მოლეკულური გამოვლენის მეთოდებს აქვთ უნარი გამოიმუშაონ დიდი მოცულობის ნუკლეინის მჟავა ნიმუშებში ნაპოვნი კვალი რაოდენობების გაძლიერების გზით.მიუხედავად იმისა, რომ ეს მომგებიანია მგრძნობიარე გამოვლენისთვის, ის ასევე შემოაქვს დაბინძურების შესაძლებლობას ლაბორატორიულ გარემოში გამაძლიერებელი აეროზოლების გავრცელებით.ექსპერიმენტების ჩატარებისას შეიძლება განხორციელდეს ზომები რეაგენტების, ლაბორატორიული აღჭურვილობისა და სკამების ადგილის დაბინძურების თავიდან ასაცილებლად, რადგან ასეთმა დაბინძურებამ შეიძლება გამოიწვიოს ცრუ დადებითი (ან ცრუ-უარყოფითი) შედეგები.

დაბინძურების ალბათობის შესამცირებლად, კარგი ლაბორატორიული პრაქტიკა ყოველთვის უნდა განხორციელდეს.კერძოდ, სიფრთხილის ზომები უნდა იქნას მიღებული შემდეგ პუნქტებთან დაკავშირებით:

1. რეაგენტების დამუშავება
2. სამუშაო სივრცისა და აღჭურვილობის ორგანიზება
3. გამოყენებისა და დასუფთავების რჩევები დანიშნული მოლეკულური სივრცისთვის
4. ზოგადი მოლეკულური ბიოლოგიის რჩევა
5. შიდა კონტროლი
6. ბიბლიოგრაფია

1. რეაგენტების დამუშავება

გახსნის წინ მოახდინე რეაგენტის მილების ცენტრიფუგა, რათა თავიდან აიცილო აეროზოლების წარმოქმნა.ალიაქოთ რეაგენტები, რათა თავიდან იქნას აცილებული მრავალი გაყინვა-დათბობა და ძირითადი მარაგების დაბინძურება.მკაფიოდ მონიშნეთ ეტიკეტი და თარიღი ყველა რეაგენტისა და რეაქციის მილსა და შეინახეთ რეაგენტის პარტიებისა და სერიების ნომრები, რომლებიც გამოიყენება ყველა ექსპერიმენტში.პიპეტით გადაიტანეთ ყველა რეაგენტი და ნიმუში ფილტრის წვერების გამოყენებით.შეძენამდე მიზანშეწონილია მწარმოებელთან დაადასტუროთ, რომ ფილტრის წვერები შეესაბამება გამოსაყენებელი პიპეტის ბრენდს.

2. სამუშაო სივრცისა და აღჭურვილობის ორგანიზება

სამუშაო ადგილი უნდა იყოს ორგანიზებული ისე, რომ სამუშაოს ნაკადი მოხდეს ერთი მიმართულებით, სუფთა ტერიტორიებიდან (PCR-მდე) ბინძურ ადგილებამდე (PCR-ის შემდგომ).შემდეგი ზოგადი სიფრთხილის ზომები დაგეხმარებათ შეამციროთ დაბინძურების შანსი.გქონდეთ ცალკე გამოყოფილი ოთახები, ან მინიმუმ ფიზიკურად განცალკევებული ტერიტორიები: მასტერმიქსის მომზადებისთვის, ნუკლეინის მჟავის ექსტრაქციისა და დნმ-ის შაბლონის დამატება, გაძლიერებული პროდუქტის გაძლიერება და დამუშავება და პროდუქტის ანალიზი, მაგ., გელის ელექტროფორეზი.

ზოგიერთ პარამეტრში რთულია 4 ცალკე ოთახის არსებობა.შესაძლო, მაგრამ ნაკლებად სასურველი ვარიანტია მასტერმიქსის მომზადების გაკეთება შემაკავებელ ზონაში, მაგ. ლამინირებული ნაკადის კაბინეტში.წყობილი PCR გაძლიერების შემთხვევაში, მასტერმიქსის მომზადება მეორე რაუნდის რეაქციისთვის უნდა მომზადდეს მასტერმიქსის მომზადებისთვის „სუფთა“ უბანში, მაგრამ პირველადი PCR პროდუქტით ინოკულაცია უნდა მოხდეს ამპლიფიკაციის ოთახში და, თუ ეს შესაძლებელია. გამოყოფილი შეკავების ზონაში (მაგ. ლამინირებული ნაკადის კაბინეტი).

თითოეულ ოთახს/არეალს სჭირდება მკაფიოდ მარკირებული პიპეტების, ფილტრის წვერები, მილების თაროები, მორევები, ცენტრიფუგები (ასეთის არსებობის შემთხვევაში), კალმები, ზოგადი ლაბორატორიული რეაგენტები, ლაბორატორიული ქურთუკები და ხელთათმანების ყუთები, რომლებიც დარჩება მათ შესაბამის სამუშაო სადგურებზე.დანიშნულ ადგილებს შორის გადაადგილებისას ხელები უნდა დაიბანოთ და ხელთათმანები და ლაბორატორიული ხალათები შეიცვალოს.რეაგენტები და აღჭურვილობა არ უნდა გადაიტანოთ ჭუჭყიანი ადგილიდან სუფთა ადგილას.ექსტრემალური შემთხვევის წარმოშობის შემთხვევაში, როდესაც საჭიროა რეაგენტის ან მოწყობილობის ნაწილის უკან გადაწევა, ჯერ უნდა მოხდეს მისი დეკონტამინაცია 10% ნატრიუმის ჰიპოქლორიტით, შემდეგ კი სტერილური წყლით გაწმენდა.

შენიშვნა

ნატრიუმის ჰიპოქლორიტის 10%-იანი ხსნარი ყოველდღიურად სუფთა უნდა იყოს.დეკონტამინაციისთვის გამოყენებისას უნდა დაიცვან კონტაქტის მინიმალური დრო 10 წუთი.
ალტერნატიულად, კომერციულად ხელმისაწვდომი პროდუქტები, რომლებიც დადასტურებულია, როგორც დნმ-ის განადგურების ზედაპირის დეკონტამინანტები, შეიძლება გამოყენებულ იქნას, თუ ადგილობრივი უსაფრთხოების რეკომენდაციები არ იძლევა ნატრიუმის ჰიპოქლორიტის გამოყენებას ან თუ ნატრიუმის ჰიპოქლორიტი არ არის შესაფერისი აღჭურვილობის მეტალის ნაწილების დეკონტამინაციისთვის.

იდეალურ შემთხვევაში, პერსონალმა უნდა დაიცვას ცალმხრივი სამუშაო ნაკადის ეთოსი და არ დაბრუნდეს ბინძური ადგილებიდან (PCR-ის შემდგომ) სუფთა ადგილებზე (წინასწარ PCR) იმავე დღეს.თუმცა, შეიძლება იყოს შემთხვევები, როდესაც ეს გარდაუვალია.როდესაც ასეთი შემთხვევა წარმოიქმნება, პერსონალმა უნდა იზრუნოს ხელების კარგად დაბანაზე, ხელთათმანების გამოცვლაზე, დანიშნულ ლაბორატორიული ქურთუკის გამოყენებაზე და არ შემოიტანოს ისეთი აღჭურვილობა, რომლის გატანასაც ისურვებენ ოთახიდან, როგორიცაა ლაბორატორიული წიგნები.ასეთი კონტროლის ზომები უნდა იყოს ხაზგასმული მოლეკულურ მეთოდებზე პერსონალის ტრენინგის დროს.

გამოყენების შემდეგ, სკამების ადგილები უნდა გაიწმინდოს 10% ნატრიუმის ჰიპოქლორიტით (მოჰყვა სტერილური წყლით ნარჩენი გაუფერულების მოსაშორებლად), 70% ეთანოლით ან კომერციულად ხელმისაწვდომი დნმ-ის გამანადგურებელი დეკონტამინანტით.იდეალურ შემთხვევაში, ულტრაიისფერი (UV) ნათურები უნდა დამონტაჟდეს, რათა მოხდეს დასხივების დეკონტამინაცია.თუმცა, ულტრაიისფერი ნათურების გამოყენება უნდა შემოიფარგლოს დახურულ სამუშაო ადგილებზე, მაგ. უსაფრთხოების კაბინეტებში, რათა შეზღუდოს ლაბორატორიის პერსონალის ულტრაიისფერი სხივების ზემოქმედება.გთხოვთ, დაიცვან მწარმოებლის ინსტრუქციები UV ნათურის მოვლის, ვენტილაციისა და გაწმენდის შესახებ, რათა უზრუნველყოთ ნათურების ეფექტურობა.

ნატრიუმის ჰიპოქლორიტის ნაცვლად 70% ეთანოლის გამოყენების შემთხვევაში, ულტრაიისფერი შუქით დასხივება საჭირო იქნება დეკონტამინაციის დასასრულებლად.
არ გაასუფთავოთ მორევი და ცენტრიფუგა ნატრიუმის ჰიპოქლორიტით;ამის ნაცვლად, წაშალეთ 70% ეთანოლით და გაუშვით ულტრაიისფერი შუქის ქვეშ, ან გამოიყენეთ კომერციული დნმ-ის გამანადგურებელი დეკონტამინანტი.დაღვრაზე, მიმართეთ მწარმოებელს დასუფთავების შემდგომი რჩევისთვის.თუ მწარმოებლის ინსტრუქციები ამის საშუალებას იძლევა, პიპეტები რეგულარულად უნდა იყოს სტერილური ავტოკლავით.თუ პიპეტების ავტოკლავირება შეუძლებელია, საკმარისია მათი გაწმენდა 10% ნატრიუმის ჰიპოქლორიტით (მოჰყვება საფუძვლიანად გაწმენდა სტერილური წყლით) ან კომერციული დნმ-ის გამანადგურებელი დეკონტამინანტით, რასაც მოჰყვება ულტრაიისფერი სხივების ზემოქმედება.

მაღალი პროცენტული ნატრიუმის ჰიპოქლორიტით წმენდამ შესაძლოა საბოლოოდ დააზიანოს პიპეტის პლასტმასი და ლითონები, თუ ეს რეგულარულად ხდება;ჯერ შეამოწმეთ მწარმოებლის რეკომენდაციები.ყველა მოწყობილობა რეგულარულად უნდა დაკალიბრდეს მწარმოებლის მიერ რეკომენდებული გრაფიკის მიხედვით.დანიშნული პირი პასუხისმგებელი უნდა იყოს კალიბრაციის გრაფიკის დაცვაზე, დეტალური ჟურნალების შენახვაზე და აღჭურვილობაზე მკაფიოდ გამოსახული მომსახურების ეტიკეტები.

3. გამოყენებისა და დასუფთავების რჩევები დანიშნული მოლეკულური სივრცისთვის

წინასწარი PCR: რეაგენტის განაწილება/მასტერმიქსის მომზადება: ეს უნდა იყოს ყველაზე სუფთა ყველა სივრცეში, რომელიც გამოიყენება მოლეკულური ექსპერიმენტების მოსამზადებლად და იდეალურად უნდა იყოს დანიშნული ლამინარული ნაკადის კაბინეტი, რომელიც აღჭურვილია ულტრაიისფერი შუქით.ნიმუშები, ამოღებული ნუკლეინის მჟავა და გაძლიერებული PCR პროდუქტები არ უნდა იქნას დამუშავებული ამ ზონაში.ამპლიფიკაციის რეაგენტები უნდა ინახებოდეს საყინულეში (ან მაცივარში, მწარმოებლის რეკომენდაციების შესაბამისად) იმავე გამოყოფილ სივრცეში, იდეალურად ლამინირებული ნაკადის კაბინეტის ან წინასწარი PCR ზონის გვერდით.ხელთათმანები უნდა შეიცვალოს ყოველ ჯერზე წინასწარ PCR ზონაში ან ლამინარული ნაკადის კაბინეტში შესვლისას.

წინასწარი PCR ზონა ან ლამინირებული ნაკადის კაბინეტი უნდა გაიწმინდოს გამოყენებამდე და მის შემდეგ შემდეგნაირად: გაწმინდეთ კაბინეტის ყველა ელემენტი, მაგ. კომერციული დნმ-ის დამღუპველი დეკონტამინანტი და მიეცით საშუალება გაშრეს.დახურული სამუშაო ადგილის შემთხვევაში, მაგ., ლამინირებული ნაკადის კაბინეტი, გახსენით გამწოვი UV შუქზე 30 წუთის განმავლობაში.

შენიშვნა

არ დაუშვათ რეაგენტები ულტრაიისფერი შუქის ქვეშ;გადაიტანეთ ისინი კაბინეტში მხოლოდ მას შემდეგ, რაც ის სუფთაა.თუ ახორციელებთ PCR-ის საპირისპირო ტრანსკრიფციას, ასევე შეიძლება სასარგებლო იყოს ზედაპირებისა და აღჭურვილობის წაშლა ხსნარით, რომელიც არღვევს RNase-ებს კონტაქტის დროს.ეს ხელს შეუწყობს რნმ-ის ფერმენტის დეგრადაციის ცრუ-უარყოფითი შედეგების თავიდან აცილებას.დეკონტამინაციის შემდეგ და მასტერმიქსის მომზადებამდე ხელთათმანები კიდევ ერთხელ უნდა შეიცვალოს და შემდეგ კარადა მზად არის გამოსაყენებლად.

Pre-PCR: ნუკლეინის მჟავის ექსტრაქცია/თარგის დამატება:

ნუკლეინის მჟავის მოპოვება და დამუშავება უნდა მოხდეს მეორე დანიშნულ ადგილას, პიპეტების ცალკე ნაკრების, ფილტრის წვერების, მილების თაროების, ახალი ხელთათმანების, ლაბორატორიული ხალათების და სხვა აღჭურვილობის გამოყენებით. მასტერმიქსის მილები ან ფირფიტები.მოპოვებული ნუკლეინის მჟავის ნიმუშების დაბინძურების თავიდან ასაცილებლად, რომლებიც ანალიზდება, რეკომენდებულია ხელთათმანების გამოცვლა დადებითი კონტროლის ან სტანდარტების გამოყენებამდე და პიპეტების ცალკე ნაკრების გამოყენება.PCR რეაგენტები და გაძლიერებული პროდუქტები არ უნდა იყოს პიპეტირება ამ ადგილას.ნიმუშები უნდა ინახებოდეს დანიშნულ მაცივარში ან საყინულეში იმავე ადგილას.ნიმუშის სამუშაო ადგილი უნდა გაიწმინდოს ისევე, როგორც მასტერმიქსის სივრცე.

Post-PCR: გაძლიერება და გაძლიერებული პროდუქტის დამუშავება

ეს გამოყოფილი სივრცე განკუთვნილია გაძლიერების შემდგომი პროცესებისთვის და ფიზიკურად უნდა იყოს განცალკევებული წინასწარი PCR უბნებისგან.ის ჩვეულებრივ შეიცავს თერმოციკლერებს და რეალურ დროში პლატფორმებს და იდეალურად უნდა ჰქონდეს ლამინირებული ნაკადის კაბინეტი 1 მრგვალი PCR პროდუქტის მეორე რაუნდის რეაქციაში დასამატებლად, თუ ჩადგმული PCR ჩადგმულია.PCR რეაგენტები და ექსტრაქტული ნუკლეინის მჟავა არ უნდა იქნას დამუშავებული ამ ადგილას, რადგან დაბინძურების რისკი მაღალია.ამ ზონას უნდა ჰქონდეს ხელთათმანების ცალკე ნაკრები, ლაბორატორიული ქურთუკები, ფირფიტებისა და მილების თაროები, პიპეტები, ფილტრის წვერები, ურნები და სხვა აღჭურვილობა.გახსნამდე მილები უნდა იყოს ცენტრიფუგირებული.ნიმუშის სამუშაო ადგილი უნდა გაიწმინდოს ისევე, როგორც მასტერმიქსის სივრცე.

Post-PCR: პროდუქტის ანალიზი

ეს ოთახი განკუთვნილია პროდუქტის აღმოჩენის აღჭურვილობისთვის, მაგ., გელის ელექტროფორეზის ავზები, დენის პაკეტები, ულტრაიისფერი ტრანსილუმინატორი და გელის დოკუმენტაციის სისტემა.ამ ზონას უნდა ჰქონდეს ხელთათმანების ცალკე კომპლექტი, ლაბორატორიული ხალათი, ფირფიტებისა და მილების თაროები, პიპეტები, ფილტრის წვერები, ურნები და სხვა აღჭურვილობა.სხვა რეაგენტების შეტანა არ შეიძლება ამ ზონაში, ჩატვირთვის საღებავის, მოლეკულური მარკერის და აგაროზის გელის და ბუფერული კომპონენტების გარდა.ნიმუშის სამუშაო ადგილი უნდა გაიწმინდოს ისევე, როგორც მასტერმიქსის სივრცე.

Მნიშვნელოვანი ჩანაწერი

იდეალურ შემთხვევაში, წინასწარ PCR ოთახებში არ უნდა შევიდეთ იმავე დღეს, თუ სამუშაო უკვე შესრულებულია პოსტ-PCR ოთახებში.თუ ეს სრულიად გარდაუვალია, დარწმუნდით, რომ ხელები ჯერ კარგად დაიბანეთ და ოთახებში სპეციალური ლაბორატორიული ხალათები ჩაიცვათ.ლაბორატორიული წიგნები და საბუთები არ უნდა იქნას შეტანილი წინასწარ PCR ოთახებში, თუ ისინი გამოიყენებოდა პოსტ PCR ოთახებში;საჭიროების შემთხვევაში, აიღეთ პროტოკოლების/ნიმუშების ID-ების დუბლიკატი და ა.შ.

4. ზოგადი მოლეკულური ბიოლოგიის რჩევა

გამოიყენეთ ფხვნილისგან თავისუფალი ხელთათმანები, რათა თავიდან აიცილოთ ანალიზის დათრგუნვა.პიპეტინგის სწორი ტექნიკა გადამწყვეტია დაბინძურების შესამცირებლად.არასწორმა პიპეტინგმა შეიძლება გამოიწვიოს სითხეების გაცემისას დაღვრა და აეროზოლების წარმოქმნა.სწორი პიპეტინგის კარგი პრაქტიკა შეგიძლიათ იხილოთ შემდეგ ბმულებზე: Gilson-ის გზამკვლევი პიპეტინგის შესახებ, Anachem-ის პიპეტინგის ტექნიკის ვიდეოები, ცენტრიფუგა მილები გახსნამდე და ფრთხილად გახსენით, რათა თავიდან აიცილოთ გადაყრა.დახურეთ მილები გამოყენების შემდეგ დაუყოვნებლივ, რათა თავიდან აიცილოთ დამაბინძურებლების შეყვანა.

მრავალჯერადი რეაქციის შესრულებისას მოამზადეთ ერთი მასტერმიქსი, რომელიც შეიცავს საერთო რეაგენტებს (მაგ. წყალი, dNTPs, ბუფერი, პრაიმერები და ფერმენტები), რათა მინიმუმამდე დაიყვანოთ რეაგენტის გადატანის რაოდენობა და შემცირდეს დაბინძურების საფრთხე.რეკომენდირებულია მასტერმიქსის დაყენება ყინულზე ან ცივ ბლოკზე.Hot Start ფერმენტის გამოყენებამ შეიძლება ხელი შეუწყოს არასპეციფიკური პროდუქტების წარმოების შემცირებას.დაიცავით ფლუორესცენტური ზონდების შემცველი რეაგენტები სინათლისგან, რათა თავიდან აიცილოთ დეგრადაცია.

5. შიდა კონტროლი

ჩართეთ კარგად დახასიათებული, დადასტურებული დადებითი და უარყოფითი კონტროლი, ყველა რეაქციაში შაბლონის გარეშე კონტროლთან ერთად და რაოდენობრივი რეაქციებისთვის მრავალპუნქტიანი ტიტრირებული ტენდენციის ხაზი.დადებითი კონტროლი არ უნდა იყოს ისეთი ძლიერი, რომ დაბინძურების რისკს წარმოადგენდეს.ნუკლეინის მჟავას ექსტრაქციის შესრულებისას ჩართეთ ექსტრაქციის დადებითი და უარყოფითი კონტროლი.

რეკომენდირებულია მკაფიო ინსტრუქციების განთავსება თითოეულ სფეროში, რათა მომხმარებლებმა იცოდნენ ქცევის წესები.სადიაგნოსტიკო ლაბორატორიებს, რომლებიც აღმოაჩენენ დნმ-ის ან რნმ-ის ძალიან დაბალ დონეს კლინიკურ ნიმუშებში, შეიძლება მოისურვონ უსაფრთხოების დამატებითი ზომების მიღება, რომ ჰქონდეთ ჰაერის დამუშავების ცალკეული სისტემები, ოდნავ დადებითი ჰაერის წნევით წინასწარ PCR ოთახებში და ოდნავ უარყოფითი ჰაერის წნევით პოსტ-PCR ოთახებში.

და ბოლოს, ხარისხის უზრუნველყოფის (QA) გეგმის შემუშავება სასარგებლოა.ასეთი გეგმა უნდა შეიცავდეს რეაგენტის ძირითადი მარაგებისა და სამუშაო მარაგების სიებს, კომპლექტებისა და რეაგენტების შენახვის წესებს, კონტროლის შედეგების მოხსენებას, პერსონალის მომზადების პროგრამებს, პრობლემების მოგვარების ალგორითმებს და საჭიროების შემთხვევაში გამოსასწორებელ ქმედებებს.

6. ბიბლიოგრაფია

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. თავი 3: qPCR ლაბორატორიის დაყენება.სახელმძღვანელო დოკუმენტი რეკრეაციული წყლების შესამოწმებლად USEPA qPCR მეთოდის გამოყენებით 1611. Lansing- Michigan State University.

საზოგადოებრივი ჯანდაცვა ინგლისი, NHS.გაერთიანებული სამეფოს სტანდარტები მიკრობიოლოგიური გამოკვლევებისთვის: კარგი ლაბორატორიული პრაქტიკა მოლეკულური ამპლიფიკაციის ანალიზის შესრულებისას).ხარისხის სახელმძღვანელო.2013; 4 (4): 1–15.

Mifflin T. PCR ლაბორატორიის დაყენება.Cold Spring Harb Protoc.2007; 7.

Schroeder S 2013. ცენტრიფუგების რუტინული მოვლა: ცენტრიფუგების, როტორების და გადამყვანების გაწმენდა, მოვლა და დეზინფექცია (თეთრი ქაღალდი No14).ჰამბურგი: ეპენდორფი;2013 წელი.

Viana RV, Wallis CL.კარგი კლინიკური ლაბორატორიული პრაქტიკა (GCLP) მოლეკულური დაფუძნებული ტესტებისთვის, რომლებიც გამოიყენება დიაგნოსტიკურ ლაბორატორიებში, In: Akyar I, რედაქტორი.ხარისხის კონტროლის ფართო სპექტრი.რიეკა, ხორვატია: Intech;2011: 29–52.