Молекулярдык аныктоо ыкмалары үлгүлөрдөн табылган изи өлчөмдөрүн күчөтүү аркылуу нуклеин кислотасынын чоң көлөмүн өндүрүү мүмкүнчүлүгүнө ээ.Бул сезгич аныктоону камсыз кылуу үчүн пайдалуу болгону менен, лабораториялык чөйрөдө күчөтүү аэрозолдорунун жайылышы аркылуу булгануу мүмкүнчүлүгүн киргизет.Эксперименттерди жүргүзүүдө реагенттердин, лабораториялык жабдуулардын жана отургучтун мейкиндигинин булганышын болтурбоо үчүн чараларды көрүүгө болот, анткени мындай булгануу жалган-оң (же жалган-терс) натыйжаларды жаратышы мүмкүн.

Булгануу ыктымалдыгын азайтууга жардам берүү үчүн, жакшы лабораториялык практика ар дайым аткарылышы керек.Тактап айтканда, төмөнкү пункттарга карата сактык чаралары көрүлүшү керек:

1. Реагенттер менен иштөө
2. Жумушчу жайды жана жабдууларды уюштуруу
3. Белгиленген молекулярдык мейкиндикти колдонуу жана тазалоо кеңеши
4. Жалпы молекулярдык биология боюнча кеңеш
5. Ички контроль
6. Библиография

1. Реагенттер менен иштөө

Аэрозолдордун пайда болушуна жол бербөө үчүн реагент түтүктөрүн ачуунун алдында кыскача центрифугалаңыз.Бир нече тоңуп эрүүлөрдү жана негизги запастардын булганышын болтурбоо үчүн реагенттерди аликвот.Бардык реагенттерди жана реакция түтүктөрүн так белгилеп, датасын жазыңыз жана бардык эксперименттерде колдонулган реагенттин лотунун жана сериясынын номерлеринин журналдарын жүргүзүңүз.Бардык реагенттерди жана үлгүлөрдү чыпкалардын учтары менен пипетка менен сүртүңүз.Сатып алуудан мурун, чыпкалардын учтары колдонула турган пипетка брендине туура келерин өндүрүүчү менен ырастоо сунушталат.

2. Жумушчу жайды жана жабдууларды уюштуруу

Жумуштун агымы таза жерлерден (ПЦРге чейинки) кир жерлерге (ПЦРдан кийинки) бир багытта болушун камсыздоо үчүн жумушчу мейкиндигин уюштуруу керек.Төмөнкү жалпы сактык чаралар булгануу мүмкүнчүлүгүн азайтууга жардам берет.Төмөнкүлөр үчүн өзүнчө бөлүнгөн бөлмөлөр, же жок дегенде физикалык жактан өзүнчө зоналар болушу керек: мастер-микс даярдоо, нуклеин кислотасын экстракциялоо жана ДНК шаблонун кошуу, күчөтүлгөн продуктуну күчөтүү жана иштетүү, ошондой эле продукт анализи, мисалы, гел электрофорези.

Кээ бир шарттарда 4 өзүнчө бөлмөгө ээ болуу кыйынга турат.Мүмкүн болгон, бирок анча каалабаган вариант болуп мастер-миксти камтуу зонасында, мисалы, ламинардык агымдык шкафта даярдоо саналат.Уюшкан ПТР күчөтүлгөн учурда, экинчи раунд реакциясы үчүн мастер-микс даярдоо мастер-микс даярдоо үчүн "таза" зонада даярдалышы керек, бирок ПТРдин баштапкы продуктусу менен эмдөө күчөтүү бөлмөсүндө, жана мүмкүн болсо, жасалышы керек. атайын тосмо зонасында (мисалы, ламинардык агым шкафы).

Ар бир бөлмөгө/аймакка так белгиленген пипеткалардын, чыпкалардын учтарынын, түтүк текчелеринин, вортекстердин, центрифугалардын (эгер тиешелүү болсо), калемдердин, жалпы лабораториялык реагенттердин, лабораториялык халаттардын жана кол каптардын кутуларынын өзүнчө топтому керек, алар тиешелүү жумушчу станцияларында калат.Белгиленген аймактардын ортосунда жүрүүдө колду жууп, кол каптарды жана лабораториялык халаттарды алмаштыруу керек.Реактивдерди жана жабдууларды кир жерден таза жерге жылдырбоо керек.Эгерде реагентти же жабдууну артка жылдыруу керек болгон экстремалдуу жагдай келип чыкса, аны адегенде 10% натрий гипохлорити менен зыянсыздандыруу керек, андан кийин стерилдүү суу менен сүртүү керек.

Эскертүү

10% натрий гипохлорит эритмеси күн сайын жаңы даярдалышы керек.Дезактивациялоо үчүн колдонулганда, 10 мүнөттөн кем эмес байланыш убактысын сактоо керек.
Же болбосо, эгерде жергиликтүү коопсуздук боюнча сунуштар натрий гипохлоритин колдонууга жол бербесе же натрий гипохлорити жабдуулардын металлдык бөлүктөрүн зыянсыздандырууга ылайыксыз болсо, ДНКны жок кылуучу беттик деконтаминанттар катары тастыкталган коммерциялык жеткиликтүү продуктуларды колдонсо болот.

Идеалында, кызматкерлер бир багыттуу иш агымынын этикасына баш ийиши керек жана ошол эле күнү ыплас жерлерден (ПЦРдан кийинки) кайра таза жерлерге (ПЦР чейинки) барбашы керек.Бирок, бул сөзсүз түрдө болушу мүмкүн.Мындай жагдай пайда болгондо, кызматкерлер колду жакшылап жууп, кол капты алмаштырууга, атайын лабораториялык халатты колдонууга жана бөлмөдөн кайра чыгаргысы келген жабдууларды, мисалы, лабораториялык китептерди киргизбөөгө кам көрүшү керек.Мындай контролдук чараларга кызматкерлерди молекулярдык методдор боюнча окутууда басым жасоо керек.

Колдонгондон кийин отургучтар 10% натрий гипохлорит (андан кийин стерилдүү суу менен калдык агартуучу затты кетирүү), 70% этанол же валидацияланган коммерциялык ДНКны жок кылуучу деконтаминант менен тазаланышы керек.Идеалында, нурлануу жолу менен зыянсыздандырууну камсыз кылуу үчүн ультра кызгылт (УК) лампалар орнотулушу керек.Бирок, лаборатория кызматкерлеринин UV таасирин чектөө үчүн UV лампаларын колдонуу жабык жумушчу аймактарда, мисалы, коопсуздук шкафтарында гана колдонулушу керек.Сураныч, лампалардын эффективдүү болушун камсыз кылуу үчүн UV лампаларына кам көрүү, желдетүү жана тазалоо боюнча өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүн аткарыңыз.

Эгерде натрий гипохлоритинин ордуна 70% этанол колдонулса, зыянсыздандырууну аяктоо үчүн УК нурлары менен нурлануу керек болот.
Натрий гипохлорити менен центрифуганы жана центрифуганы тазалоого болбойт;анын ордуна 70% этанол менен сүртүп, UV нуруна дуушар кылыңыз же коммерциялык ДНКны жок кылуучу деконтаминатты колдонуңуз.Төкмөлөр болсо, тазалоо боюнча кошумча кеңеш алуу үчүн өндүрүүчүгө кайрылыңыз.Өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрү уруксат берсе, пипеткалар автоклавда дайыма стерилдениши керек.Эгерде пипеткаларды автоклавга салуу мүмкүн болбосо, аларды 10% натрий гипохлорити менен (андан кийин стерилденген суу менен жакшылап сүртүп) же коммерциялык ДНКны жок кылуучу деконтаминант менен, андан кийин УФ таасири менен тазалоо жетиштүү.

Жогорку пайыздык натрий гипохлорити менен тазалоо такай жүргүзүлсө, акыры пипеткадагы пластмассаларга жана металлдарга зыян келтириши мүмкүн;адегенде өндүрүүчүнүн сунуштарын текшериңиз.Бардык жабдуулар өндүрүүчү сунуш кылган графикке ылайык дайыма калибрлөө керек.Белгиленген адам калибрлөө графигинин сакталышын, деталдуу журналдардын жүргүзүлүшүн жана жабдууларда тейлөө этикеткаларынын так көрсөтүлүшүн камсыз кылуу үчүн жооптуу болушу керек.

3. Белгиленген молекулярдык мейкиндикти колдонуу жана тазалоо кеңеши

Алдын ала ПЧР: Реагент аликводоштуруу / мастер-микс даярдоо: Бул молекулярдык эксперименттерди даярдоо үчүн колдонулган бардык боштуктардын эң тазасы болушу керек жана идеалдуу түрдө UV жарыгы менен жабдылган атайын ламинарлык агым шкафы болушу керек.Үлгүлөр, экстракцияланган нуклеин кислотасы жана күчөтүлгөн ПТР продуктулары бул аймакта иштебеши керек.Күчөтүү реагенттери тоңдургучта (же муздаткычта, өндүрүүчүнүн сунуштарына ылайык) ошол эле белгиленген мейкиндикте, идеалдуу түрдө ламинардык агымдын шкафынын же ПТР алдындагы аймактын жанында сакталышы керек.Кол каптарды ПТРге чейинки аймакка же ламинардык агым шкафына кирген сайын алмаштыруу керек.

ПТРге чейинки аймакты же ламинардык агымдын шкафын колдонуудан мурун жана кийин төмөнкүдөй тазалоо керек: Кабинеттеги бардык нерселерди, мисалы пипеткалар, учу кутучалар, вортекс, центрифуга, түтүк текчелери, калемдер ж.б. 70% этанол менен сүртүңүз. коммерциялык ДНКны жок кылуучу деконтаминант жана кургатуу үчүн.Жабык жумушчу зонасы болгон учурда, мисалы, ламинардык агымдык шкаф, капотту 30 мүнөткө UV нуру астында калтырыңыз.

Эскертүү

реагенттерди ультрафиолет нурунун таасирине тийгизбеңиз;таза болгондон кийин гана аларды кабинетке жылдырыңыз.Эгерде тескери транскрипциялуу ПТР жүргүзүлсө, беттерди жана жабдууларды контактта РНаздарды ажыратуучу эритме менен сүртүү да пайдалуу болушу мүмкүн.Бул РНКнын ферменттеринин деградациясынын жалган-терс натыйжаларынан качууга жардам берет.Дезактивациядан кийин жана мастермиксти даярдоонун алдында кол каптарды дагы бир жолу алмаштыруу керек, андан кийин шкаф колдонууга даяр.

Алдын ала ПТР: Нуклеин кислотасын экстракциялоо/ шаблонду кошуу:

Нуклеин кислотасы өзүнчө пипеткаларды, фильтр учтарын, түтүк текчелерин, жаңы колкаптарды, лабораториялык халаттарды жана башка жабдууларды колдонуу менен экинчи белгиленген аймакта алынышы жана иштетилиши керек. мастермикс түтүктөр же плиталар.Алынган нуклеин кислотасынын анализденип жаткан үлгүлөрүнүн булганышын болтурбоо үчүн, позитивдүү башкаруу элементтерин же стандарттарды колдонуудан мурун кол каптарды алмаштыруу жана пипеткалардын өзүнчө топтомун колдонуу сунушталат.ПЦР реагенттерин жана күчөтүлгөн продуктуларды бул аймакка пипетка салууга болбойт.Үлгүлөр ошол эле аймакта атайын муздаткычтарда же тоңдургучтарда сакталышы керек.Үлгү иш мейкиндиги мастермикс мейкиндиги сыяктуу тазаланышы керек.

Пост-ПЧР: күчөтүлгөн продуктуну күчөтүү жана иштетүү

Бул белгиленген мейкиндик пост-күчтүү процесстер үчүн жана ПТРге чейинки аймактардан физикалык жактан өзүнчө болушу керек.Ал, адатта, термоциклерлерди жана реалдуу убакыт платформаларын камтыйт жана идеалдуу түрдө 1-турдагы ПТР продуктуну 2-раунддагы реакцияга кошуу үчүн ламинардык агымдык шкаф болушу керек, эгерде уяланган ПТР жүргүзүлүп жатса.Бул зонада ПЦР реагенттери жана экстракцияланган нуклеин кислотасы менен иштөөгө болбойт, анткени булгануу коркунучу жогору.Бул зонада мээлейлердин, лабораториялык халаттардын, табак жана түтүк текчелеринин, пипеткалардын, чыпкалардын учтары, урналар жана башка жабдуулардын өзүнчө топтому болушу керек.Түтүктөрдү ачуунун алдында центрифугалоо керек.Үлгү иш мейкиндиги мастермикс мейкиндиги сыяктуу тазаланышы керек.

Пост-ПТР: Продукцияны талдоо

Бул бөлмө өнүмдөрдү аныктоочу жабдуулар үчүн, мисалы, гель электрофорез цистерналары, кубат топтомдору, UV трансиллюминатору жана гелдик документация системасы.Бул зонада кол каптардын, лабораториялык халаттардын, табак жана түтүк текчелеринин, пипеткалардын, чыпкалардын учтары, урналар жана башка жабдуулардын өзүнчө топтому болушу керек.Бул аймакка жүктөөчү боёкту, молекулярдык маркерди жана агароздук гелди жана буфердик компоненттерди кошпогондо, башка реагенттерди алып келүүгө болбойт.Үлгү иш мейкиндиги мастермикс мейкиндиги сыяктуу тазаланышы керек.

Маанилүү эскертүү

Идеалында, эгерде ПТРдан кийинки бөлмөлөрдө иштер аткарылган болсо, ПТРге чейинки бөлмөлөргө ошол эле күнү кирүүгө болбойт.Эгер бул таптакыр болтурбай турган болсо, анда колду адегенде жакшылап жууп, бөлмөлөрдө атайын лабораториялык кийимдерди кийүүнү камсыз кылыңыз.Лабораториялык китептерди жана иш кагаздарын, эгерде алар ПТРдан кийинки бөлмөлөрдө колдонулган болсо, ПТРга чейинки бөлмөлөргө кирүүгө болбойт;зарыл болсо, протоколдордун/үлгү идентификаторлордун көчүрмөлөрүн басып чыгарыңыз ж.б.

4. Жалпы молекулярдык биология боюнча кеңеш

Анализге бөгөт коюуну болтурбоо үчүн порошоксуз кол каптарды колдонуңуз.Пиптингди туура колдонуу булганууну азайтуу үчүн маанилүү.Туура эмес пиптинг суюктуктарды чыгарууда чачыратууга жана аэрозолдордун пайда болушуна алып келиши мүмкүн.Туура пиптинг боюнча жакшы тажрыйбаны төмөнкү шилтемелерден тапса болот: Гилсон пиптинг боюнча колдонмо, Anachem пиптинг техникасынын видеолору, Түтүктөрдү ачуудан мурун центрифугалап, чачыратып жибербөө үчүн аларды кылдаттык менен ачыңыз.Колдонгондон кийин булгоочу заттардын киришине жол бербөө үчүн түтүктөрдү дароо жабыңыз.

Бир нече реакцияларды жүргүзүүдө реагенттин өтүү санын азайтуу жана булгануу коркунучун азайтуу үчүн жалпы реагенттерди (мисалы, суу, dNTPs, буфер, праймер жана фермент) камтыган бир мастер-микс даярдаңыз.Мастермиксти музга же муздак блокко коюу сунушталат.Hot Start ферментин колдонуу спецификалык эмес продукциянын өндүрүшүн азайтууга жардам берет.Флуоресценттүү зонддорду камтыган реагенттерди деградацияга жол бербөө үчүн жарыктан коргоңуз.

5. Ички контроль

Жакшы мүнөздөлгөн, ырасталган оң жана терс башкарууларды, ошондой эле бардык реакцияларда шаблонсуз башкарууну жана сандык реакциялар үчүн көп чекиттүү титрленген тренд сызыгын камтыңыз.Оң көзөмөл булгануу коркунучун туудургандай күчтүү болбошу керек.Нуклеин кислотасын экстракциялоодо оң жана терс экстракцияны көзөмөлдөөнү камтуу.

Колдонуучулар жүрүм-турум эрежелерин билиши үчүн ар бир аймактарда так нускамаларды жайгаштыруу сунушталат.Клиникалык үлгүлөрдөгү ДНКнын же РНКнын өтө төмөн деңгээлин аныктаган диагностикалык лабораториялар ПТРге чейинки бөлмөлөрдө бир аз оң аба басымы жана ПТРдан кийинки бөлмөлөрдө бир аз терс аба басымы бар өзүнчө абаны иштетүү тутумдарына ээ болуу үчүн кошумча коопсуздук чарасын кабыл алышы мүмкүн.

Акырында, сапатты камсыздоо (QA) планын иштеп чыгуу пайдалуу.Мындай план реагенттин негизги запастарынын жана жумушчу запастарынын тизмелерин, комплекттерди жана реагенттерди сактоо эрежелерин, контролдун натыйжалары жөнүндө отчетту, кызматкерлерди окутуу программаларын, бузулууларды аныктоо алгоритмдерин жана зарыл болгон учурда оңдоо иш-аракеттерин камтышы керек.

6. Библиография

Аслан А, Кинзелман Дж, Дрелин Е, Ананьева Т, Лавандер Дж. 3-бөлүм: qPCR лабораториясын орнотуу.USEPA qPCR ыкмасын колдонуу менен рекреациялык сууларды сыноо үчүн колдонмо документ 1611. Lansing-Michigan State University.

Коомдук саламаттыкты сактоо Англия, NHS.Улуу Британиянын микробиология изилдөөлөрүнүн стандарттары: Молекулярдык күчөтүү анализдерин жүргүзүүдө жакшы лабораториялык практика).Сапаттуу жетекчилик.2013;4(4):1–15.

Миффлин Т. ПЦР лабораториясын түзүү.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Центрифугаларды күнүмдүк тейлөө: центрифугаларды, роторлорду жана адаптерлерди тазалоо, тейлөө жана дезинфекциялоо (Ак кагаз №14).Гамбург: Эппендорф;2013.

Viana RV, Wallis CL.Диагностикалык лабораторияларда колдонулган молекулярдык тесттер үчүн жакшы клиникалык лабораториялык практика (GCLP), In: Akyar I, редактор.Сапатты башкаруунун кеңири спектри.Риека, Хорватия: Intech;2011: 29–52.