Молекулалық анықтау әдістері үлгілерде табылған іздік мөлшерлерді күшейту арқылы нуклеин қышқылының үлкен көлемін өндіру мүмкіндігіне ие.Бұл сезімтал анықтауды қамтамасыз ету үшін пайдалы болғанымен, зертханалық ортада күшейту аэрозольдарының таралуы арқылы ластану мүмкіндігін енгізеді.Эксперименттерді жүргізген кезде реагенттер, зертханалық жабдықтар мен орындық кеңістіктің ластануын болдырмау үшін шаралар қабылдауға болады, өйткені мұндай ластану жалған-оң (немесе жалған-теріс) нәтижелерді тудыруы мүмкін.

Ластану ықтималдығын азайтуға көмектесу үшін жақсы зертханалық тәжірибені үнемі орындау керек.Атап айтқанда, келесі тармақтарға қатысты сақтық шараларын сақтау керек:

1. Реагенттермен жұмыс істеу
2. Жұмыс кеңістігін және жабдықтарды ұйымдастыру
3. Белгіленген молекулалық кеңістікті пайдалану және тазалау бойынша кеңес
4. Жалпы молекулярлық биология бойынша кеңес
5. Ішкі бақылау
6. Библиография

1. Реагенттермен жұмыс істеу

Аэрозольдердің пайда болуын болдырмау үшін ашар алдында реагент түтіктерін қысқаша центрифугалаңыз.Бірнеше мұздату-ерітуді және негізгі қорлардың ластануын болдырмау үшін аликвоттық реагенттер.Барлық реагент пен реакция түтіктерін анық белгілеп, күнін көрсетіңіз және барлық эксперименттерде қолданылатын реагент партиясы мен партия нөмірлерінің журналдарын жүргізіңіз.Сүзгі ұштарын қолданып, барлық реагенттер мен үлгілерді тамшуырға салыңыз.Сатып алу алдында өндірушімен сүзгі ұштары пайдаланылатын тамшуырдың брендіне сәйкес келетінін растаған жөн.

2. Жұмыс кеңістігін және жабдықтарды ұйымдастыру

Жұмыс кеңістігі таза аумақтардан (ПТР алды) лас жерлерге (пост-ПТР) дейін жұмыс ағыны бір бағытта жүруін қамтамасыз ету үшін ұйымдастырылуы керек.Төмендегі жалпы сақтық шаралары ластану мүмкіндігін азайтуға көмектеседі.Бөлек бөлінген бөлмелер немесе ең аз дегенде физикалық бөлек аумақтар болуы керек: мастермиксті дайындау, нуклеин қышқылын алу және ДНҚ шаблонын қосу, күшейтілген өнімді күшейту және өңдеу және өнімді талдау, мысалы, гель электрофорезі.

Кейбір параметрлерде 4 бөлек бөлменің болуы қиын.Ықтимал, бірақ аз қалаусыз нұсқа - мастер-микс дайындауды оқшаулау аймағында, мысалы, ламинарлы ағынды шкафта жасау.Кірістірілген ПТР күшейту жағдайында, екінші айналым реакциясы үшін мастермиксті дайындау мастермиксті дайындау үшін «таза» аймақта дайындалуы керек, бірақ бастапқы ПТР өнімімен егу күшейту бөлмесінде және мүмкін болса, жасалуы керек. арнайы оқшаулау аймағында (мысалы, ламинарлы ағынды шкаф).

Әрбір бөлмеге/аймаққа нақты белгіленген тамшуырлардың, сүзгі ұштарының, түтік сөрелерінің, құйындылардың, центрифугалардың (қажет болса), қаламсаптардың, жалпы зертханалық реагенттердің, зертханалық халаттардың және олардың тиісті жұмыс станцияларында қалатын қолғап қораптарының жеке жинағы қажет.Белгіленген аумақтар арасында қозғалу кезінде қолды жуу керек, қолғап пен зертханалық халатты ауыстыру керек.Реагенттер мен жабдықты лас аймақтан таза жерге ауыстыруға болмайды.Төтенше жағдай туындаса, реагент немесе жабдықты артқа қарай жылжыту қажет болса, оны алдымен 10% натрий гипохлоритімен залалсыздандыру керек, содан кейін стерильді сумен сүрту керек.

Ескерту

Натрий гипохлоритінің 10% ерітіндісі күн сайын жаңадан дайындалуы керек.Залалсыздандыру үшін пайдаланған кезде кем дегенде 10 минут байланыс уақытын сақтау керек.
Немесе, егер жергілікті қауіпсіздік ұсынымдары натрий гипохлоритін қолдануға рұқсат етпесе немесе натрий гипохлориті жабдықтың металл бөліктерін залалсыздандыруға жарамсыз болса, ДНҚ-ны бұзатын беттік деконтаминанттар ретінде расталған коммерциялық қолжетімді өнімдерді пайдалануға болады.

Ең дұрысы, персонал бір бағытты жұмыс ағынының этикасын ұстануы және сол күні лас жерлерден (ПТР-дан кейінгі) таза жерлерге (ПТР-ға дейінгі) қайта бармауы керек.Дегенмен, бұл сөзсіз болатын жағдайлар болуы мүмкін.Мұндай жағдай туындаған кезде персонал қолды мұқият жууға, қолғапты ауыстыруға, арнайы зертханалық халатты қолдануға және зертханалық кітаптар сияқты бөлмеден қайта шығарғысы келетін ешбір жабдықты енгізбеуге тырысуы керек.Молекулярлық әдістерге қызметкерлерді оқытуда мұндай бақылау шараларына ерекше мән беру керек.

Пайдаланғаннан кейін орындық кеңістіктерді 10% натрий гипохлоритімен (артынан қалдық ағартқышты кетіру үшін стерильді сумен), 70% этанолмен немесе валидацияланған, сатылатын ДНҚ-ны бұзатын дезактивантпен тазалау керек.Ең дұрысы, ультракүлгін (УК) шамдар сәулелену арқылы залалсыздандыруды қамтамасыз ету үшін жабдықталуы керек.Дегенмен, зертхана қызметкерлерінің ультракүлгін сәулесінің әсерін шектеу үшін ультракүлгін шамдарды пайдалану жабық жұмыс орындарында, мысалы, қауіпсіздік шкафтарында шектелуі керек.Шамдар тиімді болып қалуы үшін ультракүлгін шамдарды күту, желдету және тазалау бойынша өндірушінің нұсқауларын орындаңыз.

Егер натрий гипохлоритінің орнына 70% этанол қолданылса, залалсыздандыруды аяқтау үшін ультракүлгін сәулемен сәулелендіру қажет болады.
Натрий гипохлоритімен құйынды және центрифуганы тазалауға болмайды;оның орнына 70% этанолмен сүртіңіз және УК сәулесінің әсеріне ұшыратыңыз немесе коммерциялық ДНҚ-ны бұзатын залалсыздандыру құралын пайдаланыңыз.Төгілген жерлерді тазалау бойынша қосымша кеңес алу үшін өндірушіден сұраңыз.Егер өндіруші нұсқаулары рұқсат етсе, тамшуырларды автоклавта жүйелі түрде зарарсыздандыру керек.Тамшуырларды автоклавтау мүмкін болмаса, оларды 10% натрий гипохлоритімен (содан кейін стерильді сумен мұқият сүртіңіз) немесе ДНҚ-ны бұзатын коммерциялық деконтаминантпен, содан кейін УК әсерінен тазалау жеткілікті.

Натрий гипохлориті жоғары пайызбен тазалау жүйелі түрде жасалса, ақырында тамшуыр пластмассалары мен металдарды зақымдауы мүмкін;алдымен өндірушінің ұсыныстарын тексеріңіз.Барлық жабдықты өндіруші ұсынған кестеге сәйкес жүйелі түрде калибрлеу қажет.Белгіленген адам калибрлеу кестесінің сақталуына, егжей-тегжейлі журналдардың жүргізілуіне және жабдықта қызмет көрсету белгілерінің анық көрсетілуіне жауапты болуы керек.

3. Белгіленген молекулалық кеңістікті пайдалану және тазалау бойынша кеңес

Алдын ала ПТР: реагент аликводы/мастермиксті дайындау: Бұл молекулалық эксперименттерді дайындау үшін пайдаланылатын барлық кеңістіктердің ішіндегі ең тазасы болуы керек және УК сәулесімен жабдықталған арнайы ламинарлы ағынды шкаф болуы керек.Үлгілерді, экстракцияланған нуклеин қышқылын және күшейтілген ПТР өнімдерін бұл аймақта өңдеуге болмайды.Күшейткіш реагенттер мұздатқышта (немесе өндірушінің ұсыныстары бойынша тоңазытқышта) бірдей белгіленген кеңістікте, ең дұрысы ламинарлы ағынды шкафтың немесе алдын ала ПТР аймағының жанында сақталуы керек.Қолғаптарды ПТР алдындағы аймаққа немесе ламинарлы ағынды шкафқа кірген сайын өзгерту керек.

ПТР алдындағы аумақты немесе ламинарлы ағынды шкафты қолданар алдында және кейін келесідей тазалау керек: Шкафтағы барлық заттарды, мысалы, тамшуырларды, ұштық қораптарды, құйынды, центрифуганы, түтік сөрелерін, қаламдарды және т.б. 70% этанолмен сүртіңіз. коммерциялық ДНҚ-ны бұзатын деконтаминант және кептіруге рұқсат етіңіз.Жабық жұмыс аймағы жағдайында, мысалы, ламинарлы ағынды шкаф, сорғышты 30 минут бойы ультракүлгін сәулеге қалдырыңыз.

Ескерту

Реагенттерге ультракүлгін сәуленің әсерін тигізбеңіз;оларды шкафқа таза болғаннан кейін ғана жылжытыңыз.Кері транскрипциялық ПТР орындалатын болса, беттерді және жабдықты жанасу кезінде RNase ыдырататын ерітіндімен сүрту пайдалы болуы мүмкін.Бұл РНҚ ферментінің деградациясының жалған теріс нәтижелерін болдырмауға көмектесуі мүмкін.Залалсыздандырудан кейін және мастермиксті дайындамас бұрын, қолғапты тағы бір рет ауыстыру керек, содан кейін шкаф пайдалануға дайын болады.

Алдын ала ПТР: Нуклеин қышқылының экстракциясы/үлгісін қосу:

Нуклеин қышқылын бөлек тамшуырлар жинағын, сүзгі ұштарын, түтік сөрелерін, жаңа қолғаптарды, зертханалық халаттарды және басқа жабдықты пайдаланып, екінші тағайындалған аумақта алу және өңдеу қажет. Бұл аймақ сонымен қатар үлгілерді, басқару элементтерін және тренд сызықтарын қосуға арналған. мастермикс түтіктері немесе пластиналары.Талданатын нуклеин қышқылы үлгілерінің ластануын болдырмау үшін оң бақылау элементтерін немесе стандарттарды ұстамас бұрын қолғаптарды ауыстырып, тамшуырлардың бөлек жинағын пайдалану ұсынылады.ПТР реагенттері мен күшейтілген өнімдерді бұл аймаққа тамызуға болмайды.Үлгілерді бір аймақта арнайы тоңазытқыштарда немесе мұздатқыштарда сақтау керек.Үлгі жұмыс кеңістігін мастермикс кеңістігі сияқты тазалау керек.

Пост-ПТР: күшейтілген өнімді күшейту және өңдеу

Бұл тағайындалған кеңістік кейінгі күшейту процестеріне арналған және ПТР алдындағы аймақтардан физикалық түрде бөлек болуы керек.Ол әдетте термоциклерлер мен нақты уақыттағы платформаларды қамтиды және егер кірістірілген ПТР орындалса, 2-раунд реакциясына 1-ші дөңгелек ПТР өнімін қосу үшін ламинарлы ағынды шкаф болуы керек.ПТР реагенттері мен экстракцияланған нуклеин қышқылын бұл аймақта өңдеуге болмайды, өйткені ластану қаупі жоғары.Бұл аймақта қолғаптардың, зертханалық халаттардың, пластиналар мен түтіктерге арналған сөрелердің, тамшуырлардың, сүзгілердің ұштарының, бункерлердің және басқа жабдықтардың жеке жиынтығы болуы керек.Түтіктерді ашар алдында центрифугалау керек.Үлгі жұмыс кеңістігін мастермикс кеңістігі сияқты тазалау керек.

Пост-ПТР: Өнімді талдау

Бұл бөлме өнімді анықтауға арналған жабдыққа арналған, мысалы, гельдік электрофорез цистерналары, қуат жинақтары, УК-трансиллюминатор және гельдік құжаттама жүйесі.Бұл аймақта қолғаптардың, зертханалық халаттардың, пластиналар мен түтіктерге арналған сөрелердің, тамшуырлардың, сүзгілердің ұштарының, бункерлердің және басқа жабдықтардың жеке жинақтары болуы керек.Бұл аймаққа жүктейтін бояғышты, молекулалық маркерді және агарозды гельді және буфер компоненттерін қоспағанда, басқа реагенттерді әкелуге болмайды.Үлгі жұмыс кеңістігін мастермикс кеңістігі сияқты тазалау керек.

Маңызды ескерту

Ең дұрысы, ПТР-дан кейінгі бөлмелерде жұмыс әлдеқашан орындалған болса, алдын ала ПТР бөлмелеріне бір күнде кіруге болмайды.Егер мұны болдырмау мүмкін болмаса, алдымен қолды мұқият жуып, бөлмелерде арнайы зертханалық пальто кигенін тексеріңіз.Зертханалық дәптер мен іс-қағаздар ПТР-дан кейінгі бөлмелерде қолданылған болса, ПТР алдындағы бөлмелерге кіргізілмеуі керек;қажет болса, хаттамалардың/үлгі идентификаторлардың көшірмелерін және т.б.

4. Жалпы молекулярлық биология бойынша кеңес

Талдауды тежеу ​​үшін ұнтақсыз қолғаптарды пайдаланыңыз.Ластануды азайту үшін дұрыс тамшуырлау техникасы маңызды.Тамшуырларды дұрыс қолданбау сұйықтықтарды беру кезінде шашырауға және аэрозольдердің пайда болуына әкелуі мүмкін.Тамшуырларды дұрыс құюға арналған жақсы тәжірибені келесі сілтемелерден табуға болады: Гилсонның тамшуырға арналған нұсқаулығы, Anachem тамшуырлау техникасының бейнелері, Түтіктерді ашар алдында центрифугалаңыз және шашырауды болдырмас үшін мұқият ашыңыз.Қолданғаннан кейін ластаушы заттардың түсуін болдырмас үшін түтіктерді дереу жабыңыз.

Бірнеше реакцияларды орындаған кезде реагент тасымалдау санын азайту және ластану қаупін азайту үшін жалпы реагенттер (мысалы, су, dNTPs, буфер, праймерлер және фермент) бар бір мастермикс дайындаңыз.Мастермиксті мұзға немесе суық блокқа орнату ұсынылады.Ыстық бастау ферментін пайдалану спецификалық емес өнімдердің өндірісін азайтуға көмектесуі мүмкін.Құрамында флуоресцентті зондтары бар реагенттер деградацияны болдырмау үшін жарықтан қорғаңыз.

5. Ішкі бақылау

Жақсы сипатталған, расталған оң және теріс бақылауларды, сонымен қатар барлық реакцияларда үлгісіз бақылауды және сандық реакциялар үшін көп нүктелі титрленген тренд сызығын қосыңыз.Оң бақылау ластану қаупін тудыратындай күшті болмауы керек.Нуклеин қышқылын экстракциялау кезінде оң және теріс экстракцияны бақылауды қосыңыз.

Пайдаланушылар мінез-құлық ережелерінен хабардар болу үшін әр аймақта нақты нұсқауларды орналастыру ұсынылады.Клиникалық үлгілерде ДНҚ немесе РНҚ өте төмен деңгейлерін анықтайтын диагностикалық зертханалар ПТР-ға дейінгі бөлмелерде ауа қысымы сәл оң және ПТР-дан кейінгі бөлмелерде сәл теріс ауа қысымы бар бөлек ауа өңдеу жүйелеріне ие болу үшін қосымша қауіпсіздік шарасын қабылдауы мүмкін.

Соңында, сапаны қамтамасыз ету (QA) жоспарын әзірлеу пайдалы.Мұндай жоспар реагенттердің негізгі қорлары мен жұмыс қорларының тізімдерін, жинақтар мен реагенттерді сақтау ережелерін, бақылау нәтижелері туралы есептерді, қызметкерлерді оқыту бағдарламаларын, ақауларды жою алгоритмдерін және қажет болған жағдайда түзету әрекеттерін қамтуы керек.

6. Библиография

Аслан А, Кинзелман Дж, Дрелин Е, Ананьева Т, Лавандер Дж. 3-тарау: qPCR зертханасын орнату.USEPA qPCR әдісін қолдану арқылы рекреациялық суларды сынауға арналған нұсқаулық құжат 1611. Лансинг-Мичиган мемлекеттік университеті.

Қоғамдық денсаулық сақтау Англия, NHS.Микробиологиялық зерттеулерге арналған Ұлыбритания стандарттары: Молекулярлық күшейту талдауларын орындау кезіндегі жақсы зертханалық тәжірибе).Сапа бойынша нұсқаулық.2013;4(4):1–15.

Миффлин Т. ПТР зертханасын орнату.Суық көктем Харб хаттамасы.2007;7.

Schroeder S 2013. Центрифугаларға күнделікті техникалық қызмет көрсету: центрифугаларды, роторларды және адаптерлерді тазалау, техникалық қызмет көрсету және дезинфекциялау (Ақ қағаз № 14).Гамбург: Эппендорф;2013.

Viana RV, Уоллис CL.Диагностикалық зертханаларда қолданылатын молекулалық негізделген сынақтарға арналған жақсы клиникалық зертханалық тәжірибе (GCLP), In: Akyar I, редактор.Сапаны бақылаудың кең спектрі.Риека, Хорватия: Intech;2011: 29–52.