Rêbazên vedîtina molekulî xwedan şiyana hilberîna jimarek mezin a asîda nukleîk e bi navgîniya zêdekirina hejmarên şopî yên ku di nimûneyan de têne dîtin.Digel ku ev ji bo çalakkirina tespîta hesas sûdmend e, ew di heman demê de bi belavkirina aerosolên amplifikasyonê di hawîrdora laboratîfê de îhtîmala gemarbûnê jî destnîşan dike.Dema ku ceribandinan têne kirin, tedbîr dikarin bêne girtin da ku ji pîsbûna reagent, alavên laboratîf û cîhê rûnkê dûr bikevin, ji ber ku ev gemarî dibe ku encamên derewîn-erênî (an derew-neyînî) çêbike.

Ji bo kêmkirina îhtîmala gemarê, divê Pratîka Laboratûwarî ya Baş her dem were xebitandin.Bi taybetî, divê di derheqê xalên jêrîn de tedbîr bêne girtin:

1. Handling reagents
2. Rêxistinkirina cîhê kar û amûran
3. Ji bo cîhê molekularê destnîşankirî şîreta bikar anîn û paqijkirinê
4. Şîreta biyolojiya molekulî ya giştî
5. Kontrolên navxweyî
6. Bîbliyografî

1. Handling reagents

Berî vekirina lûleyên reagentê bi kurtî santrîfuj bikin da ku ji hilberîna aerosolan dûr bikevin.Reagentên Aliquot ji bo ku ji gelek cemidî-germbûn û pîsbûna stokên sereke dûr bikevin.Hemî lûleyên reagent û reaksiyonê bi zelalî etîket bikin û tarîxê bikin û tomarên hejmarên reagentê yên pir û batchê yên ku di hemî ceribandinan de têne bikar anîn biparêzin.Hemî reagent û nimûneyan bi karanîna serişteyên parzûnê bi pîpet bikin.Berî kirînê, tê pêşniyar kirin ku bi hilberîner re piştrast bikin ku serişteyên parzûnê li gorî marqeya pipetê ya ku tê bikar anîn e.

2. Rêxistinkirina cîhê kar û amûran

Divê cîhê xebatê were organîze kirin da ku pê ewle bibe ku herikîna kar di yek alî de pêk tê, ji deverên paqij (pre-PCR) heya deverên qirêj (piştî-PCR).Tedbîrên gelemperî yên jêrîn dê ji bo kêmkirina şansê vegirtinê bibin alîkar.Ji bo: Amadekirina mastermiksê, derxistina asîda nukleîk û lêzêdekirina şablonê DNA, zêdekirin û hilanîna hilbera zêdekirî, û analîzkirina hilberan, wek mînak elektroforeziya gel.

Di hin mîhengan de, hebûna 4 odeyên cihê dijwar e.Vebijarkek mimkun lê kêm tê xwestin ev e ku meriv amadekirina mastermix li deverek vegirtinê bike, wek mînak kabîneyek herikîna laminar.Di rewşa zêdekirina PCR ya hêlîn de, divê amadekirina mastermiksê ji bo reaksiyona tûra duyemîn li devera 'paqij' ji bo amadekirina mastermiksê were amadekirin, lê însulasyona bi hilbera PCR ya bingehîn divê li jûreya amplifikasyonê were kirin, û heke gengaz be. li deverek vegirtinê ya taybetî (mînak kabîneyek herikîna laminar).

Ji her jûreyek/deverê re komek cihêreng ji pîpetên bi etîketkirî, şîretên fîlterê, rafikên lûleyê, vorteks, santrîfuj (heke têkildar), pênûs, reagentên laboratûwarê yên gelemperî, cil û bergên laboratûvarê û qutiyên destmalan ên ku dê li qereqolên xwe yên têkildar bimînin hewce dike.Dema ku di navbera deverên destnîşankirî de digerin, divê dest bêne şuştin û destan û kirasên laboratuarê werin guhertin.Divê reagent û alav ji qadeke pîs ber bi qadeke paqij ve neyên veguhestin.Ger rewşek dijwar çêbibe ku pêdivî ye ku reagentek an perçeyek amûrek ber bi paş ve were guheztin, divê ew pêşî bi 10% hîpoklorît sodyûm were paqij kirin, dûv re jî bi ava sterîl were paqij kirin.

Not

Pêdivî ye ku 10% çareseriya hîpochlorite sodyûm rojane nû were çêkirin.Dema ku ji bo paqijkirinê tê bikar anîn, divê demek herî kêm 10 hûrdeman pêwendiyê were girtin.
Wekî din, hilberên bazirganî yên berdest ên ku wekî deqalkerên rûkalê DNA-hilweşandî têne pejirandin dikarin bêne bikar anîn heke pêşnîyarên ewlehiyê yên herêmî destûr nedin karanîna hîpoklorita sodyûm an heke hîpoklorît sodyûm ji bo paqijkirina beşên metalîkî yên amûrê negunca be.

Bi îdeal, karmend divê li gorî ehlaqa herikîna xebatê ya yekalî tevbigerin û di heman rojê de ji deverên qirêj (piştî-PCR) neçin deverên paqij (pre-PCR).Lêbelê, dibe ku carinan hebin ku ev yek neçar e.Dema ku bûyerek weha çêbibe, divê karmend baldar bin ku bi tevahî destan bişon, destmalan biguhezînin, kirasê laboratûwarê yê destnîşankirî bikar bînin û alavên ku ew dixwazin dîsa ji jûreyê derxînin, wekî pirtûkên laboratûvarê, destnîşan nekin.Divê tedbîrên kontrolê yên weha di perwerdehiya karmendan de li ser awayên molekulî bêne giran kirin.

Piştî bikar anînê, divê cîhên çîmentoyê bi 10% hîpoklorît sodyûmê (li dûv wê ava sterîl ji bo rakirina spîkera bermayî), 70% etanolê, an deqalkerek pejirandî ya ku DNA-hilweşandina bazirganî heye were paqij kirin.Bi îdeal, lampeyên ultra-violet (UV) divê werin bicîh kirin ku ji hêla tîrêjê ve paqijkirina paqijkirinê bikar bînin.Lêbelê, divê karanîna lampayên UV li deverên xebatê yên girtî, wek mînak kabîneyên ewlehiyê, were sînordar kirin, da ku ronahiya UV ya xebatkarên laboratuarê were sînordar kirin.Ji kerema xwe rêwerzên hilberîner ên ji bo lênêrîna lampa UV, hewakirin û paqijkirinê bişopînin da ku pê ewle bibin ku lampeyên bi bandor bimînin.

Ger ji sedî 70% etanol li şûna hîpoklorît sodyûm were bikar anîn, tîrêjkirina bi tîrêja UV dê hewce bike ku paqijkirinê temam bike.
Vortex û santrîfujê bi hîpoklorît sodyûmê paqij nekin;li şûna wê, bi 70% etanolê paqij bikin û li ber tîrêja UV-yê derxînin, an jî dekontamînantek bazirganî ya DNA-hilweşînkar bikar bînin.Ji bo rijandinê, ji bo şîreta paqijkirinê bêtir bi çêkerê re kontrol bikin.Ger rêwerzên çêker destûrê didin, pêdivî ye ku pipet bi rêkûpêk bi otoclave sterilîze bibin.Ger pîpet nikaribin otoklav bikin, pêdivî ye ku meriv wan bi %10 hîpoklorît sodyûmê paqij bike (li dûv wê bi ava sterîl were paqij kirin) an jî bi dekontamînantek bazirganî ya ku DNA-hilweş dike û dûv re jî ronahiya UV-yê tê paqij kirin.

Paqijkirina bi hîpoklorît sodyûmê ji sedî bilind ger bi rêkûpêk were kirin dibe ku di dawiyê de zirarê bide plastîk û metalên pipetê;pêşî pêşniyarên hilberîner kontrol bikin.Pêdivî ye ku hemî amûr bi rêkûpêk li gorî nexşeya ku ji hêla hilberîner ve hatî pêşniyar kirin were pîvandin.Pêdivî ye ku kesek destnîşankirî berpirsiyar be ku pê ewle bibe ku nexşeya kalibrasyonê bişopîne, tomarên hûrgulî têne domandin, û etîketên karûbarê bi zelalî li ser amûran têne xuyang kirin.

3. Ji bo cîhê molekularê destnîşankirî şîreta bikar anîn û paqijkirinê

Pêş-PCR: Amadekirina reagent / mastermix: Divê ev ji hemî cîhên ku ji bo amadekirina ceribandinên molekulî têne bikar anîn paqijtirîn be û divê bi îdeal be kabîneyek herikîna laminar a destnîşankirî ku bi ronahiya UV-ê ve girêdayî ye.Nimûne, asîda nukleîk a ku hatî derxistin û hilberên PCR-ya zêdekirî divê li vê deverê neyên xebitandin.Pêdivî ye ku reagentên amplifikasyonê di sarincokê de (an jî sarincokê, li gorî pêşniyarên çêker) li heman cîhê destnîşankirî, bi îdeal li kêleka kabîneya herikîna laminar an devera pêş-PCR-ê werin hilanîn.Dema ku têkevin qada pêş-PCR an kabîneya herikîna laminar divê her carê destmal werin guheztin.

Devera pêş-PCR an jî kabîneya herikîna laminar divê berî û piştî bikaranînê bi vî awayî bê paqijkirin: Hemû tiştên di kabîneyê de, wek nimûne, pîpet, qutiyên tîp, vortex, santrîfuj, refikên lûleyê, pênûs û hwd. bi 70% etanol an jî bazirganiya DNA-hilweşandina decontaminant, û destûrê dide zuhakirina.Di warê karekî girtî de, wek mînak kabîneya herikîna laminar, 30 hûrdeman kapûpê li ber tîrêja UV-yê derxe.

Not

Reagentan li ber tîrêja UV dernexînin;tenê gava ku ew paqij bibin wan bixin nav kabîneyê.Ger PCR-ya transkrîpsiyona berevajî bikin, dibe ku ew jî bibe alîkar ku meriv rû û amûran bi çareseriyek ku RNases di têkiliyê de diqetîne paqij bike.Ev dibe alîkar ku meriv encamên derewîn-neyînî ji hilweşandina enzîmê ya RNA-yê dûr bixe.Piştî paqijkirinê û berî amadekirina mastermiksê, divê destmal careke din werin guheztin, û dûv re kabîne amade ye ku bikar bîne.

Pre-PCR: Derxistina asîda nukleîk / lêzêdekirina şablonê:

Pêdivî ye ku asîda nukleîk li deverek destnîşankirî ya duyemîn were derxistin û destwerdan, bi karanîna komek pîpetan, serişteyên parzûnê, refikên boriyan, destikên nû, kincên laboratûvarê û alavên din were derxistin. tubes an lewheyên mastermix.Ji bo ku ji pîsbûna nimûneyên asîda nukleîîk ên ku têne analîz kirin dûr nekevin, tê pêşniyar kirin ku berî ku meriv bi kontrol an standardên erênî ve mijûl bibe destan biguhezîne û komek pîpetên cûda bikar bîne.Reagentên PCR û hilberên zêdekirî divê li vê deverê neyên avêtin.Nimûne divê li heman deverê di sarincok an cemidankên diyarkirî de werin hilanîn.Divê cîhê xebata nimûneyê bi heman rengî wekî cîhê mastermix were paqij kirin.

Post-PCR: Zêdekirin û hilanîna hilbera zêdekirî

Ev cîhê destnîşankirî ji bo pêvajoyên piştî zêdebûnê ye û divê bi fîzîkî ji deverên pêş-PCR veqetandî be.Ew bi gelemperî thermocyclers û platformên rast-dem-ê vedihewîne, û bi îdeal divê xwedan kabîneyek herikîna lamînar hebe ji bo zêdekirina dora 1-ê hilbera PCR-ê li reaksiyona dora 2-ê, heke PCR-ya hêl tê kirin.Reajansên PCR û asîda nukleîk a jêderkirî divê li vê deverê neyên xebitandin ji ber ku metirsiya qirêjbûnê zêde ye.Di vê deverê de pêdivî ye ku komek ji destmal, kincên laboratûvarê, refikên plak û lûle, pîpet, şîretên parzûnê, qulik û alavên din hebin.Berî vebûnê divê lûle bêne santrîfuj kirin.Divê cîhê xebata nimûneyê bi heman rengî wekî cîhê mastermix were paqij kirin.

Post-PCR: Analîzkirina hilberê

Ev ode ji bo alavên tespîtkirina hilberan e, mînak tankên elektroforez ên gel, pakêtên hêzê, transilluminatora UV û pergala belgekirina gel.Divê li vê deverê komek destmal, kincên laboratûvarê, refikên plak û lûle, pîpet, şîretên parzûnê, çîp û alavên din hebin.Ti reagentên din nikarin werin vê deverê, ji bilî boyaxkirina barkirinê, nîşankera molekular û gêla agarose, û pêkhateyên tampon.Divê cîhê xebata nimûneyê bi heman rengî wekî cîhê mastermix were paqij kirin.

Nîşe girîng

Bi îdeal, jûreyên pêş-PCR-ê divê di heman rojê de neyên ketina hundurê ger ku kar berê li odeyên piştî-PCR-ê hatine kirin.Ger ev yek bi tevahî neçar be, pê ewle bin ku pêşî destan bi baldarî werin şuştin û ku di jûreyan de kincên laboratîfê yên taybetî li xwe bikin.Ger ku ew di odeyên piştî-PCR de hatine bikar anîn divê pirtûk û kaxezên laboratîfê neyên avêtin odeyên pêş-PCR;ger hewce be, çapkirina dubare ya protokolan/nasnameyên nimûne, hwd.

4. Şîreta biyolojiya molekulî ya giştî

Destikên bê toz bikar bînin da ku ji astengkirina ceribandinê dûr bisekinin.Teknîka rast a pipetkirinê ji bo kêmkirina gemarê pir girîng e.Pipekirina nerast dibe ku di dema belavkirina şilek û çêkirina aerosolan de bibe sedema rijandin.Pratîka baş a ji bo pîpkirina rast li ser lînkên jêrîn têne dîtin: Rêbernameya Gilson ji bo pîpkirinê, Vîdyoyên teknîka pîpkirinê ya Anachem, Berî vekirina lûleyên santrîfûjê û bi baldarî vekin da ku nerijin.Piştî bikaranînê tavilê lûleyan bigrin da ku ji danasîna gemaran dûr nekevin.

Dema ku reaksiyonên pirjimar pêk tînin, yek mastermiksek ku reagentên hevpar hene (mînak av, dNTP, tampon, primer û enzîm) amade bikin da ku hejmara veguheztina reagentan kêm bikin û xetereya gemariyê kêm bikin.Tê pêşniyar kirin ku mastermix li ser berfê an bloka sar were saz kirin.Bikaranîna enzîmek Destpêka Germ dibe alîkar ku hilberîna hilberên ne-taybet kêm bike.Reagentên ku sondajên fluorescent hene ji ronahiyê biparêzin da ku ji hilweşandinê dûr nekevin.

5. Kontrolên navxweyî

Kontrolên erênî û neyînî yên baş-karakterîzekirî, pejirandî, digel kontrolek bê-şablon di hemî reaksiyonên de, û xêzek tîtirkirî ya pir-xalî ji bo reaksiyonên jimareyî tevde bikin.Kontrola erênî divê ne ew qas xurt be ku xetereyek gemarî çêbike.Dema ku derxistina asîda nukleîk pêk tînin, kontrolên derxistina erênî û neyînî vedihewînin.

Tête pêşniyar kirin ku rêwerzên zelal li her deverê bêne şandin da ku bikarhêner ji qaîdeyên tevgerê haydar bin.Laboratuwarên tespîtkirinê ku di nimûneyên klînîkî de astên pir kêm ên DNA an RNA-yê tespît dikin, dibe ku bixwazin pîvana ewlehiyê ya zêde ya hebûna pergalên veguheztina hewayê yên cihêreng bi tansiyona hewayê hinekî erênî li odeyên pêş-PCR-yê û zexta hewayê hinekî neyînî li odeyên piştî-PCR-ê bipejirînin.

Di dawiyê de, pêşxistina plansaziyek ewlehiya kalîteyê (QA) arîkar e.Planek wusa divê navnîşên stokên sereke yên reagentê û stokên xebatê, qaîdeyên ji bo hilanîna kît û reagentan, raporkirina encamên kontrolê, bernameyên perwerdehiya karmendan, algorîtmayên çareserkirina pirsgirêkan, û gava ku hewce bike, çalakiyên çareserkirinê pêk bîne.

6. Bîbliyografî

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Beş 3: Sazkirina laboratuarek qPCR.Belgeyek rêberî ji bo ceribandina avên rekreasyonê bi karanîna rêbaza USEPA qPCR 1611. Zanîngeha Dewleta Lansing- Michigan.

Tenduristiya Giştî ya Îngilîstan, NHS.Standardên Keyaniya Yekbûyî yên ji bo vekolînên mîkrobiyolojiyê: Pratîka laboratîfê ya baş dema ku ceribandinên zêdekirina molekularî dikin).Rêbernameya Kalîteyê.2013; 4 (4): 1-15.

Mifflin T. Sazkirina laboratuarek PCR.Cold Spring Harb Protoc.2007; 7.

Schroeder S 2013. Lênêrîna rûtîn ya santrîfujeyan: paqijkirin, parastin û dezenfektekirina santrîfuj, rotor û adapteran (Kaxaza Spî No. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Pratîka Klînîkî ya Baş (GCLP) ji bo ceribandinên bingehîn ên molekulî yên ku di laboratîfên tespîtkirinê de têne bikar anîn, Li: Akyar I, edîtor.Berfirehiya kontrolkirina kalîteyê.Rijeka, Croatia: Intech;2011: 29–52.