Sameindagreiningaraðferðir hafa getu til að framleiða mikið magn af kjarnsýru með mögnun á snefilmagni sem finnast í sýnum.Þó að þetta sé gagnlegt til að gera viðkvæma greiningu kleift, kynnir það einnig möguleika á mengun með dreifingu mögnunarúða í rannsóknarstofuumhverfi.Þegar tilraunir eru gerðar er hægt að gera ráðstafanir til að forðast mengun hvarfefna, rannsóknarstofubúnaðar og bekkjarpláss, þar sem slík mengun getur leitt til falskar jákvæðar (eða rangar neikvæðar) niðurstöður.

Til að draga úr líkum á mengun skal ávallt beita góðri rannsóknarvenju.Sérstaklega ætti að gera varúðarráðstafanir varðandi eftirfarandi atriði:

1. Meðhöndlun hvarfefna
2. Skipulag vinnurýmis og búnaðar
3. Ráðleggingar um notkun og hreinsun fyrir tiltekið sameindarými
4. Almenn sameindalíffræðiráðgjöf
5. Innra eftirlit
6. Heimildaskrá

1. Meðhöndlun hvarfefna

Skildu hvarfefnisglösin stuttlega áður en þau eru opnuð til að forðast myndun úðabrúsa.Deilið hvarfefni til að koma í veg fyrir margþætta frostþíðingu og mengun á aðalbirgðum.Merktu og dagsettu greinilega öll hvarfefnis- og hvarfglös og haltu skrá yfir hvarfefnislotu og lotunúmer sem notuð eru í öllum tilraunum.Pípettaðu öll hvarfefni og sýni með síuspípum.Fyrir kaup er ráðlegt að staðfesta við framleiðandann að síuoddarnir passi við tegund pípettu sem á að nota.

2. Skipulag vinnurýmis og búnaðar

Vinnurými ætti að vera skipulagt til að tryggja að flæði vinnu fari í eina átt, frá hreinum svæðum (fyrir PCR) til óhreinra svæða (eftir PCR).Eftirfarandi almennar varúðarráðstafanir munu hjálpa til við að draga úr líkum á mengun.Hafa aðskilin afmörkuð herbergi, eða að minnsta kosti líkamlega aðskilin svæði, fyrir: mastermix undirbúning, kjarnsýruútdrátt og DNA sniðmát viðbót, mögnun og meðhöndlun á mögnuðu vöru og vörugreiningu, td gel rafdrætti.

Í sumum aðstæðum er erfitt að hafa 4 aðskilin herbergi.Mögulegur en minna eftirsóknarverður valkostur er að gera mastermix-undirbúninginn á innilokunarsvæði, td lagskiptu flæðisskáp.Ef um er að ræða hreiðraða PCR mögnun skal undirbúningur mastermixsins fyrir seinni umferð hvarfsins vera undirbúinn á „hreina“ svæðinu fyrir mastermix undirbúning, en sáningin með frum PCR vörunni ætti að fara fram í mögnunarherberginu, og ef mögulegt er. á sérstöku innilokunarsvæði (td lagskiptu flæðisskáp).

Hvert herbergi/svæði þarf sérstakt sett af greinilega merktum pípettum, síuodda, röragrindum, hvirfli, skilvindur (ef við á), penna, almenna rannsóknarefnahvarfefni, rannsóknarfrakka og hanskakassa sem verða eftir á viðkomandi vinnustöð.Þvo þarf hendurnar og skipta um hanska og rannsóknarfrakka þegar farið er á milli tilgreindra svæða.Ekki skal færa hvarfefni og búnað frá óhreinu svæði yfir á hreint svæði.Komi upp öfgatilvik þar sem færa þarf hvarfefni eða búnað aftur á bak verður fyrst að afmenga það með 10% natríumhýpóklóríti og síðan þurrka það niður með dauðhreinsuðu vatni.

Athugið

10% natríumhýpóklórítlausnina verður að búa til ferska daglega.Þegar það er notað til afmengunar skal gæta að lágmarks snertingartíma sem er 10 mínútur.
Að öðrum kosti er hægt að nota vörur sem eru fáanlegar í verslun sem eru fullgiltar sem DNA-eyðandi yfirborðshreinsiefni ef staðbundnar öryggisráðleggingar leyfa ekki notkun natríumhýpóklóríts eða ef natríumhýpóklórít hentar ekki til að afmenga málmhluta búnaðarins.

Helst ætti starfsfólk að hlíta einátta vinnuflæðissiðferði og fara ekki frá óhreinum svæðum (eftir PCR) aftur í hrein svæði (fyrir PCR) sama dag.Hins vegar geta verið tilvik þar sem þetta er óhjákvæmilegt.Þegar slík tilefni gefast verður starfsfólk að gæta þess að þvo hendur vandlega, skipta um hanska, nota tiltekna rannsóknarfrakka og ekki kynna neinn búnað sem það vill taka út úr herberginu aftur, svo sem rannsóknarstofubækur.Leggja skal áherslu á slíkar eftirlitsaðgerðir í þjálfun starfsfólks um sameindaaðferðir.

Eftir notkun skal hreinsa bekkjarrými með 10% natríumhýpóklóríti (á eftir með dauðhreinsuðu vatni til að fjarlægja leifar af bleikju), 70% etanóli eða viðurkenndu DNA-eyðandi afmengunarefni sem fæst í sölu.Helst ætti að setja útfjólubláa (UV) lampa til að hægt sé að afmenga þær með geislun.Hins vegar ætti að takmarka notkun UV lampa við lokuð vinnusvæði, td öryggisskápa, til að takmarka útfjólubláu útsetningu starfsmanna rannsóknarstofunnar.Vinsamlega farið eftir leiðbeiningum framleiðanda um umhirðu, loftræstingu og hreinsun útfjólubláa lampa til að tryggja að lampar haldist virkir.

Ef notað er 70% etanól í stað natríumhýpóklóríts þarf að geisla með UV-ljósi til að ljúka afmenguninni.
Ekki þrífa hvirfilinn og skilvindu með natríumhýpóklóríti;Þurrkaðu í staðinn af með 70% etanóli og útsettu fyrir útfjólubláu ljósi, eða notaðu DNA-eyðandi afmengunarefni.Fyrir leka, hafðu samband við framleiðanda til að fá frekari ráðleggingar um hreinsun.Ef leiðbeiningar framleiðanda leyfa það, ætti að dauðhreinsa pípettur reglulega með autoclave.Ef ekki er hægt að þvo pípettur í autoclaver ætti að nægja að þrífa þær með 10% natríumhýpóklóríti (eftir á eftir með því að þurrka það vel af með dauðhreinsuðu vatni) eða með DNA-eyðandi afmengunarefni í sölu og síðan útsetningu fyrir UV.

Hreinsun með háu hlutfalli natríumhýpóklóríts getur að lokum skaðað pípettuplast og málma ef það er gert reglulega;athugaðu ráðleggingar frá framleiðanda fyrst.Allur búnaður þarf að kvarða reglulega í samræmi við áætlun framleiðanda sem mælt er með.Tilnefndur aðili ætti að sjá til þess að kvörðunaráætluninni sé fylgt, ítarlegum annálum sé viðhaldið og þjónustumerkingar séu greinilega sýndar á búnaði.

3. Ráðleggingar um notkun og hreinsun fyrir tiltekið sameindarými

For-PCR: Dreifing hvarfefnis / mastermix undirbúningur: Þetta ætti að vera hreinasta af öllum rýmum sem notuð eru við undirbúning sameindatilrauna og ætti helst að vera tilnefndur lagskiptur flæðiskápur búinn útfjólubláu ljósi.Ekki má meðhöndla sýni, útdregna kjarnsýru og magnaðar PCR vörur á þessu svæði.Mögnunarhvarfefni ætti að geyma í frysti (eða kæli, samkvæmt ráðleggingum framleiðanda) á sama tilgreindu rými, helst við hliðina á lagskiptu flæðisskápnum eða for-PCR svæði.Skipta skal um hanska í hvert sinn þegar farið er inn í for-PCR svæðið eða lagskiptu flæðisskápinn.

For-PCR svæðið eða laminar flæði skápinn ætti að þrífa fyrir og eftir notkun á eftirfarandi hátt: Þurrkaðu niður alla hluti í skápnum, td pípettur, sprautukassa, hvirfil, skilvindu, slöngurekki, penna osfrv. með 70% etanóli eða a DNA-eyðandi afmengunarefni í sölu, og látið þorna.Ef um er að ræða lokað vinnusvæði, td lagskipt flæðisskáp, skal hlífina verða fyrir útfjólubláu ljósi í 30 mínútur.

Athugið

Ekki láta hvarfefni verða fyrir útfjólubláu ljósi;færðu þá aðeins inn í skápinn þegar hann er hreinn.Ef framkvæmt er PCR um öfuga umritun getur það einnig verið gagnlegt að þurrka niður yfirborð og búnað með lausn sem brýtur niður RNases við snertingu.Þetta getur hjálpað til við að forðast rangar neikvæðar niðurstöður vegna niðurbrots ensíma á RNA.Eftir afmengun og áður en mastermixið er útbúið skal skipta um hanska einu sinni enn og þá er skápurinn tilbúinn til notkunar.

For-PCR: Kjarnsýruútdráttur/viðbót á sniðmáti:

Kjarnsýru verður að draga út og meðhöndla á öðru afmörkuðu svæði með því að nota sérstakt sett af pípettum, síuoddum, slöngurekki, ferskum hönskum, rannsóknarfrakkum og öðrum búnaði. Þetta svæði er einnig til að bæta við sniðmáti, stýringar og stefnulínur við mastermix rör eða plötur.Til að koma í veg fyrir mengun á útdregnu kjarnsýrusýnunum sem verið er að greina er mælt með því að skipta um hanska áður en meðhöndlaður er jákvæður samanburður eða staðla og nota sérstakt sett af pípettum.PCR hvarfefni og magnaðar vörur má ekki pípetta á þessu svæði.Sýni skulu geymd í þar til gerðum ísskápum eða frystum á sama svæði.Sýnisvinnusvæðið ætti að þrífa á sama hátt og mastermix rýmið.

Post-PCR: Mögnun og meðhöndlun á mögnuðu vörunni

Þetta tilgreinda rými er fyrir eftirmögnunarferli og ætti að vera líkamlega aðskilið frá for-PCR svæðum.Það inniheldur venjulega hitahringrásir og rauntíma palla og ætti helst að vera með lagskiptu flæðisskáp til að bæta round 1 PCR vörunni við round 2 hvarfið, ef hreiður PCR er framkvæmt.Ekki má meðhöndla PCR hvarfefni og útdregna kjarnsýru á þessu svæði þar sem hættan á mengun er mikil.Á þessu svæði ætti að vera sérstakt sett af hönskum, rannsóknarfrakkum, plötu- og slöngurekkjum, pípettum, síuoddum, tunnum og öðrum búnaði.Slöngur verða að vera skilvindur áður en þær eru opnaðar.Sýnisvinnusvæðið ætti að þrífa á sama hátt og mastermix rýmið.

Post-PCR: Vörugreining

Þetta herbergi er fyrir vörugreiningarbúnað, td gel rafdrættisgeyma, aflgjafa, UV-geislaljós og hlaupskjalakerfið.Á þessu svæði ætti að vera aðskilin hanskasett, rannsóknarfrakkar, plötu- og slöngurekki, pípettur, síuspár, bakkar og annan búnað.Engin önnur hvarfefni má koma með inn á þetta svæði, að undanskildum hleðslulitarefni, sameindamerki og agarósageli og jafnahlutum.Sýnisvinnusvæðið ætti að þrífa á sama hátt og mastermix rýmið.

Mikilvæg athugasemd

Helst ætti ekki að fara inn í for-PCR herbergin samdægurs ef vinna hefur þegar verið unnin í post-PCR stofunum.Ef þetta er algjörlega óhjákvæmilegt skaltu ganga úr skugga um að hendur séu fyrst þvegnar vandlega og að sérstakar rannsóknarfrakkar séu notaðar í herbergjunum.Ekki má fara með rannsóknarbækur og pappírsvinnu inn í for-PCR-herbergin ef þau hafa verið notuð í post-PCR-herbergjunum;ef nauðsyn krefur, taka afrit útprentanir af samskiptareglum/sýnishornum osfrv.

4. Almenn sameindalíffræðiráðgjöf

Notaðu duftlausa hanska til að forðast hömlun á prófun.Rétt pípulagningartækni er mikilvæg til að draga úr mengun.Röng pípettrun getur valdið skvettum þegar vökva er skammtað og úðabrúsa myndast.Góðar venjur fyrir rétta pípettrun er að finna á eftirfarandi tenglum: Gilson leiðarvísir um pípettingu, myndbönd með Anachem pípettunartækni, miðflótta rör áður en þau eru opnuð og opnaðu þau varlega til að forðast að skvetta.Lokaðu slöngunum strax eftir notkun til að koma í veg fyrir að mengunarefni berist inn.

Þegar mörg viðbrögð eru framkvæmd skal útbúa eina mastermix sem inniheldur algeng hvarfefni (td vatn, dNTP, biðminni, grunnur og ensím) til að lágmarka fjölda hvarfefnaflutninga og draga úr hættu á mengun.Mælt er með því að setja mastermixið upp á ís eða köldu blokk.Notkun á Hot Start ensími getur hjálpað til við að draga úr framleiðslu á ósértækum vörum.Verndaðu hvarfefni sem innihalda flúrljómandi rannsaka fyrir ljósi til að forðast niðurbrot.

5. Innra eftirlit

Láttu vel einkennda, staðfesta jákvæða og neikvæða viðmiðun fylgja með, ásamt samanburði án sniðmáts í öllum viðbrögðum og margpunkta títraða stefnulínu fyrir megindleg viðbrögð.Jákvæða eftirlitið ætti ekki að vera svo sterkt að það valdi mengunarhættu.Taktu með jákvæða og neikvæða útdráttarstýringu þegar þú framkvæmir kjarnsýruútdrátt.

Mælt er með því að birtar séu skýrar leiðbeiningar á hverju svæði þannig að notendur geri sér grein fyrir umgengnisreglum.Greiningarstofur sem greina mjög lágt magn af DNA eða RNA í klínískum sýnum gætu viljað taka upp þá viðbótaröryggisráðstöfun að hafa aðskilin loftmeðferðarkerfi með örlítið jákvæðum loftþrýstingi í pre-PCR herbergjunum og lítillega neikvæðum loftþrýstingi í post-PCR herbergjunum.

Að lokum er gagnlegt að þróa gæðatryggingaráætlun (QA).Slík áætlun ætti að innihalda lista yfir aðalbirgðir og vinnubirgðir fyrir hvarfefni, reglur um geymslusett og hvarfefni, skýrslu um eftirlitsniðurstöður, þjálfunaráætlanir starfsfólks, reiknirit fyrir bilanaleit og úrbætur þegar þörf krefur.

6. Heimildaskrá

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Kafli 3: Uppsetning qPCR rannsóknarstofu.Leiðbeiningarskjal til að prófa afþreyingarvatn með USEPA qPCR aðferð 1611. Lansing- Michigan State University.

Lýðheilsa England, NHS.Breskir staðlar fyrir örverufræðilegar rannsóknir: Góð rannsóknarstofuvenjur þegar sameindamögnunarpróf eru framkvæmd).Gæðaleiðsögn.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Uppsetning PCR rannsóknarstofu.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Venjulegt viðhald skilvindur: hreinsun, viðhald og sótthreinsun skilvindur, snúninga og millistykki (Hvítbók nr. 14).Hamborg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) fyrir sameindaprófanir sem notaðar eru á greiningarstofum, Í: Akyar I, ritstjóri.Breitt svið gæðaeftirlits.Rijeka, Króatía: Intech;2011: 29–52.