Cara deteksi molekuler nduweni kemampuan kanggo ngasilake asam nukleat kanthi volume gedhe liwat amplifikasi jumlah jejak sing ditemokake ing conto.Nalika iki mupangati kanggo ngaktifake deteksi sensitif, nanging uga ngenalake kemungkinan kontaminasi liwat panyebaran aerosol amplifikasi ing lingkungan laboratorium.Nalika nindakake eksperimen, langkah-langkah bisa ditindakake kanggo ngindhari kontaminasi reagen, peralatan laboratorium lan ruang bangku, amarga kontaminasi kasebut bisa ngasilake asil positif palsu (utawa negatif palsu).

Kanggo nyuda kemungkinan kontaminasi, Praktek Laboratorium sing Apik kudu ditindakake saben wektu.Khusus, pancegahan kudu ditindakake babagan poin ing ngisor iki:

1. Nangani reagen
2. Organisasi ruang kerja lan peralatan
3. Saran panggunaan lan reresik kanggo papan molekul sing wis ditemtokake
4. Saran biologi molekuler umum
5. Kontrol internal
6. Daftar Pustaka

1. Nangani reagen

Sedhela centrifuge tabung reagen sadurunge mbukak kanggo nyegah generasi aerosol.Reagen Aliquot kanggo ngindhari pirang-pirang beku-thaws lan kontaminasi saham master.Cetha label lan tanggal kabeh tabung reagen lan reaksi lan njaga log jumlah reagen lan nomer batch sing digunakake ing kabeh eksperimen.Pipet kabeh reagen lan conto nggunakake tips filter.Sadurunge tuku, disaranake konfirmasi karo pabrikan yen tips filter pas karo merek pipette sing bakal digunakake.

2. Organisasi ruang kerja lan peralatan

Ruang kerja kudu diatur kanggo mesthekake yen aliran kerja dumadi ing siji arah, saka wilayah sing resik (pre-PCR) menyang wilayah sing reged (post-PCR).Pancegahan umum ing ngisor iki bakal mbantu nyuda kemungkinan kontaminasi.Nduwe kamar sing kapisah, utawa paling sethithik wilayah sing kapisah sacara fisik, kanggo: nyiapake mastermix, ekstraksi asam nukleat lan tambahan cithakan DNA, amplifikasi lan penanganan produk amplifikasi, lan analisis produk, contone, elektroforesis gel.

Ing sawetara setelan, duwe 4 kamar kapisah angel.Pilihan sing bisa nanging kurang dikarepake yaiku nindakake persiapan mastermix ing area penahanan, contone kabinet aliran laminar.Ing kasus amplifikasi PCR bersarang, persiapan mastermix kanggo reaksi babak kapindho kudu disiapake ing wilayah 'resik' kanggo nyiapake mastermix, nanging inokulasi karo produk PCR utama kudu ditindakake ing kamar amplifikasi, lan yen bisa. ing area wadhah khusus (contone kabinet aliran laminar).

Saben kamar/wilayah perlu pesawat kapisah saka pipettes cetha labeled, tips Filter, rak tabung, vortexes, centrifuges (yen cocog), pena, reagen lab generik, jas lab lan kothak sarung tangan sing bakal tetep ing workstations.Tangan kudu wisuh lan sarung tangan lan jas lab diganti nalika pindhah ing antarane wilayah sing wis ditemtokake.Reagen lan peralatan ora kena dipindhah saka wilayah sing reged menyang wilayah sing resik.Yen ana kasus sing ekstrem nalika reagen utawa piranti kudu dipindhah mundur, mula kudu didekontaminasi nganggo natrium hipoklorit 10%, banjur diusap nganggo banyu steril.

Cathetan

Solusi natrium hipoklorit 10% kudu digawe seger saben dina.Nalika digunakake kanggo dekontaminasi, wektu kontak minimal 10 menit kudu dipatuhi.
Utawa, produk sing kasedhiya kanthi komersial sing divalidasi minangka dekontaminasi permukaan sing ngrusak DNA bisa digunakake yen rekomendasi safety lokal ora ngidini panggunaan sodium hipoklorit utawa yen natrium hipoklorit ora cocok kanggo dekontaminasi bagean logam peralatan.

Saenipun, staf kudu netepi etos aliran kerja searah lan ora lunga saka wilayah reged (pasca-PCR) bali menyang wilayah sing resik (pra-PCR) ing dina sing padha.Nanging, bisa uga ana kedadeyan sing ora bisa dihindari.Yen kedadeyan kasebut, personel kudu ngumbah tangan kanthi lengkap, ngganti sarung tangan, nggunakake jas lab sing wis ditemtokake lan ora ngenalake peralatan apa wae sing pengin digawa metu saka ruangan maneh, kayata buku lab.Langkah-langkah kontrol kasebut kudu ditekanake ing latihan staf babagan metode molekuler.

Sawise digunakake, ruang bangku kudu diresiki nganggo natrium hipoklorit 10% (diterusake banyu steril kanggo mbusak sisa pemutih), etanol 70%, utawa dekontaminasi sing bisa ngrusak DNA sing wis divalidasi.Saenipun, lampu ultra-violet (UV) kudu dipasang kanggo ngaktifake dekontaminasi kanthi iradiasi.Nanging, panggunaan lampu UV kudu diwatesi ing wilayah kerja sing ditutup, contone, lemari safety, kanggo mbatesi paparan UV staf laboratorium.Mangga manut instruksi pabrik kanggo perawatan lampu UV, ventilasi lan reresik supaya lampu tetep efektif.

Yen nggunakake etanol 70% tinimbang natrium hipoklorit, iradiasi nganggo sinar UV bakal dibutuhake kanggo ngrampungake dekontaminasi.
Aja ngresiki vortex lan centrifuge karo sodium hypochlorite;tinimbang, ngilangke mudhun karo 70% etanol lan mbabarake cahya UV, utawa nggunakake komersial decontaminant ngrusak DNA.Kanggo tumpahan, priksa karo pabrikan kanggo saran reresik luwih lanjut.Yen instruksi pabrik ngidini, pipettes kudu disterilisasi kanthi autoklaf.Yen pipette ora bisa diautoklaf, cukup kanggo ngresiki nganggo 10% natrium hipoklorit (diterusake kanthi ngilangke kanthi banyu steril) utawa nganggo dekontaminasi komersial sing ngrusak DNA sing diterusake kanthi paparan UV.

Reresik nganggo sodium hypochlorite kanthi persentase dhuwur bisa ngrusak plastik lan logam pipet yen ditindakake kanthi rutin;priksa rekomendasi saka pabrikan dhisik.Kabeh peralatan kudu dikalibrasi kanthi rutin miturut jadwal sing disaranake pabrikan.Wong sing ditunjuk kudu tanggung jawab kanggo mesthekake yen jadwal kalibrasi dipatuhi, log rinci dijaga, lan label layanan ditampilake kanthi jelas ing peralatan.

3. Saran panggunaan lan reresik kanggo papan molekul sing wis ditemtokake

Pre-PCR: Reagen aliquoting / mastermix preparation: Iki kudu paling resik saka kabeh spasi digunakake kanggo nyiapake eksperimen molekul lan saenipun kudu kabinèt aliran laminar ditetepake dilengkapi karo cahya UV.Sampel, asam nukleat sing diekstrak lan produk PCR sing digedhekake ora kudu ditangani ing wilayah kasebut.Reagen amplifikasi kudu disimpen ing mesin pembeku (utawa kulkas, miturut rekomendasi pabrikan) ing papan sing padha, saenipun ing jejere kabinet aliran laminar utawa area pra-PCR.Sarung tangan kudu diganti saben wektu mlebu ing area pra-PCR utawa kabinet aliran laminar.

Area pra-PCR utawa kabinet aliran laminar kudu diresiki sadurunge lan sawise digunakake kaya ing ngisor iki: Ngilangke kabeh item ing lemari, contone pipettes, kothak tip, vortex, centrifuge, rak tabung, pulpen, lan sapiturute karo 70% etanol utawa a decontaminant ngrusak DNA komersial, lan ngidini garing.Ing kasus area kerja sing ditutup, contone lemari aliran laminar, ndhelikake hood ing sinar UV suwene 30 menit.

Cathetan

Aja mbukak reagen kanggo sinar UV;mung pindhah menyang lemari yen wis resik.Yen nindakake PCR transkripsi mbalikke, bisa uga migunani kanggo ngilangke permukaan lan peralatan kanthi solusi sing ngrusak RNases nalika kontak.Iki bisa mbantu supaya asil negatif palsu saka degradasi enzim RNA.Sawise dekontaminasi lan sadurunge nyiapake mastermix, sarung tangan kudu diganti maneh, banjur lemari siap digunakake.

Pra-PCR: Ekstraksi asam nukleat/tambahan template:

Asam nukleat kudu diekstrak lan ditangani ing wilayah sing ditunjuk kaping pindho, nggunakake set pipette sing kapisah, tips filter, rak tabung, sarung tangan seger, jas lab lan peralatan liyane. Wilayah iki uga kanggo tambahan cithakan, kontrol lan garis tren menyang tabung mastermix utawa piring.Kanggo ngindhari kontaminasi conto asam nukleat sing diekstrak sing lagi dianalisis, disaranake ngganti sarung tangan sadurunge nangani kontrol utawa standar positif lan nggunakake set pipet sing kapisah.Reagen PCR lan produk amplified ora kudu pipetted ing wilayah iki.Sampel kudu disimpen ing kulkas utawa freezer sing wis ditemtokake ing wilayah sing padha.Ruang kerja sampel kudu diresiki kanthi cara sing padha karo ruang mastermix.

Post-PCR: Amplifikasi lan nangani produk sing digedhekake

Ruang sing ditemtokake iki kanggo proses pasca amplifikasi lan kudu dipisahake sacara fisik saka wilayah pra-PCR.Biasane ngemot thermocyclers lan platform nyata-wektu, lan saenipun kudu kabinèt aliran laminar kanggo nambah babak 1 produk PCR kanggo babak 2 reaksi, yen nested PCR lagi dileksanakake.Reagen PCR lan asam nukleat sing diekstrak ora kudu ditangani ing wilayah iki amarga risiko kontaminasi dhuwur.Wilayah iki kudu duwe sarung tangan sing kapisah, jas lab, rak piring lan tabung, pipette, tips filter, tong sampah lan peralatan liyane.Tabung kudu centrifuge sadurunge mbukak.Ruang kerja sampel kudu diresiki kanthi cara sing padha karo ruang mastermix.

Post-PCR: analisis produk

Kamar iki kanggo peralatan deteksi produk, contone, tank elektroforesis gel, paket daya, transilluminator UV lan sistem dokumentasi gel.Wilayah iki kudu duwe set sarung tangan, jas lab, rak piring lan tabung, pipette, tips filter, tong sampah lan peralatan liyane.Ora ana reagen liyane sing bisa digawa menyang wilayah iki, ora kalebu pewarna muatan, penanda molekuler lan gel agarose, lan komponen buffer.Ruang kerja sampel kudu diresiki kanthi cara sing padha karo ruang mastermix.

Cathetan penting

Saenipun, kamar pra-PCR ngirim ora mlebu ing dina sing padha yen karya wis dileksanakake ing kamar post-PCR.Yen iki pancene ora bisa diendhani, priksa manawa tangan wis dikumbah kanthi bener lan jas lab khusus digunakake ing kamar.Buku lan dokumen laboratorium ora kudu digawa menyang kamar pra-PCR yen wis digunakake ing kamar pasca-PCR;yen perlu, njupuk duplikat print-out saka protokol / ID sampel, etc.

4. Saran biologi molekuler umum

Gunakake sarung tangan tanpa bubuk kanggo nyegah inhibisi tes.Teknik pipetting sing bener penting banget kanggo nyuda kontaminasi.Pipet sing salah bisa nyebabake cipratan nalika nyebarake cairan lan nggawe aerosol.Praktek apik kanggo pipetting bener bisa ditemokaké ing pranala ing ngisor iki: Gilson guide kanggo pipetting, video technique pipetting Anachem, tabung Centrifuge sadurunge mbukak, lan mbukak kasebut kanthi teliti, supaya splashing.Nutup tabung sanalika sawise digunakake kanggo nyegah introduksi rereged.

Nalika nindakake pirang-pirang reaksi, nyiyapake siji mastermix sing ngemot reagen umum (umpamane banyu, dNTP, buffer, primer lan enzim) kanggo nyilikake jumlah transfer reagen lan nyuda ancaman kontaminasi.Dianjurake kanggo nyiyapake mastermix ing es utawa blok kadhemen.Panganggone enzim Hot Start bisa mbantu nyuda produksi produk non-spesifik.Nglindhungi reagen sing ngemot probe fluoresensi saka cahya kanggo nyegah degradasi.

5. Kontrol internal

Kalebu kontrol positif lan negatif sing ditondoi kanthi apik, dikonfirmasi, bebarengan karo kontrol tanpa template ing kabeh reaksi, lan garis tren titrasi multi-titik kanggo reaksi kuantitatif.Kontrol positif ngirim ora kuwat banget sing nyebabake risiko kontaminasi.Kalebu kontrol ekstraksi positif lan negatif nalika nindakake ekstraksi asam nukleat.

Disaranake supaya instruksi sing jelas dikirim ing saben wilayah supaya pangguna ngerti aturan tumindak.Laboratorium diagnostik sing ndeteksi tingkat DNA utawa RNA sing sithik banget ing conto klinis bisa uga pengin nggunakake ukuran keamanan tambahan kanggo duwe sistem penanganan udara sing kapisah kanthi tekanan udara sing rada positif ing kamar pra-PCR lan tekanan udara sing rada negatif ing kamar pasca-PCR.

Pungkasan, ngembangake rencana jaminan kualitas (QA) mbiyantu.Rencana kasebut kudu kalebu dhaptar saham master reagen lan saham kerja, aturan kanggo nyimpen kit lan reagen, nglaporake asil kontrol, program latihan staf, algoritma pemecahan masalah, lan tindakan remedial yen perlu.

6. Daftar Pustaka

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Bab 3: Nggawe laboratorium qPCR.Dokumen pandhuan kanggo nguji banyu rekreasi nggunakake metode USEPA qPCR 1611. Lansing- Michigan State University.

Kesehatan Masyarakat Inggris, NHS.Standar UK kanggo investigasi mikrobiologi: Praktek Laboratorium sing Apik nalika nindakake tes amplifikasi molekuler).Pedoman Mutu.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Nggawe laboratorium PCR.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Pangopènan rutin centrifuges: reresik, pangopènan lan disinfeksi centrifuges, rotor lan adaptor (kertas putih No. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) kanggo tes adhedhasar molekuler digunakake ing laboratorium diagnostik, Ing: Akyar I, editor.Spektrum kontrol kualitas sing amba.Rijeka, Kroasia: Intech;2011: 29–52.