I metodi di rilevazione molecolare hanno la capacità di produrre un grande volume di acido nucleico attraverso l'amplificazione di tracce presenti nei campioni. Sebbene ciò sia vantaggioso per consentire una rilevazione sensibile, introduce anche il rischio di contaminazione attraverso la diffusione di aerosol di amplificazione nell'ambiente di laboratorio. Durante gli esperimenti, è possibile adottare misure per evitare la contaminazione di reagenti, attrezzature di laboratorio e spazio sul banco, poiché tale contaminazione può generare risultati falsi positivi (o falsi negativi).
Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione, è necessario adottare sempre le Buone Pratiche di Laboratorio. In particolare, è necessario adottare precauzioni in merito ai seguenti punti:
1. Manipolazione dei reagenti
2. Organizzazione dello spazio di lavoro e delle attrezzature
3. Consigli per l'uso e la pulizia dello spazio molecolare designato
4. Consigli generali di biologia molecolare
5. Controlli interni
6. Bibliografia
1. Manipolazione dei reagenti
Centrifugare brevemente le provette dei reagenti prima dell'apertura per evitare la formazione di aerosol. Aliquotare i reagenti per evitare congelamenti-scongelamenti multipli e la contaminazione delle scorte master. Etichettare e datare chiaramente tutte le provette dei reagenti e delle reazioni e tenere traccia dei numeri di lotto e di partita dei reagenti utilizzati in tutti gli esperimenti. Pipettare tutti i reagenti e i campioni utilizzando puntali con filtro. Prima dell'acquisto, si consiglia di verificare con il produttore che i puntali con filtro siano compatibili con la marca della pipetta da utilizzare.
2. Organizzazione dello spazio di lavoro e delle attrezzature
L'area di lavoro deve essere organizzata in modo da garantire che il flusso di lavoro avvenga in un'unica direzione, dalle aree pulite (pre-PCR) alle aree sporche (post-PCR). Le seguenti precauzioni generali contribuiranno a ridurre il rischio di contaminazione. Predisporre stanze separate, o almeno aree fisicamente separate, per: preparazione del mastermix, estrazione degli acidi nucleici e aggiunta del modello di DNA, amplificazione e manipolazione del prodotto amplificato e analisi del prodotto, ad esempio elettroforesi su gel.
In alcuni contesti, avere 4 stanze separate è difficile. Un'opzione possibile, ma meno auspicabile, è quella di effettuare la preparazione del mastermix in un'area di contenimento, ad esempio una cappa a flusso laminare. Nel caso di amplificazione nested PCR, la preparazione del mastermix per la seconda reazione dovrebbe essere effettuata nell'area "pulita" per la preparazione del mastermix, ma l'inoculazione con il prodotto primario della PCR dovrebbe essere effettuata nella stanza di amplificazione e, se possibile, in un'area di contenimento dedicata (ad esempio una cappa a flusso laminare).
Ogni stanza/area necessita di un set separato di pipette, puntali con filtro, portaprovette, vortex, centrifughe (se necessario), penne, reagenti di laboratorio generici, camici e scatole di guanti chiaramente etichettati, che rimarranno nelle rispettive postazioni di lavoro. È necessario lavarsi le mani e cambiare guanti e camici quando ci si sposta tra le aree designate. Reagenti e attrezzature non devono essere spostati da un'area sporca a un'area pulita. Nel caso estremo in cui un reagente o un'attrezzatura debba essere spostata all'indietro, è necessario prima decontaminarla con ipoclorito di sodio al 10%, quindi asciugarla con acqua sterile.
Nota
La soluzione di ipoclorito di sodio al 10% deve essere preparata fresca ogni giorno. Quando utilizzata per la decontaminazione, è necessario rispettare un tempo di contatto minimo di 10 minuti.
In alternativa, se le raccomandazioni di sicurezza locali non consentono l'uso di ipoclorito di sodio o se l'ipoclorito di sodio non è adatto per decontaminare le parti metalliche delle apparecchiature, è possibile utilizzare prodotti disponibili in commercio convalidati come decontaminanti superficiali che distruggono il DNA.
Idealmente, il personale dovrebbe attenersi all'etica del flusso di lavoro unidirezionale e non passare dalle aree sporche (post-PCR) alle aree pulite (pre-PCR) nello stesso giorno. Tuttavia, potrebbero esserci occasioni in cui ciò è inevitabile. In tali casi, il personale deve lavarsi accuratamente le mani, cambiare i guanti, indossare il camice da laboratorio designato e non introdurre attrezzature che potrebbero voler portare fuori dalla stanza, come i libri di testo. Tali misure di controllo dovrebbero essere enfatizzate nella formazione del personale sui metodi molecolari.
Dopo l'uso, i banchi di lavoro devono essere puliti con ipoclorito di sodio al 10% (seguito da acqua sterile per rimuovere i residui di candeggina), etanolo al 70% o un decontaminante validato e disponibile in commercio che distrugga il DNA. Idealmente, è consigliabile installare lampade a raggi ultravioletti (UV) per consentire la decontaminazione tramite irradiazione. Tuttavia, l'uso di lampade UV dovrebbe essere limitato alle aree di lavoro chiuse, ad esempio cappe di sicurezza, al fine di limitare l'esposizione del personale di laboratorio ai raggi UV. Si prega di attenersi alle istruzioni del produttore per la cura, la ventilazione e la pulizia delle lampade UV al fine di garantirne l'efficacia.
Se si utilizza etanolo al 70% invece di ipoclorito di sodio, sarà necessaria l'irradiazione con luce UV per completare la decontaminazione.
Non pulire il vortice e la centrifuga con ipoclorito di sodio; invece, pulire con etanolo al 70% ed esporre alla luce UV, oppure utilizzare un decontaminante commerciale che distrugge il DNA. In caso di fuoriuscite, consultare il produttore per ulteriori consigli sulla pulizia. Se le istruzioni del produttore lo consentono, le pipette devono essere sterilizzate regolarmente in autoclave. Se le pipette non possono essere sterilizzate in autoclave, dovrebbe essere sufficiente pulirle con ipoclorito di sodio al 10% (seguito da un'accurata pulizia con acqua sterile) o con un decontaminante commerciale che distrugge il DNA seguito da esposizione ai raggi UV.
La pulizia con ipoclorito di sodio ad alta percentuale può danneggiare le plastiche e i metalli delle pipette se eseguita regolarmente; verificare prima le raccomandazioni del produttore. Tutte le apparecchiature devono essere calibrate regolarmente secondo la programmazione raccomandata dal produttore. Una persona designata deve essere incaricata di garantire il rispetto della programmazione di calibrazione, la tenuta di registri dettagliati e la chiara esposizione delle etichette di manutenzione sulle apparecchiature.
3. Consigli per l'uso e la pulizia dello spazio molecolare designato
Pre-PCR: Aliquotazione dei reagenti/preparazione del mastermix: questa dovrebbe essere la più pulita tra tutte le aree utilizzate per la preparazione degli esperimenti molecolari e idealmente dovrebbe essere una cappa a flusso laminare designata dotata di luce UV. Campioni, acidi nucleici estratti e prodotti di PCR amplificati non devono essere manipolati in quest'area. I reagenti di amplificazione devono essere conservati in un congelatore (o frigorifero, secondo le raccomandazioni del produttore) nello stesso spazio designato, idealmente accanto alla cappa a flusso laminare o all'area pre-PCR. I guanti devono essere cambiati ogni volta che si entra nell'area pre-PCR o nella cappa a flusso laminare.
L'area pre-PCR o la cappa a flusso laminare devono essere pulite prima e dopo l'uso come segue: pulire tutti gli oggetti nella cappa, ad esempio pipette, scatole di puntali, vortex, centrifuga, rack per provette, penne, ecc. con etanolo al 70% o un decontaminante commerciale che distrugge il DNA e lasciare asciugare. Nel caso di un'area di lavoro chiusa, ad esempio una cappa a flusso laminare, esporre la cappa alla luce UV per 30 minuti.
Nota
Non esporre i reagenti alla luce UV; spostarli nella cappa solo dopo averla pulita. Se si esegue una PCR con trascrizione inversa, può essere utile pulire le superfici e le attrezzature con una soluzione che scomponga le RNasi al contatto. Questo può aiutare a evitare risultati falsi negativi dovuti alla degradazione enzimatica dell'RNA. Dopo la decontaminazione e prima di preparare il mastermix, i guanti devono essere cambiati nuovamente, dopodiché la cappa è pronta per l'uso.
Pre-PCR: estrazione dell'acido nucleico/aggiunta del modello:
L'acido nucleico deve essere estratto e manipolato in una seconda area designata, utilizzando un set separato di pipette, puntali con filtro, rack per provette, guanti puliti, camici da laboratorio e altre attrezzature. Quest'area è anche destinata all'aggiunta di templato, controlli e linee di tendenza alle provette o alle piastre del mastermix. Per evitare la contaminazione dei campioni di acido nucleico estratti in fase di analisi, si raccomanda di cambiare i guanti prima di maneggiare controlli positivi o standard e di utilizzare un set separato di pipette. I reagenti PCR e i prodotti amplificati non devono essere pipettati in quest'area. I campioni devono essere conservati in appositi frigoriferi o congelatori nella stessa area. L'area di lavoro dei campioni deve essere pulita allo stesso modo dell'area del mastermix.
Post-PCR: amplificazione e gestione del prodotto amplificato
Questo spazio designato è destinato ai processi di post-amplificazione e dovrebbe essere fisicamente separato dalle aree pre-PCR. Solitamente contiene termociclatori e piattaforme real-time e, idealmente, dovrebbe essere dotato di una cappa a flusso laminare per l'aggiunta del prodotto di PCR del primo ciclo alla reazione del secondo ciclo, se si esegue la PCR nidificata. I reagenti per PCR e l'acido nucleico estratto non devono essere maneggiati in quest'area, poiché il rischio di contaminazione è elevato. Quest'area dovrebbe disporre di un set separato di guanti, camici da laboratorio, rack per piastre e provette, pipette, puntali con filtro, contenitori e altre attrezzature. Le provette devono essere centrifugate prima dell'apertura. L'area di lavoro dei campioni deve essere pulita allo stesso modo dell'area mastermix.
Post-PCR: analisi del prodotto
Questa stanza è destinata alle apparecchiature di rilevamento del prodotto, ad esempio vasche per elettroforesi su gel, alimentatori, transilluminatore UV e sistema di documentazione del gel. Quest'area deve essere dotata di set separati di guanti, camici da laboratorio, rack per piastre e provette, pipette, puntali con filtro, contenitori e altre attrezzature. Non è consentito introdurre altri reagenti in quest'area, ad eccezione del colorante di caricamento, del marcatore molecolare, del gel di agarosio e dei componenti del tampone. L'area di lavoro del campione deve essere pulita con le stesse modalità dell'area di mastermix.
Nota importante
Idealmente, non si dovrebbe accedere alle sale pre-PCR lo stesso giorno in cui si è già svolto del lavoro nelle sale post-PCR. Se ciò è assolutamente inevitabile, assicurarsi di lavarsi accuratamente le mani e di indossare camici specifici nelle sale. I registri di laboratorio e la documentazione non devono essere portati nelle sale pre-PCR se sono stati utilizzati nelle sale post-PCR; se necessario, portare con sé copie stampate dei protocolli/ID dei campioni, ecc.
4. Consigli generali di biologia molecolare
Utilizzare guanti senza polvere per evitare l'inibizione del test. Una corretta tecnica di pipettaggio è fondamentale per ridurre la contaminazione. Un pipettaggio errato può causare schizzi durante l'erogazione dei liquidi e la creazione di aerosol. Le buone pratiche per un pipettaggio corretto sono disponibili ai seguenti link: Guida al pipettaggio Gilson, Video sulla tecnica di pipettaggio Anachem, Centrifugare le provette prima dell'apertura e aprirle con cautela per evitare schizzi. Chiudere le provette immediatamente dopo l'uso per evitare l'introduzione di contaminanti.
Quando si eseguono reazioni multiple, preparare un mastermix contenente reagenti comuni (ad esempio acqua, dNTP, tampone, primer ed enzima) per ridurre al minimo il numero di trasferimenti di reagenti e ridurre il rischio di contaminazione. Si consiglia di preparare il mastermix su ghiaccio o su un blocco freddo. L'uso di un enzima Hot Start può aiutare a ridurre la produzione di prodotti non specifici. Proteggere i reagenti contenenti sonde fluorescenti dalla luce per evitarne la degradazione.
5. Controlli interni
Includere controlli positivi e negativi ben caratterizzati e confermati, insieme a un controllo senza templato in tutte le reazioni e una linea di tendenza titolata a più punti per le reazioni quantitative. Il controllo positivo non deve essere così forte da rappresentare un rischio di contaminazione. Includere controlli di estrazione positivi e negativi quando si esegue l'estrazione degli acidi nucleici.
Si raccomanda di affiggere istruzioni chiare in ciascuna area, in modo che gli utenti siano a conoscenza delle regole di condotta. I laboratori diagnostici che rilevano livelli molto bassi di DNA o RNA in campioni clinici potrebbero voler adottare un'ulteriore misura di sicurezza, ovvero sistemi di trattamento dell'aria separati, con pressione leggermente positiva nelle sale pre-PCR e pressione leggermente negativa nelle sale post-PCR.
Infine, è utile sviluppare un piano di garanzia della qualità (QA). Tale piano dovrebbe includere elenchi di scorte di reagenti master e di magazzino, regole per la conservazione di kit e reagenti, la comunicazione dei risultati dei controlli, programmi di formazione del personale, algoritmi di risoluzione dei problemi e azioni correttive quando necessario.
6. Bibliografia
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Viana RV, Wallis CL. Buona pratica clinica di laboratorio (GCLP) per test molecolari utilizzati nei laboratori diagnostici, in: Akyar I, a cura di. Ampio spettro di controllo di qualità. Fiume, Croazia: Intech; 2011: 29–52.
Data di pubblicazione: 16-07-2020
