분자 검출 방법은 샘플에서 발견되는 미량의 증폭을 통해 대량의 핵산을 생산할 수 있는 능력이 있습니다.이는 민감한 감지를 가능하게 하는 데 도움이 되지만 실험실 환경에서 증폭 에어로졸의 확산을 통해 오염 가능성도 도입합니다.실험을 수행할 때 시약, 실험실 장비 및 벤치 공간의 오염을 방지하기 위한 조치를 취할 수 있습니다. 이러한 오염은 위양성(또는 위음성) 결과를 생성할 수 있습니다.

오염 가능성을 줄이기 위해 Good Laboratory Practice를 항상 실행해야 합니다.특히 다음 사항에 주의해야 합니다.

1. 시약 취급
2. 작업 공간 및 장비 구성
3. 지정된 분자 공간에 대한 사용 및 세척 지침
4. 일반적인 분자 생물학 조언
5. 내부통제
6. 참고문헌

1. 시약 취급

에어로졸 생성을 방지하기 위해 시약 튜브를 개봉하기 전에 잠시 원심분리합니다.다중 동결-해동 및 마스터 스톡의 오염을 방지하기 위한 분취 시약.모든 시약 및 반응 튜브에 명확하게 라벨을 붙이고 날짜를 기입하고 모든 실험에 사용된 시약 로트 및 배치 번호의 로그를 유지하십시오.필터 팁을 사용하여 모든 시약과 샘플을 피펫팅합니다.구매하기 전에 필터 팁이 사용할 피펫 브랜드에 맞는지 제조업체에 확인하는 것이 좋습니다.

2. 작업 공간 및 장비 구성

Clean 영역(pre-PCR)에서 Dirty 영역(post-PCR)까지 작업 흐름이 한 방향으로 이루어지도록 작업 공간을 구성해야 합니다.다음과 같은 일반적인 주의 사항은 오염 가능성을 줄이는 데 도움이 됩니다.마스터믹스 준비, 핵산 추출 및 DNA 템플릿 추가, 증폭 제품의 증폭 및 취급, 제품 분석(예: 겔 전기영동)을 위해 별도의 지정된 공간 또는 최소한 물리적으로 분리된 구역을 마련하십시오.

일부 설정에서는 4개의 별도 방을 갖는 것이 어렵습니다.가능하지만 덜 바람직한 옵션은 예를 들어 층류 캐비닛과 같은 봉쇄 구역에서 마스터믹스 준비를 수행하는 것입니다.Nested PCR 증폭의 경우 2차 반응을 위한 mastermix 준비는 mastermix 준비를 위한 'clean' 구역에서 준비하되, primary PCR product의 접종은 증폭실에서 해야 하며 가능하면 전용 격리 구역(예: 층류 캐비닛)

각 방/영역에는 명확하게 레이블이 지정된 피펫, 필터 팁, 튜브 랙, 와류, 원심 분리기(해당하는 경우), 펜, 일반 실험실 시약, 실험실 가운 및 각 작업 공간에 보관할 장갑 상자의 별도 세트가 필요합니다.지정된 구역을 이동할 때는 손을 씻고 장갑과 실험복을 갈아입어야 합니다.시약과 장비를 더러운 곳에서 깨끗한 곳으로 옮겨서는 안 됩니다.시약이나 장비를 뒤로 이동해야 하는 극단적인 경우가 발생하면 먼저 10% 차아염소산나트륨으로 오염을 제거한 다음 멸균수로 닦아내야 합니다.

메모

10% 차아염소산나트륨 용액은 매일 새로 만들어야 합니다.오염 제거에 사용할 경우 최소 10분의 접촉 시간을 준수해야 합니다.
또는 현지 안전 권장 사항에서 차아염소산 나트륨의 사용을 허용하지 않거나 차아염소산 나트륨이 장비의 금속 부품 오염 제거에 적합하지 않은 경우 DNA 파괴 표면 오염 제거제로 검증된 시판 제품을 사용할 수 있습니다.

이상적으로는 직원이 단방향 작업 흐름 정신을 준수하고 더러운 영역(사후 PCR)에서 깨끗한 영역(사전 PCR)으로 같은 날 이동하지 않아야 합니다.그러나 불가피한 경우가 있습니다.이러한 경우 직원은 손을 철저히 씻고, 장갑을 교체하고, 지정된 실험실 가운을 착용하고, 실험실 책과 같이 방에서 다시 꺼내고 싶은 장비를 반입하지 ​​않도록 주의해야 합니다.이러한 제어 조치는 분자 방법에 대한 직원 교육에서 강조되어야 합니다.

사용 후에는 벤치 공간을 10% 차아염소산나트륨(잔여 표백제를 제거하기 위한 멸균수 사용), 70% 에탄올 또는 시중에서 구할 수 있는 검증된 DNA 파괴 오염 제거제로 청소해야 합니다.이상적으로는 자외선(UV) 램프를 장착하여 조사를 통해 오염을 제거해야 합니다.그러나 실험실 직원의 UV 노출을 제한하기 위해 UV 램프의 사용은 폐쇄된 작업 영역(예: 안전 캐비닛)으로 제한되어야 합니다.램프의 효과를 유지하려면 UV 램프 관리, 환기 및 청소에 대한 제조업체 지침을 준수하십시오.

차아염소산나트륨 대신 70% 에탄올을 사용하는 경우 오염 제거를 완료하려면 UV 광선을 조사해야 합니다.
차아염소산나트륨으로 vortex와 원심분리기를 세척하지 마십시오.대신 70% 에탄올로 닦아내고 자외선에 노출시키거나 상업용 DNA 파괴 오염 제거제를 사용하십시오.엎지른 경우 제조업체에 추가 청소 조언을 확인하십시오.제조업체 지침에서 허용하는 경우 피펫은 정기적으로 오토클레이브를 사용하여 멸균해야 합니다.피펫을 오토클레이브할 수 없는 경우 10% 차아염소산나트륨(멸균수로 철저히 닦아낸 후) 또는 상업용 DNA 파괴 오염 제거제로 세척한 다음 UV 노출로 충분해야 합니다.

높은 비율의 차아염소산나트륨으로 세척하면 정기적으로 피펫 플라스틱과 금속이 손상될 수 있습니다.먼저 제조업체의 권장 사항을 확인하십시오.모든 장비는 제조업체가 권장하는 일정에 따라 정기적으로 보정해야 합니다.지정된 사람이 교정 일정을 준수하고, 자세한 로그를 유지하고, 서비스 라벨을 장비에 명확하게 표시하는지 확인하는 일을 담당해야 합니다.

3. 지정된 분자 공간에 대한 사용 및 세척 지침

사전 PCR: 시약 분취/마스터믹스 준비: 분자 실험 준비에 사용되는 모든 공간 중에서 가장 깨끗해야 하며 이상적으로는 UV 조명이 장착된 지정된 층류 캐비닛이어야 합니다.샘플, 추출된 핵산 및 증폭된 PCR 제품은 이 영역에서 취급해서는 안 됩니다.증폭 시약은 동일한 지정 공간의 냉동고(또는 제조업체 권장 사항에 따라 냉장고)에 보관해야 하며, 이상적으로는 층류 캐비닛 또는 사전 PCR 영역 옆에 있어야 합니다.장갑은 사전 PCR 영역 또는 층류 캐비닛에 들어갈 때마다 교체해야 합니다.

Pre-PCR 영역 또는 층류 캐비닛은 다음과 같이 사용 전후에 청소해야 합니다. 캐비닛의 모든 항목(예: 피펫, 팁 상자, 소용돌이, 원심 분리기, 튜브 랙, 펜 등)을 70% 에탄올 또는 상업용 DNA 파괴 오염 제거제를 사용하고 건조시킵니다.폐쇄된 작업 영역(예: 층류 캐비닛)의 경우 후드를 UV 광선에 30분 동안 노출시키십시오.

메모

시약을 UV 광선에 노출시키지 마십시오.깨끗해진 후에만 캐비닛으로 옮기십시오.역전사 PCR을 수행하는 경우 접촉 시 RNase를 분해하는 용액으로 표면과 장비를 닦는 것도 도움이 될 수 있습니다.이것은 RNA의 효소 분해로 인한 위음성 결과를 피하는 데 도움이 될 수 있습니다.오염 제거 후 마스터 믹스를 준비하기 전에 장갑을 한 번 더 교체해야 캐비닛을 사용할 수 있습니다.

Pre-PCR: 핵산 추출/템플릿 추가:

핵산은 별도의 피펫 세트, 필터 팁, 튜브 랙, 새 장갑, 실험실 코트 및 기타 장비를 사용하여 두 번째로 지정된 영역에서 추출 및 처리해야 합니다. 이 영역은 또한 템플릿, 컨트롤 및 추세선을 추가하기 위한 것입니다. mastermix 튜브 또는 플레이트.분석 중인 추출된 핵산 샘플의 오염을 방지하기 위해 양성 대조군 또는 표준을 취급하기 전에 장갑을 교체하고 별도의 피펫 세트를 사용하는 것이 좋습니다.PCR 시약 및 증폭 제품은 이 영역에서 피펫팅하면 안 됩니다.검체는 같은 구역의 지정된 냉장고 또는 냉동고에 보관해야 합니다.샘플 작업 공간은 마스터 믹스 공간과 같은 방식으로 청소해야 합니다.

Post-PCR: 증폭 및 증폭된 산물의 취급

이 지정된 공간은 증폭 후 과정을 위한 공간으로 사전 PCR 영역과 물리적으로 분리되어야 합니다.여기에는 일반적으로 열순환기 및 실시간 플랫폼이 포함되며 중첩된 PCR이 수행되는 경우 이상적으로는 1차 PCR 생성물을 2차 반응에 추가하기 위한 층류 캐비닛이 있어야 합니다.PCR 시약 및 추출된 핵산은 오염의 위험이 높기 때문에 이 영역에서 취급해서는 안됩니다.이 영역에는 별도의 장갑 세트, 실험실 코트, 플레이트 및 튜브 랙, 피펫, 필터 팁, 통 및 기타 장비가 있어야 합니다.튜브는 개봉하기 전에 원심분리해야 합니다.샘플 작업 공간은 마스터 믹스 공간과 같은 방식으로 청소해야 합니다.

사후 PCR: 제품 분석

이 공간은 젤 전기영동 탱크, 파워 팩, UV 투과 조명기 및 젤 문서화 시스템과 같은 제품 감지 장비를 위한 공간입니다.이 영역에는 별도의 장갑 세트, 실험실 코트, 플레이트 및 튜브 랙, 피펫, 필터 팁, 통 및 기타 장비가 있어야 합니다.로딩 염료, 분자 마커 및 아가로스 겔, 완충제 성분을 제외한 다른 시약은 이 영역으로 가져올 수 없습니다.샘플 작업 공간은 마스터 믹스 공간과 같은 방식으로 청소해야 합니다.

중요 사항

이상적으로는 사후 PCR실에서 작업이 이미 수행된 경우 같은 날 사전 PCR실에 들어가지 않아야 합니다.이것이 완전히 불가피한 경우 먼저 손을 철저히 씻고 방에서 특정 실험실 가운을 착용했는지 확인하십시오.사후 PCR실에서 사용된 실험실 서적 및 서류는 사전 PCR실로 반입할 수 없습니다.필요한 경우 프로토콜/샘플 ID 등을 중복 출력하십시오.

4. 일반적인 분자 생물학 조언

분석 방해를 피하기 위해 분말이 없는 장갑을 사용하십시오.올바른 피펫팅 기술은 오염을 줄이는 데 가장 중요합니다.잘못된 피펫팅은 액체를 분배할 때 튀거나 에어로졸을 생성할 수 있습니다.올바른 피펫팅에 대한 모범 사례는 다음 링크에서 찾을 수 있습니다: 피펫팅에 대한 Gilson 가이드, Anachem 피펫팅 기술 비디오, 튜브를 열기 전에 원심분리기, 튀지 않도록 조심스럽게 개봉하십시오.오염 물질이 유입되지 않도록 사용 후 즉시 튜브를 닫으십시오.

여러 반응을 수행할 때 공통 시약(예: 물, dNTP, 버퍼, 프라이머 및 효소)을 포함하는 하나의 마스터믹스를 준비하여 시약 이동 횟수를 최소화하고 오염 위험을 줄입니다.얼음 또는 차가운 블록에 마스터믹스를 설정하는 것이 좋습니다.Hot Start 효소를 사용하면 비특이적 제품 생산을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.분해를 방지하기 위해 형광 프로브가 포함된 시약을 빛으로부터 보호하십시오.

5. 내부통제

잘 특성화되고 확인된 양성 및 음성 대조군과 함께 모든 반응에서 템플릿 없는 대조군과 정량적 반응을 위한 다점 적정 추세선을 포함합니다.양성 대조군은 오염 위험이 있을 정도로 강하지 않아야 합니다.핵산 추출을 수행할 때 양성 및 음성 추출 컨트롤을 포함합니다.

사용자가 행동 규칙을 알 수 있도록 각 영역에 명확한 지침을 게시하는 것이 좋습니다.임상 샘플에서 매우 낮은 수준의 DNA 또는 RNA를 검출하는 진단 실험실은 사전 PCR실에서 약간의 양압과 사후 PCR실에서 약간의 음압을 사용하는 별도의 공기 처리 시스템을 갖는 추가 보안 조치를 채택하기를 원할 수 있습니다.

마지막으로 품질 보증(QA) 계획을 개발하는 것이 도움이 됩니다.이러한 계획에는 시약 마스터 재고 및 작업 재고 목록, 키트 및 시약 보관 규칙, 관리 결과 보고, 직원 교육 프로그램, 문제 해결 알고리즘 및 필요한 경우 개선 조치가 포함되어야 합니다.

6. 참고문헌

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. 3장: qPCR 실험실 설정.USEPA qPCR 방법 1611을 사용하여 레크리에이션 물을 테스트하기 위한 지침 문서. Lansing-Michigan State University.

공중 보건 영국, NHS.미생물학 조사를 위한 영국 표준: 분자 증폭 분석을 수행할 때 Good Laboratory Practice).품질 지침.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. PCR 실험실 설정.콜드 스프링 하브 프로토콜.2007;7.

Schroeder S 2013. 원심분리기의 정기 유지보수: 원심분리기, 로터 및 어댑터의 세척, 유지보수 및 소독(백서 14번).함부르크: 에펜도르프;2013.

비아나 RV, 월리스 CL.진단 실험실에서 사용되는 분자 기반 테스트를 위한 GCLP(Good Clinical Laboratory Practice), In: Akyar I, 편집자.품질 관리의 광범위한 스펙트럼.리예카, 크로아티아: Intech;2011: 29–52.