Molekulare Detektiounsmethoden hunn d'Fäegkeet e grousse Volumen vun Nukleinsäure ze produzéieren duerch d'Verstäerkung vu Spuerquantitéiten, déi a Proben fonnt goufen.Och wann dëst gutt ass fir sensibel Detektioun z'erméiglechen, féiert et och d'Méiglechkeet vu Kontaminatioun duerch d'Verbreedung vun Amplifikatioun Aerosolen am Laboratoire.Wann Dir Experimenter ausféiert, kënne Moossname getraff ginn fir d'Kontaminatioun vu Reagenser, Laborausrüstung a Bänkraum ze vermeiden, well sou eng Kontaminatioun falsch-positiv (oder falsch-negativ) Resultater generéiere kann.

Fir d'Wahrscheinlechkeet vu Kontaminatioun ze reduzéieren, sollt Good Laboratory Practice zu all Moment ausgeübt ginn.Speziell musse Virsiichtsmoossname betreffend déi folgend Punkte geholl ginn:

1. Ëmgank reagents
2. Organisatioun vun Aarbechtsberäich an Equipementer
3. Benotzt a Botzen Rotschléi fir den designéierte molekulare Raum
4. Allgemeng molekulare Biologie Rotschléi
5. Intern Kontrollen
6. Bibliographie

1. Ëmgank reagents

Zentrifuge Reagensröhre kuerz virum Ouverture fir d'Generatioun vun Aerosolen ze vermeiden.Aliquot Reagenz fir multiple Afréiere-Thaws an d'Kontaminatioun vu Masteraktien ze vermeiden.Däitlech markéieren an datéieren all Reagens- a Reaktiounsröhren an erhalen Logbicher vu Reagenslot a Batchnummeren déi an all Experimenter benotzt ginn.Pipette all Reagenzen a Proben mat Filtertipps.Virum Kaf ass et unzeroden mam Hiersteller ze bestätegen datt d'Filterspëtze passend sinn fir d'Mark vun der Pipette ze benotzen.

2. Organisatioun vun Aarbechtsberäich an Equipementer

D'Aarbechtsberäich soll organiséiert ginn fir sécherzestellen datt de Floss vun der Aarbecht an enger Richtung geschitt, vu proppere Beräicher (Pre-PCR) bis dreckeg Beräicher (Post-PCR).Déi folgend allgemeng Virsiichtsmoossnamen hëllefen d'Chance vu Kontaminatioun ze reduzéieren.Hutt separat designéierte Raim, oder op d'mannst kierperlech getrennte Beräicher, fir: Mastermix Virbereedung, Nukleinsäure Extraktioun an DNA Schabloun Zousatz, Verstäerkung an Ëmgank mat amplifizéiert Produkt, a Produktanalyse, zB Gelelektrophorese.

A verschiddenen Astellungen ass et schwéier 4 separat Zëmmer ze hunn.Eng méiglech awer manner wënschenswäert Optioun ass d'Mastermix Virbereedung an engem Behälterberäich ze maachen, zB e laminar Flowkabinett.Am Fall vun nested PCR Amplifikatioun, soll d'Virbereedung vun der Mastermix fir d'zweet Ronn Reaktioun am "propper" Beräich fir Mastermix Virbereedung virbereet ginn, mä d'Inokulatioun mat der Primärschoul PCR Produit soll am amplification Sall gemaach ginn, a wa méiglech. an engem dedizéierten Behälterberäich (zB e laminare Stroumkabinett).

All Sall / Beräich brauch eng separat Formatioun vun kloer markéiert Pipetten, Filter Tipps, Rouer Racken, Wirbelen, Zentrifugen (wann relevant), Stëfter, generesch Labo reagents, Labo Mäntel a Këschte vun Händschen déi op hir jeeweileg Aarbechtsstatiounen bleiwen.D'Hänn musse gewäsch ginn an d'Handschuesch a Labo-Mäntel geännert ginn wann Dir tëscht den designéierte Beräicher bewegt.Reagenser an Ausrüstung sollten net vun engem dreckeg Gebitt op e proppert Gebitt geplënnert ginn.Sollt en Extremfall entstoen, wou e Reagens oder Ausrüstungsstéck no hanne geplënnert muss ginn, muss et als éischt mat 10% Natriumhypochlorit dekontaminéiert ginn, gefollegt vun engem Ofwëschen mat sterilem Waasser.

Note

D'10% Natriumhypochlorit Léisung muss all Dag frësch gemaach ginn.Wann d'Dekontaminatioun benotzt gëtt, sollt eng Minimum Kontaktzäit vun 10 Minutten agehale ginn.
Alternativ kënne kommerziell verfügbare Produkter, déi als DNA-zerstéierende Uewerflächendekontaminanten validéiert sinn, benotzt ginn wann lokal Sécherheetsempfehlungen d'Benotzung vun Natriumhypochlorit net erlaben oder wann Natriumhypochlorit net gëeegent ass fir d'metallesch Deeler vun Ausrüstung ze dekontaminéieren.

Idealerweis sollten d'Personal sech un den unidirektionalen Aarbechtsfloss Ethos halen an net de selwechten Dag vun dreckeg Gebidder (Post-PCR) zréck an propper Gebidder (Pre-PCR) goen.Wéi och ëmmer, et kënnen Occasiounen sinn wann dëst onvermeidlech ass.Wann esou Geleeënheet entsteet, muss d'Personal oppassen fir d'Hänn grëndlech ze wäschen, d'Handschuesch z'änneren, den designéierte Labo-Mantel ze benotzen an keng Ausrüstung aféieren, déi se erëm aus dem Sall wëllen huelen, wéi Labobicher.Esou Kontrollmoossname sollen an der Ausbildung vum Personal iwwer molekulare Methoden ënnerstrach ginn.

Nom Gebrauch sollten d'Bänkplaze mat 10% Natriumhypochlorit gebotzt ginn (gefollegt vu sterile Waasser fir Reschtbleicher ze läschen), 70% Ethanol oder e validéierte kommerziell verfügbaren DNA-zerstéierende Dekontaminant.Idealerweis sollten ultraviolet (UV) Luuchte montéiert ginn fir Dekontaminatioun duerch Bestrahlung z'erméiglechen.Wéi och ëmmer, d'Benotzung vun UV-Lampen soll op zouenen Aarbechtsberäicher, zB Sécherheetsschränke beschränkt ginn, fir d'UV-Beliichtung vum Laboratoire ze limitéieren.W.e.g. befollegt d'Instruktioune vum Hiersteller fir UV-Lampefleeg, Belëftung a Botzen fir sécherzestellen datt d'Lampen effektiv bleiwen.

Wann Dir 70% Ethanol benotzt anstatt Natriumhypochlorit, gëtt d'Bestrahlung mat UV-Liicht gebraucht fir d'Dekontaminatioun ze kompletéieren.
Botzen net de Wirbel an Zentrifuge mat Natriumhypochlorit;amplaz, wëschen mat 70% Ethanol an UV Luucht ausgesat, oder benotzen eng kommerziell DNA-zerstéierende decontaminant.Fir Spills, kontrolléiert mam Hiersteller fir weider Botzenberodung.Wann d'Instruktioune vum Hiersteller et erlaben, sollten Pipette routinéiert duerch Autoklav steriliséiert ginn.Wann Pipette net autoklavéiert kënne ginn, sollt et duergoen, se mat 10% Natriumhypochlorit ze botzen (gefollegt vun enger grëndlecher Wëschung mat sterilem Waasser) oder mat engem kommerziellen DNA-zerstéierende Dekontaminant gefollegt vun UV-Beliichtung.

Botzen mat héije Prozentsaz Natriumhypochlorit kann eventuell Pipetteplastik a Metalle beschiedegen wann se regelméisseg gemaach ginn;kontrolléieren Recommandatiounen vum Hiersteller éischt.All Ausrüstung muss regelméisseg no dem Hiersteller recommandéiert Zäitplang kalibréiert ginn.Eng designéiert Persoun soll verantwortlech sinn fir sécherzestellen datt de Kalibratiounsplang agehale gëtt, detailléiert Logbicher gehale ginn, an d'Serviceetiketten kloer op Ausrüstung ugewise ginn.

3. Benotzt a Botzen Rotschléi fir den designéierte molekulare Raum

Pre-PCR: Reagent aliquoting / mastermix Virbereedung: Dëst soll déi propperst vun alle Plazen sinn, déi fir d'Virbereedung vu molekulare Experimenter benotzt ginn, a sollt am Idealfall en designéierte laminar Flowkabinett sinn, deen mat engem UV Liicht ausgestatt ass.Echantillon, extrahéiert Nukleinsäure an amplifizéiert PCR Produkter däerfen net an dësem Beräich gehandhabt ginn.Amplification reagents sollen an engem Frigo (oder Frigo, wéi pro Fabrikant beschwéiert Recommandatiounen) am selwechten designéierte Raum gehal ginn, Idealfall nieft der laminar Flux Cabinet oder Pre-PCR Beräich.Handschuesch sollen all Kéier geännert ginn wann Dir an de Pre-PCR Beräich oder am Laminar Flow Cabinet gitt.

De Pre-PCR Beräich oder de laminar Flow Cabinet soll virum an no der Benotzung wéi follegt gebotzt ginn: Wischt all Elementer am Cabinet, zB Pipetten, Tippkëschten, Wirbel, Zentrifuge, Rouerrack, Stëfter, asw mat 70% Ethanol oder engem kommerziell DNA-zerstéierende decontaminant, an dréchen loossen.Am Fall vun engem zouenen Aarbechtsberäich, zB e laminarer Flowkabinett, setzt d'Kapitel fir 30 Minutten UV-Liicht aus.

Note

Reagens net op UV Liicht aussetzen;réckelen se nëmmen an de Cabinet eemol et propper ass.Wann Dir ëmgedréint Transkriptioun PCR ausféiert, kann et och hëllefräich sinn Flächen an Ausrüstung mat enger Léisung ze wëschen déi RNases beim Kontakt brécht.Dëst kann hëllefe fir falsch negativ Resultater vun der Enzymdegradatioun vun RNA ze vermeiden.No der Dekontaminatioun a virun der Virbereedung vun der Mastermix, sollten d'Handschuesch nach eng Kéier geännert ginn, an dann ass de Cabinet prett fir ze benotzen.

Pre-PCR: Nukleinsäure Extraktioun / Schabloun Additioun:

D'Nukleinsäure muss extrahéiert a gehandhabt ginn an engem zweeten designéierte Gebitt, mat engem separaten Set vu Pipetten, Filterspëtzen, Röhreracken, frësche Handschuesch, Labomantel an aner Ausrüstung. Mastermix Réier oder Placken.Fir Kontaminatioun vun den extrahéierten Nukleinsäureproben ze vermeiden, déi analyséiert ginn, ass et recommandéiert Handschuesch z'änneren ier Dir positiv Kontrollen oder Normen behandelt an eng separat Set vu Pipette benotzen.PCR-Reagenser an amplifizéiert Produkter däerfen net an dësem Beräich pipettet ginn.Echantillon sollen an designéierte Frigoen oder Frigoen an der selwechter Géigend gespäichert ginn.De Probe-Aarbechtsberäich soll op déiselwecht Manéier gebotzt ginn wéi de Mastermix-Raum.

Post-PCR: Amplifikatioun an Handhabung vum verstäerkte Produkt

Dëse designéierte Raum ass fir Post-Amplifikatiounsprozesser a soll kierperlech getrennt vun de Pre-PCR Beräicher sinn.Et enthält normalerweis Thermocycler an Echtzäitplattformen, an am Idealfall sollt et e laminar Flowkabinett hunn fir de Ronn 1 PCR Produkt op d'Ronn 2 Reaktioun ze addéieren, wann nestéiert PCR gemaach gëtt.PCR Reagenzen an extrahéiert Nukleinsäure däerfen net an dësem Beräich gehandhabt ginn, well de Risiko vu Kontaminatioun héich ass.Dëse Beräich sollt e separaten Set vu Handschuesch, Labo-Mäntel, Plack- a Röhrerack, Pipetten, Filterspëtzen, Poubellen an aner Ausrüstung hunn.D'Tubes mussen centrifugéiert ginn ier se opgemaach ginn.De Probe-Aarbechtsberäich soll op déiselwecht Manéier gebotzt ginn wéi de Mastermix-Raum.

Post-PCR: Produktanalyse

Dëse Raum ass fir Produktdetektiounsausrüstung, zB Gel Elektrophorese Panzer, Power Packs, UV Transilluminator an de Gel Dokumentatiounssystem.Dëse Beräich soll getrennte Sätz vu Handschuesch, Labo-Mäntel, Plack- a Röhrerack, Pipetten, Filterspëtzen, Poubellen an aner Ausrüstung hunn.Keng aner Reagenz kënnen an dësem Beräich bruecht ginn, ausser Luedefaarf, molekulare Marker an Agarosegel, a Pufferkomponenten.De Probe-Aarbechtsberäich soll op déiselwecht Manéier gebotzt ginn wéi de Mastermix-Raum.

Wichteg Notiz

Idealerweis sollten d'Pre-PCR Zëmmeren net de selwechten Dag aginn ginn, wann d'Aarbechte schonn an de Post-PCR-Raim gemaach goufen.Wann dëst komplett onvermeidlech ass, gitt sécher datt d'Hänn fir d'éischt grëndlech gewäsch ginn an datt spezifesch Labo-Mäntel an de Raim gedroe ginn.Labo Bicher a Pabeieren däerfen net an d'Pre-PCR Zëmmer geholl ginn wa se an de Post-PCR Zëmmer benotzt goufen;wann néideg, huelt duplizéiert Ausdréck vu Protokoller / Probe IDen, etc.

4. Allgemeng molekulare Biologie Rotschléi

Benotzt pulverfräi Handschuesch fir Assay Hemmung ze vermeiden.Korrekt Pipettetechnik ass wichteg fir d'Kontaminatioun ze reduzéieren.Falsch Pipette kann zu Spritzen resultéieren wann Dir Flëssegkeete verdeelt an d'Schafung vun Aerosolen.Gutt Praxis fir richteg Pipettéierung kann op de folgende Linken fonnt ginn: Gilson Guide fir Pipettéierung, Anachem Pipettéierungstechnik Videoen, Zentrifuge-Réier virun der Ouverture, a maach se virsiichteg op fir Spritzen ze vermeiden.D'Tube direkt nom Gebrauch zoumaachen fir d'Aféierung vu Verschmotzungen ze vermeiden.

Wann Dir verschidde Reaktiounen ausféiert, preparéiert eng Mastermix mat gemeinsame Reagenser (zB Waasser, dNTPs, Puffer, Primer an Enzym) fir d'Zuel vun de Reagenstransferen ze minimiséieren an d'Drohung vu Kontaminatioun ze reduzéieren.Et ass recommandéiert de Mastermix op Äis oder e kale Block opzestellen.D'Benotzung vun engem Hot Start Enzym kann hëllefen d'Produktioun vun net spezifesche Produkter ze reduzéieren.Schützt d'Reagenser déi fluoreszent Sonden aus Liicht enthalen fir Degradatioun ze vermeiden.

5. Intern Kontrollen

Gitt gutt charakteriséiert, bestätegt positiv an negativ Kontrollen, zesumme mat enger No-Schabloun Kontroll an all Reaktiounen, an eng Multi-Punkt titréiert Trendline fir quantitativ Reaktiounen.Déi positiv Kontroll sollt net sou staark sinn datt et e Kontaminatiounsrisiko duerstellt.Gitt positiv an negativ Extraktiounskontrolle bei der Ausféierung vun Nukleinsäure Extraktioun.

Et ass recommandéiert datt kloer Instruktiounen an all de Beräicher gepost ginn, sou datt d'Benotzer sech iwwer d'Behuelenregele bewosst sinn.Diagnostesch Laboratoiren, déi ganz niddereg Niveauen vun DNA oder RNA a klineschen Echantillon erkennen, wëllen eventuell déi zousätzlech Sécherheetsmoossname adoptéieren fir getrennte Loftbehandlungssystemer mat liicht positive Loftdrock an de Pre-PCR Zëmmeren a liicht negativen Loftdrock an de Post-PCR Zëmmeren ze hunn.

Schlussendlech ass d'Entwécklung vun engem Qualitéitssécherungsplang (QA) hëllefräich.Esou e Plang soll Lëschte vu Reagensmasteraktien an Aarbechtsaktien enthalen, Regele fir d'Späichere vu Kits a Reagenzen, Berichterstattung vu Kontrollresultater, Personal Trainingsprogrammer, Probleemerléisung Algorithmen, a Remediesaktiounen wann néideg.

6. Bibliographie

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kapitel 3: Astelle vun engem qPCR Laboratoire.Eng Orientatioun Dokument fir Tester Fräizäit- Waasser benotzt USEPA qPCR Method 1611. Lansing- Michigan State University.

Ëffentlech Gesondheet England, NHS.UK Standards fir Mikrobiologie Ermëttlungen: Good Laboratory Practice wann Dir molekulare Amplifikatiounsanalysen ausféiert.Qualitéit Orientatioun.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Opbau vun engem PCR Labo.Kale Fréijoer Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Routine Ënnerhalt vun Zentrifugen: Botzen, Ënnerhalt an Desinfektioun vun Zentrifugen, Rotoren an Adapter (Wäissbuch Nr. 14).Hamburg: Eppenduerf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) fir molekulare baséiert Tester an diagnostesch Laboratoiren benotzt, In: Akyar I, Redakter.Breet Spektrum vu Qualitéitskontroll.Rijeka, Kroatien: Intech;2011: 29-52.