לשיטות זיהוי מולקולריות יש את היכולת לייצר נפח גדול של חומצת גרעין באמצעות הגברה של כמויות עקבות שנמצאו בדגימות.למרות שזה מועיל לאפשר זיהוי רגיש, זה גם מציג את האפשרות של זיהום באמצעות הפצת אירוסולי הגברה בסביבת המעבדה.בעת ביצוע ניסויים, ניתן לנקוט באמצעים כדי למנוע זיהום של ריאגנטים, ציוד מעבדה וחלל הספסל, שכן זיהום כזה עלול ליצור תוצאות חיוביות שגויות (או שליליות שגויות).

כדי לעזור להפחית את הסבירות לזיהום, יש להפעיל שיטות מעבדה טובות בכל עת.באופן ספציפי, יש לנקוט באמצעי זהירות לגבי הנקודות הבאות:

1. טיפול בריאגנטים
2. ארגון חלל עבודה וציוד
3. עצות שימוש וניקיון למרחב המולקולרי המיועד
4. ייעוץ כללי לביולוגיה מולקולרית
5. בקרות פנימיות
6. ביבליוגרפיה

1. טיפול בריאגנטים

צנטריפוג בקצרה צינורות מגיב לפני הפתיחה כדי למנוע יצירת אירוסולים.כמות ריאגנטים כדי למנוע הקפאה-הפשרה מרובות וזיהום של מניות מאסטר.סמן ותארך בבירור את כל צינורות הריאגנטים והריאגנטים ושמור יומנים של חבילת ריאגנטים ומספרי אצווה המשמשים בכל הניסויים.הפיפטט את כל הריאגנטים והדגימות באמצעות קצות סינון.לפני הרכישה, רצוי לאשר מול היצרן כי קצות המסנן מתאימים למותג הפיפטה לשימוש.

2. ארגון חלל עבודה וציוד

יש לארגן את סביבת העבודה כדי להבטיח שזרימת העבודה מתרחשת בכיוון אחד, מאזורים נקיים (Pre-PCR) ועד לאזורים מלוכלכים (פוסט-PCR).אמצעי הזהירות הכלליים הבאים יסייעו להפחית את הסיכוי לזיהום.להחזיק חדרים ייעודיים נפרדים, או לפחות אזורים נפרדים פיזית, עבור: הכנת מאסטרמיקס, מיצוי חומצת גרעין והוספת תבנית DNA, הגברה וטיפול במוצר מוגבר, וניתוח מוצר, למשל אלקטרופורזה של ג'ל.

בהגדרות מסוימות, קשה להחזיק 4 חדרים נפרדים.אפשרות אפשרית אך פחות רצויה היא לבצע את הכנת המאסטרמיקס באזור בלימה, למשל ארון זרימה למינרית.במקרה של הגברה מקוננת של PCR יש להכין את הכנת המאסטרמיקס לתגובת הסיבוב השני באזור ה'נקי' להכנת מאסטרמיקס, אך החיסון עם מוצר ה-PCR הראשוני צריך להיעשות בחדר ההגברה, ואם אפשר באזור בלימה ייעודי (למשל ארון זרימה למינרית).

כל חדר/אזור זקוק לסט נפרד של פיפטות עם תווית ברורה, קצות סינון, מתלים לצינורות, מערבולת, צנטריפוגות (אם רלוונטי), עטים, ריאגנטים מעבדתיים גנריים, מעילי מעבדה וקופסאות כפפות שיישארו בתחנות העבודה שלהם.יש לשטוף ידיים ולהחליף כפפות ומעילי מעבדה בעת מעבר בין האזורים המיועדים לכך.אין להעביר ריאגנטים וציוד מאזור מלוכלך לאזור נקי.אם יתעורר מקרה קיצוני שבו יש להזיז מגיב או ציוד לאחור, תחילה יש לנקותו ב-10% נתרן היפוכלוריט, ולאחר מכן לנגב אותו במים סטריליים.

הערה

תמיסת נתרן היפוכלוריט 10% חייבת להיות טרייה מדי יום.בעת שימוש לטיהור, יש להקפיד על זמן מגע מינימלי של 10 דקות.
לחלופין, ניתן להשתמש במוצרים זמינים מסחרית אשר מאומתים כמטהרי משטח הורסים DNA אם המלצות בטיחות מקומיות אינן מאפשרות שימוש בנתרן היפוכלוריט או אם נתרן היפוכלוריט אינו מתאים לטיהור החלקים המתכתיים של הציוד.

באופן אידיאלי, הצוות צריך לציית לאתוס זרימת העבודה החד-כיוונית ולא לחזור מאזורים מלוכלכים (פוסט-PCR) לאזורים נקיים (Pre-PCR) באותו היום.עם זאת, ייתכנו מקרים שבהם זה בלתי נמנע.כאשר מתרחש אירוע כזה, על הצוות לדאוג לשטוף היטב ידיים, להחליף כפפות, להשתמש במעיל המעבדה המיועד ולא להכניס כל ציוד שירצה להוציא שוב מהחדר, כגון ספרי מעבדה.יש להדגיש אמצעי בקרה כאלה בהכשרת צוות בנושא שיטות מולקולריות.

לאחר השימוש, יש לנקות את חללי הספסל עם 10% נתרן היפוכלוריט (ולאחר מכן מים סטריליים להסרת שאריות אקונומיקה), 70% אתנול, או חומר ניקוי הורס DNA זמין מסחרית.באופן אידיאלי, יש להתקין מנורות אולטרה סגול (UV) כדי לאפשר טיהור באמצעות הקרנה.עם זאת, יש להגביל את השימוש במנורות UV לאזורי עבודה סגורים, למשל ארונות בטיחות, על מנת להגביל את החשיפה ל-UV של צוות המעבדה.אנא פעל לפי הוראות היצרן לטיפול, אוורור וניקוי של מנורות UV על מנת להבטיח שהמנורות יישארו יעילות.

אם משתמשים באתנול 70% במקום נתרן היפוכלוריט, יהיה צורך בהקרנה באור UV להשלמת הטיהור.
אל תנקה את המערבולת וצנטריפוגה עם נתרן היפוכלוריט;במקום זאת, נגב עם 70% אתנול וחשוף לאור UV, או השתמש בחומר טיהור מסחרי הורס DNA.אם נשפך, בדוק עם היצרן לקבלת עצות ניקוי נוספות.אם הוראות היצרן מאפשרות זאת, יש לעקר פיפטות באופן שגרתי באמצעות חיטוי.אם לא ניתן לבצע חיטוי פיפטות, יש להספיק לנקות אותן עם 10% נתרן היפוכלוריט (לאחר מכן ניגוב יסודי במים סטריליים) או עם חומר ניקוי מסחרי הורס DNA ולאחר מכן חשיפה ל-UV.

ניקוי עם נתרן היפוכלוריט באחוז גבוה עלול בסופו של דבר לפגוע בפלסטיק ובמתכות לפיפטה אם נעשה על בסיס קבוע;בדוק תחילה את ההמלצות מהיצרן.כל הציוד צריך להיות מכויל באופן קבוע לפי לוח הזמנים המומלץ על ידי היצרן.אדם ייעודי צריך להיות אחראי על עמידה בלוח הזמנים של הכיול, שמירה על יומנים מפורטים ותוויות שירות מוצגות בבירור על הציוד.

3. עצות שימוש וניקיון למרחב המולקולרי המיועד

טרום-PCR: הכנת ריאגנטים / הכנת מאסטרמיקס: זה צריך להיות הנקי ביותר מכל החללים המשמשים להכנת ניסויים מולקולריים ובאופן אידיאלי צריך להיות ארון זרימה למינרית ייעודית המצוידת באור UV.אסור לטפל בדגימות, חומצת גרעין מופקת ומוצרי PCR מוגברים באזור זה.ריאגנטים להגברה צריכים להישמר במקפיא (או במקרר, לפי המלצות היצרן) באותו חלל ייעודי, באופן אידיאלי ליד ארון הזרימה הלמינרית או אזור טרום-PCR.יש להחליף כפפות בכל פעם עם הכניסה לאזור טרום-PCR או לארון הזרימה למינרית.

יש לנקות את אזור טרום-PCR או ארון זרימה למינרית לפני ואחרי השימוש באופן הבא: נגב את כל הפריטים בארון, למשל פיפטות, קופסאות קצה, מערבולת, צנטריפוגה, מתלים לשפופרות, עטים וכו' עם 70% אתנול או א. חומר ניקוי מסחרי הורס DNA, ואפשר להתייבש.במקרה של אזור עבודה סגור, למשל ארון זרימה למינרית, חשוף את מכסה המנוע לאור UV למשך 30 דקות.

הערה

אין לחשוף ריאגנטים לאור UV;העבר אותם לארון רק לאחר שהוא נקי.אם מבצעים שיעתוק הפוך PCR, זה עשוי להיות מועיל גם לנגב משטחים וציוד עם פתרון שמפרק RNases במגע.זה עשוי לסייע במניעת תוצאות שליליות שגויות מפירוק אנזים של RNA.לאחר טיהור ולפני הכנת המאסטרמיקס, יש להחליף כפפות פעם נוספת, ואז הארון מוכן לשימוש.

טרום-PCR: מיצוי חומצת גרעין/תוספת תבנית:

יש לחלץ ולטפל בחומצת גרעין באזור ייעודי שני, באמצעות סט נפרד של פיפטות, קצות סינון, מתלים לצינורות, כפפות טריות, מעילי מעבדה וציוד אחר. אזור זה מיועד גם להוספת תבנית, בקרות וקווי מגמה צינורות או צלחות מאסטרמיקס.כדי למנוע זיהום של דגימות חומצת הגרעין המופקות שנמצאות בניתוח, מומלץ להחליף כפפות לפני טיפול בבקרות חיוביות או בתקנים ולהשתמש בסט נפרד של פיפטות.אין לבצע פיפטה של ​​ריאגנטים PCR ומוצרים מוגברים באזור זה.יש לאחסן דגימות במקררים או מקפיאים ייעודיים באותו אזור.יש לנקות את סביבת העבודה לדוגמה באותו אופן כמו חלל המאסטרמיקס.

Post-PCR: הגברה וטיפול במוצר המוגבר

החלל המיועד הזה מיועד לתהליכים שלאחר ההגברה ועליו להיות נפרד פיזית מאזורי טרום-PCR.בדרך כלל הוא מכיל thermocyclers ופלטפורמות בזמן אמת, ובאופן אידיאלי צריך להיות ארון זרימה למינרית להוספת המוצר עגול 1 PCR לתגובה סיבוב 2, אם מבוצע PCR מקונן.אין לטפל בגיבורי PCR וחומצת גרעין מופקת באזור זה מכיוון שהסיכון לזיהום גבוה.באזור זה צריך להיות סט נפרד של כפפות, מעילי מעבדה, מתלים לצלחות וצינורות, פיפטות, קצות סינון, פחים וציוד אחר.יש לבצע צנטריפוגה של צינורות לפני הפתיחה.יש לנקות את סביבת העבודה לדוגמה באותו אופן כמו חלל המאסטרמיקס.

Post-PCR: ניתוח מוצר

חדר זה מיועד לציוד לזיהוי מוצרים, למשל מיכלי אלקטרופורזה בג'ל, מארזי כוח, מאיר UV ומערכת תיעוד ג'ל.באזור זה צריך להיות סטים נפרדים של כפפות, מעילי מעבדה, מתלים לצלחות וצינורות, פיפטות, קצות סינון, פחים וציוד אחר.לא ניתן להכניס ריאגנטים אחרים לאזור זה, למעט צבע טעינה, סמן מולקולרי וג'ל אגרוז ורכיבי חיץ.יש לנקות את סביבת העבודה לדוגמה באותו אופן כמו חלל המאסטרמיקס.

הערה חשובה

באופן אידיאלי, אין להיכנס לחדרי טרום-PCR באותו היום אם כבר בוצעה עבודה בחדרים שלאחר ה-PCR.אם זה בלתי נמנע לחלוטין, ודא שתחילה שטפו את הידיים ביסודיות ושמעילי מעבדה ספציפיים לובשים בחדרים.אין להכניס ספרי מעבדה וניירת לחדרים שלפני ה-PCR אם נעשה בהם שימוש בחדרים שלאחר ה-PCR;במידת הצורך, בצע הדפסות כפולות של פרוטוקולים/זיהויים לדוגמה וכו'.

4. ייעוץ כללי לביולוגיה מולקולרית

השתמש בכפפות ללא אבקה כדי למנוע עיכוב בדיקות.טכניקת פיפטציה נכונה היא חיונית להפחתת הזיהום.פיפטציה לא נכונה עלולה לגרום להתזות בעת חלוקת נוזלים וליצירת אירוסולים.תרגול טוב לפיפטינג נכון ניתן למצוא בקישורים הבאים: מדריך גילסון לפיפטינג, סרטוני וידאו של טכניקת פיפטציה של Anachem, שפופרות צנטריפוגה לפני הפתיחה, ופתח אותן בזהירות כדי למנוע התזות.סגור צינורות מיד לאחר השימוש כדי למנוע החדרת מזהמים.

בעת ביצוע תגובות מרובות, הכינו מאסטרמיקס אחד המכיל ריאגנטים נפוצים (כגון מים, dNTPs, חוצץ, פריימרים ואנזים) כדי למזער את מספר העברות הריאגנטים ולהפחית את איום הזיהום.מומלץ להקים את המאסטרמיקס על קרח או בלוק קר.שימוש באנזים Hot Start עשוי לעזור להפחית את הייצור של מוצרים לא ספציפיים.הגן על ריאגנטים המכילים בדיקות ניאון מפני אור על מנת למנוע השפלה.

5. בקרות פנימיות

כלול בקרות חיוביות ושליליות מאופיינות היטב, מאושרות, יחד עם בקרת ללא תבנית בכל התגובות, וקו מגמה מטיטר רב נקודות עבור תגובות כמותיות.הבקרה החיובית לא צריכה להיות כל כך חזקה שהיא מהווה סיכון זיהום.כלול בקרות מיצוי חיוביות ושליליות בעת ביצוע מיצוי חומצת גרעין.

מומלץ לפרסם הנחיות ברורות בכל אחד מהתחומים כדי שהמשתמשים יהיו מודעים לכללי ההתנהגות.מעבדות אבחון המאתרות רמות נמוכות מאוד של DNA או RNA בדגימות קליניות עשויות לרצות לאמץ את אמצעי האבטחה הנוסף של מערכות טיפול באוויר נפרדות עם לחץ אוויר חיובי מעט בחדרי טרום-PCR ולחץ אוויר מעט שלילי בחדרים שלאחר ה-PCR.

לבסוף, פיתוח תוכנית אבטחת איכות (QA) מועיל.תוכנית כזו צריכה לכלול רשימות של מלאי ראשי של ריאגנטים ומלאי עבודה, כללים לאחסון ערכות וריאגנטים, דיווח על תוצאות בקרה, תוכניות הכשרת צוות, אלגוריתמים לפתרון בעיות ופעולות מתקנות בעת הצורך.

6. ביבליוגרפיה

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. פרק 3: הקמת מעבדת qPCR.מסמך הדרכה לבדיקת מי פנאי בשיטת USEPA qPCR 1611. Lansing- Michigan State University.

בריאות הציבור אנגליה, NHS.תקנים בבריטניה לחקירות מיקרוביולוגיה: שיטות מעבדה טובות בעת ביצוע מבחני הגברה מולקולריים).הנחיית איכות.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. הקמת מעבדת PCR.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. תחזוקה שוטפת של צנטריפוגות: ניקוי, תחזוקה וחיטוי של צנטריפוגות, רוטורים ומתאמים (ספר לבן מס' 14).המבורג: אפנדורף;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) עבור בדיקות מבוססות מולקולריות המשמשות במעבדות אבחון, בתוך: Akyar I, עורך.ספקטרום רחב של בקרת איכות.רייקה, קרואטיה: אינטק;2011: 29–52.