分子検出法には、サンプル中に含まれる微量の核酸を増幅して大量の核酸を生成する機能があります。これは高感度の検出を可能にするのに有益ですが、実験室環境での増幅エアロゾルの拡散による汚染の可能性ももたらします。実験を実施する場合、試薬、実験器具、実験台スペースの汚染は偽陽性 (または偽陰性) 結果を引き起こす可能性があるため、その汚染を避けるための措置を講じることができます。

汚染の可能性を減らすために、適正検査基準を常に実施する必要があります。具体的には以下の点に注意が必要です。

1. 試薬の取り扱い
2. 作業スペースと設備の構成
3. 指定された分子空間の使用および洗浄に関するアドバイス
4. 分子生物学に関する一般的なアドバイス
5. 内部統制
6. 参考文献

1. 試薬の取り扱い

エアロゾルの発生を避けるため、開封前に試薬チューブを簡単に遠心分離してください。複数回の凍結融解やマスターストックの汚染を避けるために、試薬をアリコートに分けてください。すべての試薬と反応チューブに明確にラベルと日付を付け、すべての実験で使用した試薬のロット番号とバッチ番号のログを保管します。フィルターチップを使用して、すべての試薬とサンプルをピペットで移します。購入する前に、フィルターチップが使用するピペットのブランドに適合するかメーカーに確認することをお勧めします。

2. 作業スペースと設備の構成

ワークスペースは、作業の流れがクリーンエリア (PCR 前) からダーティエリア (PCR 後) まで一方向に行われるように編成する必要があります。以下の一般的な予防策は、汚染の可能性を減らすのに役立ちます。マスターミックスの調製、核酸抽出と DNA テンプレートの添加、増幅と増幅産物の取り扱い、ゲル電気泳動などの産物分析のために、別の指定された部屋、または少なくとも物理的に別のエリアを用意します。

状況によっては、4 つの別々の部屋を用意することが困難です。可能ではありますが、あまり望ましくないオプションは、層流キャビネットなどの封じ込めエリアでマスターミックスの準備を行うことです。ネステッド PCR 増幅の場合、2 回目の反応のためのマスターミックスの準備は、マスターミックス調製用の「クリーン」エリアで準備する必要がありますが、一次 PCR 産物の接種は増幅室で行う必要があり、可能であれば、専用の封じ込めエリア（層流キャビネットなど）内。

各部屋/エリアには、明確にラベルが貼られたピペット、フィルターチップ、チューブラック、ボルテックス、遠心分離機 (該当する場合)、ペン、一般的な実験用試薬、白衣、およびそれぞれのワークステーションに置いておく手袋の箱の個別のセットが必要です。指定されたエリア間を移動するときは、手を洗い、手袋と白衣を交換する必要があります。試薬と装置は汚れたエリアから清潔なエリアに移動させないでください。試薬や装置を後方に移動する必要があるという極端な場合には、まず 10% 次亜塩素酸ナトリウムで汚染除去し、次に滅菌水で拭き取る必要があります。

ノート

10% 次亜塩素酸ナトリウム溶液は毎日新しく調製する必要があります。除染に使用する場合は、少なくとも 10 分間の接触時間を遵守する必要があります。
あるいは、地域の安全勧告で次亜塩素酸ナトリウムの使用が許可されていない場合、または次亜塩素酸ナトリウムが機器の金属部分の除染に適していない場合は、DNA 破壊表面除染剤として検証された市販の製品を使用できます。

理想的には、スタッフは一方向のワークフロー精神を遵守し、同じ日にダーティ エリア (PCR 後) からクリーン エリア (PCR 前) に戻らないようにする必要があります。ただし、やむを得ない場合もございます。このような機会が生じた場合、担当者は、手洗い、手袋の交換、指定された白衣の着用を徹底し、実験図書などの再び部屋の外に持ち出したい器具を持ち込まないよう注意しなければなりません。このような管理手段は、分子的手法に関するスタッフのトレーニングにおいて強調されるべきである。

使用後、ベンチスペースは 10% 次亜塩素酸ナトリウム (残留漂白剤を除去するために滅菌水)、70% エタノール、または検証済みの市販の DNA 破壊除染剤で洗浄する必要があります。理想的には、照射による汚染除去を可能にするために紫外線 (UV) ランプを取り付ける必要があります。ただし、研究室スタッフの UV 曝露を制限するために、UV ランプの使用は安全キャビネットなどの密閉された作業エリアに限定する必要があります。ランプの効果を維持するために、UV ランプの手入れ、換気、および清掃に関するメーカーの指示に従ってください。

次亜塩素酸ナトリウムの代わりに 70% エタノールを使用する場合、除染を完了するには UV 光の照射が必要になります。
次亜塩素酸ナトリウムでボルテックスや遠心分離機を洗浄しないでください。代わりに、70% エタノールで拭いて紫外線に当てるか、市販の DNA 破壊除染剤を使用してください。こぼれた場合は、製造元に詳しい洗浄のアドバイスを確認してください。メーカーの指示で許可されている場合は、ピペットを定期的にオートクレーブで滅菌する必要があります。ピペットをオートクレーブ滅菌できない場合は、10% 次亜塩素酸ナトリウム (その後滅菌水で徹底的に拭き取る) でピペットを洗浄するか、市販の DNA 破壊除染剤で洗浄した後に UV に曝すだけで十分です。

高濃度次亜塩素酸ナトリウムによる洗浄を定期的に行うと、最終的にピペットのプラスチックや金属が損傷する可能性があります。まずメーカーの推奨事項を確認してください。すべての機器は、メーカーが推奨するスケジュールに従って定期的に校正する必要があります。指定された担当者が、校正スケジュールが遵守され、詳細なログが維持され、機器にサービス ラベルが明確に表示されるようにする責任を負う必要があります。

3. 指定された分子空間の使用および洗浄に関するアドバイス

PCR前: 試薬の分注/マスターミックスの準備: これは、分子実験の準備に使用されるすべてのスペースの中で最も清潔である必要があり、理想的には、UV ライトを備えた指定された層流キャビネットである必要があります。サンプル、抽出された核酸、および増幅された PCR 産物は、このエリアで扱ってはなりません。増幅試薬は、冷凍庫 (メーカーの推奨に従って冷蔵庫) 内の同じ指定スペース、理想的には層流キャビネットまたは PCR 前エリアの隣に保管する必要があります。手袋は、PCR 前エリアまたは層流キャビネットに入るたびに交換する必要があります。

PCR 前エリアまたは層流キャビネットは、使用の前後に次のように清掃する必要があります。キャビネット内のすべてのアイテム (ピペット、チップ ボックス、ボルテックス、遠心分離機、チューブラック、ペンなど) を 70% エタノールまたはアルコールで拭きます。市販の DNA 破壊除染剤を使用し、乾燥させます。閉じた作業エリア (例: 層流キャビネット) の場合は、フードを UV 光に 30 分間さらします。

ノート

試薬を紫外線にさらさないでください。キャビネットがきれいになってからのみキャビネットに移動してください。逆転写 PCR を実行する場合は、接触すると RNase を分解する溶液で表面や機器を拭き取ることも役立つ場合があります。これは、RNA の酵素分解による偽陰性の結果を回避するのに役立つ可能性があります。除染後、マスターミックスを準備する前に、手袋をもう一度交換する必要があります。そうすれば、キャビネットはすぐに使用できるようになります。

Pre-PCR: 核酸抽出/テンプレートの追加:

核酸は、ピペット、フィルターチップ、チューブラック、新しい手袋、白衣、その他の機器の別のセットを使用して、2 番目に指定されたエリアで抽出および処理する必要があります。このエリアは、テンプレート、コントロール、トレンドラインをサンプルに追加するためのエリアでもあります。マスターミックスチューブまたはプレート。分析中の抽出核酸サンプルの汚染を避けるために、ポジティブコントロールまたは標準を取り扱う前に手袋を交換し、別のピペットセットを使用することをお勧めします。PCR 試薬および増幅産物をこのエリアでピペッティングしないでください。サンプルは同じエリアの指定された冷蔵庫または冷凍庫に保管する必要があります。サンプルワークスペースは、マスターミックススペースと同じ方法でクリーンアップする必要があります。

PCR後: 増幅と増幅産物の取り扱い

この指定されたスペースは増幅後のプロセス用であり、PCR 前の領域から物理的に分離されている必要があります。通常、これにはサーモサイクラーとリアルタイム プラットフォームが含まれており、理想的には、ネステッド PCR が実行されている場合、ラウンド 1 PCR 産物をラウンド 2 反応に追加するための層流キャビネットが必要です。PCR 試薬および抽出された核酸は、汚染の危険性が高いため、このエリアで取り扱わないでください。このエリアには、手袋、白衣、プレートラック、チューブラック、ピペット、フィルターチップ、容器、その他の機器の個別のセットが必要です。チューブは開封前に遠心分離する必要があります。サンプルワークスペースは、マスターミックススペースと同じ方法でクリーンアップする必要があります。

PCR後: 製品分析

この部屋は、ゲル電気泳動タンク、パワーパック、UV トランスイルミネーター、ゲル文書化システムなどの製品検出装置用です。このエリアには、手袋、白衣、プレートラック、チューブラック、ピペット、フィルターチップ、ビン、その他の機器を個別に用意する必要があります。ローディング色素、分子マーカー、アガロースゲル、およびバッファー成分を除き、他の試薬をこのエリアに持ち込むことはできません。サンプルワークスペースは、マスターミックススペースと同じ方法でクリーンアップする必要があります。

重要な注意点

理想的には、PCR 後室で作業がすでに行われている場合は、PCR 前室に同日に入るべきではありません。これが完全に避けられない場合は、まず手を徹底的に洗い、室内では特定の白衣を着用するようにしてください。検査用の書籍や書類が PCR 後室で使用されている場合は、PCR 前室に持ち込んではなりません。必要に応じて、プロトコル/サンプル ID などを印刷してコピーしてください。

4. 分子生物学に関する一般的なアドバイス

アッセイの阻害を避けるために、パウダーフリーの手袋を使用してください。汚染を軽減するには、正しいピペッティング技術が最も重要です。ピペッティングが正しくないと、液体を分注するときに飛沫が発生したり、エアロゾルが発生したりする可能性があります。正しいピペッティングの優れた実践方法については、次のリンクを参照してください: Gilson のピペッティング ガイド、Anachem のピペッティング テクニック ビデオ、チューブを開く前に遠心分離し、飛散を避けるために慎重にチューブを開けてください。汚染物質の侵入を避けるため、使用後はすぐにチューブを閉めてください。

複数の反応を実行する場合は、試薬の移動回数を最小限に抑え、汚染の脅威を軽減するために、一般的な試薬 (水、dNTP、バッファー、プライマー、酵素など) を含む 1 つのマスターミックスを準備します。マスターミックスを氷またはコールドブロック上にセットアップすることをお勧めします。ホットスタート酵素の使用は、非特異的な生成物の生成を減らすのに役立つ場合があります。蛍光プローブを含む試薬は劣化を避けるために光から保護してください。

5. 内部統制

十分に特徴付けされ、確認されたポジティブおよびネガティブコントロールに加え、すべての反応におけるテンプレートなしのコントロール、および定量的反応のマルチポイント滴定トレンドラインが含まれます。陽性対照は、汚染のリスクを引き起こすほど強力であってはなりません。核酸抽出を実行する場合は、ポジティブおよびネガティブの抽出コントロールを含めます。

ユーザーが行動規則を認識できるように、各エリアに明確な指示を掲載することをお勧めします。臨床サンプルから非常に低レベルの DNA または RNA を検出した診断ラボでは、PCR 前室ではわずかに正の空気圧、PCR 後室ではわずかに負の空気圧となる個別の空気処理システムを設置するという追加の安全対策を採用することが必要になる場合があります。

最後に、品質保証 (QA) 計画を作成することが役立ちます。このような計画には、試薬マスターストックと作業ストックのリスト、キットと試薬の保管規則、管理結果の報告、スタッフトレーニングプログラム、トラブルシューティングアルゴリズム、および必要な場合の是正措置を含める必要があります。

6. 参考文献

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ヴィアナRV、ウォリスCL。診断研究所で使用される分子ベースの検査に関する適正臨床検査基準 (GCLP)、著者: Akyar I、編集者。幅広い品質管理。リエカ、クロアチア：インテック。2011: 29–52。