Centrifuguokite mėgintuvėlius prieš atidarydami ir atsargiai atidarykite, kad neaptaškytų.Uždarykite vamzdelius iškart po naudojimo, kad nepatektų teršalų.

Vykdydami kelias reakcijas, paruoškite vieną pagrindinį mišinį, kuriame yra įprastų reagentų (pvz., vandens, dNTP, buferio, pradmenų ir fermento), kad sumažintumėte reagentų perkėlimų skaičių ir sumažintumėte užteršimo grėsmę.Mastermix rekomenduojama statyti ant ledo arba šalto bloko.„Hot Start“ fermento naudojimas gali padėti sumažinti nespecifinių produktų gamybą.Reagentus, kuriuose yra fluorescencinių zondų, saugokite nuo šviesos, kad išvengtumėte skilimo.

5. Vidaus kontrolė

Įtraukite gerai apibūdintas, patvirtintas teigiamas ir neigiamas kontrolines medžiagas, taip pat kontrolę be šablono visose reakcijose ir kelių taškų titruotą kiekybinių reakcijų tendencijos liniją.Teigiama kontrolė neturi būti tokia stipri, kad keltų užteršimo pavojų.Ekstrahuodami nukleino rūgštis, įtraukite teigiamą ir neigiamą ekstrahavimo kontrolę.

Rekomenduojama, kad kiekvienoje srityje būtų iškabintos aiškios instrukcijos, kad naudotojai žinotų elgesio taisykles.Diagnostinės laboratorijos, aptinkančios labai žemą DNR ar RNR kiekį klinikiniuose mėginiuose, gali norėti taikyti papildomą saugumo priemonę – turėti atskiras oro apdorojimo sistemas, kuriose oro slėgis yra šiek tiek teigiamas patalpose prieš PGR ir šiek tiek neigiamas oro slėgis patalpose po PGR.

Galiausiai, naudinga parengti kokybės užtikrinimo (QA) planą.Į tokį planą turėtų būti įtraukti pagrindinių reagentų atsargų ir darbinių atsargų sąrašai, rinkinių ir reagentų laikymo taisyklės, kontrolės rezultatų ataskaitų teikimas, personalo mokymo programos, trikčių šalinimo algoritmai ir, jei reikia, taisomieji veiksmai.

6. Bibliografija

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. 3 skyrius: QPCR laboratorijos įrengimas.Rekreacinių vandenų tyrimo pagal USEPA qPCR metodą 1611 rekomendacinis dokumentas. Lansing-Michigan State University.

Visuomenės sveikata Anglijoje, NHS.JK mikrobiologijos tyrimų standartai: gera laboratorinė praktika atliekant molekulinės amplifikacijos tyrimus).Kokybės gairės.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. PGR laboratorijos įrengimas.„Cold Spring Harb“ protokolas.2007;7.

Schroeder S 2013. Eilinė centrifugų priežiūra: centrifugų, rotorių ir adapterių valymas, priežiūra ir dezinfekavimas (Baltasis popierius Nr. 14).Hamburgas: Eppendorfas;2013 m.

Viana RV, Wallis CL.Geroji klinikinė laboratorinė praktika (GCLP), skirta molekuliniams tyrimams, naudojamiems diagnostikos laboratorijose, In: Akyar I, redaktorius.Platus kokybės kontrolės spektras.Rijeka, Kroatija: Intech;2011: 29–52.