Ụzọ nchọpụta molekụla nwere ikike iwepụta oke nucleic acid site na mmụba nke ọnụọgụ ọnụọgụ dị na nlele.Ọ bụ ezie na nke a bara uru iji mee ka nchọpụta mmetụta dị nro, ọ na-ewebatakwa ohere nke mmetọ site na mgbasawanye ikuku aerosols na gburugburu ụlọ nyocha.Mgbe ị na-eme nnwale, enwere ike ịme ihe iji zere mmetọ nke reagents, akụrụngwa ụlọ nyocha na oghere bench, n'ihi na mmetọ dị otú ahụ nwere ike iwepụta nsonaazụ ụgha (ma ọ bụ ụgha-adịghị mma).

Iji nyere aka belata ohere nke mmetọ, Ekwesịrị ịme ezigbo Laboratory Practice oge niile.Kpọmkwem, ekwesịrị ịkpachapụ anya gbasara isi ihe ndị a:

1. Ijikwa reagents
2. Nhazi nke ebe ọrụ na akụrụngwa
3. Jiri na ihicha ndụmọdụ maka oghere molekụla ahapụtara
4. Ndụmọdụ ihe omimi nke mkpụrụ ndụ ihe nketa
5. Njikwa n'ime
6. Akwụkwọ akụkọ

1. Ijikwa reagents

Mee obere akpa centrifuge reagent tupu imeghe ka ịzenarị ọgbọ ikuku.Aliquot reagents iji zere ọtụtụ friza-thaws na mmetọ nke nnukwu ebuka.Kpọọ ya n'ụzọ doro anya na dee tubes reagent na mmeghachi omume ma dokwaa ndekọ nke reagent nza na nọmba batch ejiri na nnwale niile.Pipette niile reagents na ihe nlele site na iji ndụmọdụ nzacha.Tupu ịzụta, ọ bụ ihe amamihe dị na ya ikwenye na onye nrụpụta na ndụmọdụ nzacha dabara na ụdị pipette ga-eji.

2. Nhazi nke ebe ọrụ na akụrụngwa

Ekwesịrị ịhazi ebe ọrụ iji hụ na nrugharị ọrụ na-eme n'otu ụzọ, site na ebe dị ọcha (pre-PCR) ruo ebe ruru unyi (post-PCR).Akpachara anya izugbe ndị a ga-enyere aka ibelata ohere nke mmetọ.Nwee ọnụ ụlọ dị iche iche, ma ọ bụ opekempe mpaghara dị iche iche nke anụ ahụ, maka: nkwadebe mastermix, mmịpụta nucleic acid na mgbakwunye DNA, nkwalite na njikwa ngwaahịa agbagoro, yana nyocha ngwaahịa, dịka gel electrophoresis.

N'ebe ụfọdụ, inwe ọnụ ụlọ anọ dị iche iche siri ike.Nhọrọ enwere ike ma ọ dị obere bụ ime nkwadebe mastermix na mpaghara nchekwa, dịka kabinet eruba laminar.N'ihe gbasara nkwalite PCR akwụrụ, nkwadebe nke mastermix maka mmeghachi omume nke abụọ kwesịrị ịdị njikere na mpaghara 'dị ọcha' maka nkwadebe mastermix, mana a ga-eme inoculation na ngwaahịa PCR mbụ n'ime ụlọ nkwalite, ma ọ bụrụ na ọ ga-ekwe omume. n'ime ebe nchekwa raara onwe ya nye (dịka kabinet na-agbapụta laminar).

Ime ụlọ / mpaghara ọ bụla chọrọ ụdị dị iche iche nke pipettes akpọrọ nke ọma, ndụmọdụ nzacha, akwa tube, vortexes, centrifuges (ọ bụrụ na ọ dị mkpa), pensụl, ihe nrụnye ụlọ nyocha, uwe lab na igbe uwe aka ga-anọ na ọdụ ọrụ ha.A ghaghị ịsacha aka ma gbanwee uwe aka na ụlọ nyocha mgbe ị na-agagharị n'etiti ebe a họpụtara.E kwesịghị ibugharị reagents na akụrụngwa site na mpaghara ruru unyi gaa ebe dị ọcha.Ọ bụrụ na ikpe dị oke njọ bilitere ebe achọrọ ibugharị reagent ma ọ bụ mpempe akụrụngwa azụ, a ga-ebu ụzọ metọọ ya na 10% sodium hypochlorite, wee jiri mmiri na-adịghị ọcha kpochapụ ya.

Rịba ama

Ihe ngwọta sodium hypochlorite 10% ga-abụ nke ọhụrụ kwa ụbọchị.Mgbe ejiri ya mee ihe maka mkpochapụ, opekempe oge kọntaktị nke nkeji iri kwesịrị ka etinyere ya.
N'aka nke ọzọ, enwere ike iji ngwaahịa ndị dị na azụmaahịa enwetara dị ka DNA na-emebi ihe na-emebi ihe n'elu ma ọ bụrụ na ndụmọdụ nchekwa mpaghara anaghị ekwe ka ojiji sodium hypochlorite ma ọ bụ ọ bụrụ na sodium hypochlorite adabaghị maka imebi akụkụ akụrụngwa nke ọla.

Dị ka o kwesịrị, ndị ọrụ kwesịrị irube isi na ụkpụrụ omume na-arụ ọrụ unidirectional ma ghara isi na mpaghara ruru unyi (post-PCR) laghachi azụ na mpaghara dị ọcha (tupu PCR) n'otu ụbọchị ahụ.Agbanyeghị, enwere ike ịnwe oge mgbe nke a agaghị ekwe omume.Mgbe oge dị otú ahụ bilitere, ndị ọrụ ga-akpachara anya na-asa aka nke ọma, gbanwee uwe aka, na-eji uwe ụlọ nyocha ahapụtara ma ghara iwebata ngwa ọ bụla ha ga-achọ iwepụ n'ime ụlọ ọzọ, dị ka akwụkwọ nyocha.Ekwesịrị imesi usoro nchịkwa ndị dị otú ahụ ike na ọzụzụ ndị ọrụ na usoro molecular.

Mgbe ejirichara ya, a ga-eji 10% sodium hypochlorite hichaa oghere bench (nke mmiri na-adịghị ọcha na-eso iji wepụ ịcha ọcha), 70% ethanol, ma ọ bụ ihe na-emebi emebi nke DNA dị na azụmaahịa.Dị ka o kwesịrị, a ga-etinye oriọna ultra-violet (UV) iji mee ka mmetọ ahụ kwụsị site na irradiation.Agbanyeghị, iji oriọna UV kwesịrị ịmachi na mpaghara arụ ọrụ mechiri emechi, dịka nchekwa nchekwa, iji gbochie mkpughe UV nke ndị ọrụ ụlọ nyocha.Biko soro ntuziaka ndị nrụpụta maka nlekọta oriọna UV, ikuku ikuku na ihicha ka ị hụ na oriọna ka na-arụ ọrụ.

Ọ bụrụ na ị na-eji 70% ethanol kama sodium hypochlorite, irradiation na UV ga-adị mkpa iji mechaa decontamination.
Ejila sodium hypochlorite hichaa vortex na centrifuge;kama, jiri 70% ethanol hichaa ma kpughee ọkụ UV, ma ọ bụ jiri ihe na-emebi DNA na-ere ahịa azụmahịa.Maka ntufu, lelee onye nrụpụta maka ndụmọdụ nhicha ọzọ.Ọ bụrụ na ntuziaka ndị nrụpụta kwere ya, a ga-eji autoclave na-ekpochapụ pipettes mgbe niile.Ọ bụrụ na enweghị ike imechi pipettes, ọ ga-ezuru iji 10% sodium hypochlorite sachaa ha (nke na-esochi ya nke ọma na mmiri na-adịghị ọcha) ma ọ bụ ihe na-emebi DNA na-emebi azụmahịa na-esochi ikpughe UV.

Iji sodium hypochlorite dị elu ihicha nwere ike mebie pipette plastik na ọla ma ọ bụrụ na a na-eme ya mgbe niile;lelee ndụmọdụ sitere n'aka onye nrụpụta mbụ.Ngwa niile kwesịrị ka a na-ahazi ya mgbe niile dị ka usoro ihe nrụpụta tụrụ aro si dị.Onye ahọpụtara kwesịrị ịbụ onye na-ahụ maka ịhụ na a na-agbaso usoro nhazi nhazi, na-edobe ndekọ zuru ezu, na-egosipụtakwa akara ọrụ na akụrụngwa.

3. Jiri na ihicha ndụmọdụ maka oghere molekụla ahapụtara

Pre-PCR: Reagent aliquoting / mastermix nkwadebe: Nke a kwesịrị ịbụ ebe kachasị dị ọcha nke oghere niile ejiri maka nkwadebe nke nnwale molekụla ma bụrụ nke ọma ka ọ bụrụ kọbọd na-erugharị laminar ahaziri nke nwere ọkụ UV.Agaghị ejikwa ihe nlele, acid nucleic amịpụtara na ngwaahịa PCR emelitere na mpaghara a.Ekwesịrị idobe reagents amplification n'ime friza (ma ọ bụ friji, dị ka ndụmọdụ ndị nrụpụta si kwuo) n'otu oghere a họpụtara, nke kachasị n'akụkụ ebe a na-agbapụta laminar ma ọ bụ mpaghara tupu PCR.Ekwesịrị ịgbanwe uwe mkpuchi oge ọ bụla mgbe ị na-abanye na mpaghara tupu PCR ma ọ bụ kabinet eruba laminar.

Ebe tupu PCR ma ọ bụ kabinet eruba laminar kwesịrị ihicha tupu na mgbe ejiri ya dị ka ndị a: Hichapụ ihe niile dị na kabinet, dịka pipettes, igbe n'ọnụ, vortex, centrifuge, tube racks, pen, wdg na 70% ethanol ma ọ bụ a. DNA azụmahịa na-emebi ihe na-emebi emebi, ma kwe ka akpọọ nkụ.N'ihe gbasara ebe a na-arụ ọrụ mechiri emechi, dịka kabinet na-agbapụta laminar, kpughee mkpuchi mkpuchi UV maka nkeji iri atọ.

Rịba ama

Ekpughela reagents na ìhè UV;naanị ịkwaga ha n'ime kabinet ozugbo ọ dị ọcha.Ọ bụrụ na ị na-eme PCR ntụgharị ntụgharị, ọ nwekwara ike inye aka ihichapụ elu na akụrụngwa site na iji ngwọta na-emebi RNases na kọntaktị.Nke a nwere ike inye aka zere nsonaazụ na-adịghị mma sitere na mmebi enzyme nke RNA.Mgbe mkpochapụ na tupu ịkwadebe mastermix, gloves kwesịrị ịgbanwe ọzọ, mgbe ahụ, kabinet dị njikere iji.

Pre-PCR: Nucleic acid mmịpụta/mgbakwunye template:

A ghaghị ịwepụta acid nucleic ma dozie ya na mpaghara nke abụọ a họpụtara, na-eji ụdị pipettes dị iche iche, ndụmọdụ nzacha, tube racks, gloves ọhụrụ, mkpuchi ụlọ nyocha na ngwá ọrụ ndị ọzọ. Ebe a bụkwa maka mgbakwunye nke template, njikwa na trendlines na ndị ọzọ. mastermix tubes ma ọ bụ efere.Iji zere mmetọ nke ihe nlele nucleic acid ewepụtara nke a na-enyocha, a na-atụ aro ka ị gbanwee uwe aka tupu ijikwa njikwa ma ọ bụ ụkpụrụ dị mma yana iji ụdị pipette dị iche.Agaghị ebugharị PCR reagents na ngwaahịa agbakwunyere na mpaghara a.Ekwesịrị ịchekwa ihe nlele n'ime ngwa nju oyi ma ọ bụ ngwa nju oyi n'otu mpaghara ahụ.A ga-ehichapụ ebe ọrụ ihe nlele n'otu ụzọ ahụ dị ka oghere mastermix.

Post-PCR: Mmụba na njikwa ngwaahịa agbakwunyere

Oghere a ahọpụtara bụ maka usoro nkwalite nkwalite ma kwesị ịdị iche n'anụ ahụ na mpaghara tupu PCR.Ọ na-enwekarị ndị na-ekpo ọkụ na ikpo okwu ozugbo, ma ọ dị mma kwesịrị ịnwe kabinet na-agbapụta laminar maka ịgbakwunye ngwaahịa PCR gburugburu 1 na mmeghachi omume nke abụọ, ma ọ bụrụ na a na-eme PCR akwụ ụgwọ.Agaghị ejikwa PCR reagents na acid nucleic amịpụtara na mpaghara a ebe ọ bụ na ihe ize ndụ nke mmetọ dị elu.Ebe a kwesịrị inwe ụdị uwe aka dị iche iche, mkpuchi ụlọ nyocha, efere na tube tube, pipettes, ndụmọdụ nzacha, bins na ngwá ọrụ ndị ọzọ.Tubọ ga-abụ centrifud tupu imeghe.A ga-ehichapụ ebe ọrụ ihe nlele n'otu ụzọ ahụ dị ka oghere mastermix.

Post-PCR: Nyocha ngwaahịa

Ime ụlọ a bụ maka akụrụngwa nchọpụta ngwaahịa, dịka tankị gel electrophoresis, ngwugwu ọkụ, UV transilluminator na sistemụ akwụkwọ gel.Ebe a kwesịrị inwe ụdị uwe aka dị iche iche, mkpuchi ụlọ nyocha, efere na tube tube, pipettes, ndụmọdụ nzacha, bins na akụrụngwa ndị ọzọ.Enweghị ike iwebata reagents ọzọ n'ime mpaghara a, ewezuga ihe eji agba agba, akara molikula na gel agarose, yana ihe nchekwa.A ga-ehichapụ ebe ọrụ ihe nlele n'otu ụzọ ahụ dị ka oghere mastermix.

Ihe ndetu dị mkpa

Dị ka o kwesịrị, a gaghị abanye ụlọ tupu PCR n'otu ụbọchị ahụ ma ọ bụrụ na arụlarị ọrụ n'ime ụlọ post-PCR.Ọ bụrụ na nke a bụ ihe a na-apụghị izere ezere, hụ na a na-ebu ụzọ kwọọ aka nke ọma na a na-eyikwa uwe ụlọ nyocha kpọmkwem n'ime ụlọ.Agaghị ewebata akwụkwọ ụlọ nyocha na akwụkwọ n'ime ụlọ tupu PCR ma ọ bụrụ na ejirila ha n'ime ụlọ post-PCR;ọ bụrụ na ọ dị mkpa, were mbipụta nke protocol/NJ sample, wdg.

4. Ndụmọdụ ihe omimi nke mkpụrụ ndụ ihe nketa

Jiri aka na-enweghị ntụ ntụ iji zere mgbochi nyocha.Usoro ọkpọkọ ziri ezi bụ ihe kacha mkpa iji belata mmetọ.Ọkpụkpọ ọkpọkọ na-ezighi ezi nwere ike ime ka ọ na-efesa mgbe a na-ekesa mmiri mmiri na imepụta ikuku ikuku.Enwere ike ịchọta ezigbo omume maka ọkpọkọ ziri ezi na njikọ ndị a: Ntuziaka Gilson na pipetting, Anachem pipetting technique videos, Centrifuge tubes tupu imeghe, ma meghee ya nke ọma ka ịzere ịgbasa.Mechie tubes ozugbo ejiri ya mee ihe iji zere iwebata mmetọ.

Mgbe ị na-eme ọtụtụ mmeghachi omume, kwadebe otu mastermix nwere reagents nkịtị (dịka mmiri, dNTPs, ihe nchekwa, primers na enzyme) iji belata ọnụ ọgụgụ nke nnyefe reagent ma belata ihe egwu nke mmetọ.A na-atụ aro ka ịmepụta mastermix na ice ma ọ bụ ngọngọ oyi.Iji enzyme mmalite Hot nwere ike inye aka belata mmepụta nke ngwaahịa na-abụghị nke akọwapụtara.Chebe reagents nwere ihe nyocha fluorescent ka ọ ghara imebi.

5. Njikwa n'ime

Gụnye njikwa mara mma, nke akwadoro nke ọma na nke na-adịghị mma, yana njikwa enweghị ndebiri na mmeghachi omume niile, yana usoro nrịbama nke nwere ọtụtụ ihe maka mmeghachi omume ọnụọgụ.Njikwa dị mma ekwesịghị ịdị ike nke na ọ na-ebute ihe egwu mmetọ.Gụnye njikwa mmịpụta dị mma na nke na-adịghị mma mgbe ị na-eme mmịpụta nucleic acid.

A na-atụ aro ka biputere ntuziaka doro anya na mpaghara ọ bụla ka ndị ọrụ wee mara iwu nke omume.Ụlọ nyocha nyocha nke na-achọpụta ọkwa dị ala nke DNA ma ọ bụ RNA dị ala na nlele ụlọ ọgwụ nwere ike ịchọ ịnwe usoro nchekwa ọzọ nke inwe sistemu ikuku dị iche iche nwere ikuku ikuku dị mma n'ime ụlọ tupu PCR yana ikuku ikuku na-adịghị mma n'ime ụlọ post-PCR.

N'ikpeazụ, ịmepụta atụmatụ mmesi obi ike (QA) na-enyere aka.Atụmatụ dị otú ahụ kwesịrị ịgụnye ndepụta nke reagent nna ukwu ebuka na ebuka na-arụ ọrụ, iwu maka ịchekwa ngwa na reagents, mkpesa nke nsonaazụ njikwa, mmemme ọzụzụ ndị ọrụ, algọridim nchọpụta nsogbu, na ihe ndozi mgbe achọrọ ya.

6. Akwụkwọ akụkọ

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Isi nke 3: Ịtọlite ​​ụlọ nyocha qPCR.Akwụkwọ ntuziaka maka ịnwale mmiri ntụrụndụ iji USEPA qPCR usoro 1611. Lansing- Michigan State University.

Ahụike Ọha na England, NHS.Ụkpụrụ UK maka nyocha microbiology: Ezi Laboratory Practice mgbe ị na-eme nyocha mmụba nke molecular).Ntuziaka dị mma.2013; 4 (4): 1–15 .

Miffin T. Ịmepụta ụlọ nyocha PCR.Protoc Cold Spring Harb.2007;7.

Schroeder S 2013. Nlekọta oge niile nke centrifuges: ihicha, mmezi na disinfection nke centrifuges, rotors na nkwụnye (akwụkwọ ọcha No. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Ezi Clinical Laboratory Practice (GCLP) maka ule dabere molekụla ejiri na ụlọ nyocha nyocha, Na: Akyar I, onye nchịkọta akụkọ.Nnukwu ụdịdị njikwa mma.Rijeka, Croatia: Intech;2011: 29–52 .