Metode deteksi molekuler memiliki kemampuan untuk menghasilkan asam nukleat dalam jumlah besar melalui amplifikasi jumlah jejak yang ditemukan dalam sampel.Meskipun bermanfaat untuk mengaktifkan deteksi sensitif, ini juga memperkenalkan kemungkinan kontaminasi melalui penyebaran aerosol amplifikasi di lingkungan laboratorium.Saat melakukan eksperimen, tindakan dapat dilakukan untuk menghindari kontaminasi reagen, peralatan laboratorium, dan ruang bangku, karena kontaminasi tersebut dapat menghasilkan hasil positif palsu (atau negatif palsu).

Untuk membantu mengurangi kemungkinan kontaminasi, Praktik Laboratorium yang Baik harus dilakukan setiap saat.Secara khusus, tindakan pencegahan harus diambil mengenai hal-hal berikut:

1. Penanganan reagen
2. Organisasi ruang kerja dan peralatan
3. Saran penggunaan dan pembersihan untuk ruang molekul yang ditentukan
4. Saran biologi molekuler umum
5. Pengendalian internal
6. Daftar Pustaka

1. Penanganan reagen

Centrifuge tabung reagen sebentar sebelum dibuka untuk menghindari pembentukan aerosol.Aliquot reagen untuk menghindari pencairan beku berkali-kali dan kontaminasi stok induk.Beri label dan tanggal dengan jelas semua reagen dan tabung reaksi dan simpan log lot reagen dan nomor batch yang digunakan dalam semua percobaan.Pipet semua reagen dan sampel menggunakan ujung filter.Sebelum membeli, disarankan untuk mengonfirmasi dengan produsen bahwa ujung filter sesuai dengan merek pipet yang akan digunakan.

2. Organisasi ruang kerja dan peralatan

Ruang kerja harus diatur untuk memastikan aliran pekerjaan terjadi dalam satu arah, dari area bersih (pra-PCR) ke area kotor (pasca-PCR).Tindakan pencegahan umum berikut akan membantu mengurangi kemungkinan kontaminasi.Memiliki ruangan khusus yang terpisah, atau minimal area yang terpisah secara fisik, untuk: persiapan mastermix, ekstraksi asam nukleat dan penambahan templat DNA, amplifikasi dan penanganan produk yang diperkuat, dan analisis produk, misalnya elektroforesis gel.

Dalam beberapa pengaturan, sulit untuk memiliki 4 kamar terpisah.Pilihan yang mungkin tetapi kurang diinginkan adalah melakukan persiapan mastermix di area penahanan, misalnya kabinet aliran laminar.Dalam kasus amplifikasi nested PCR, persiapan mastermix untuk reaksi putaran kedua harus disiapkan di area 'bersih' untuk persiapan mastermix, tetapi inokulasi dengan produk PCR primer harus dilakukan di ruang amplifikasi, dan jika memungkinkan di area penahanan khusus (misalnya kabinet aliran laminar).

Setiap ruangan/area memerlukan seperangkat pipet, ujung filter, rak tabung, vortex, sentrifugal (jika relevan), pena, reagen lab umum, jas lab, dan kotak sarung tangan yang akan tetap berada di stasiun kerja masing-masing.Tangan harus dicuci dan sarung tangan serta jas lab diganti saat bergerak di antara area yang ditentukan.Reagen dan peralatan tidak boleh dipindahkan dari area kotor ke area bersih.Jika terjadi kasus ekstrem di mana reagen atau peralatan perlu dipindahkan ke belakang, pertama-tama harus didekontaminasi dengan natrium hipoklorit 10%, diikuti dengan lap dengan air steril.

Catatan

Larutan natrium hipoklorit 10% harus dibuat segar setiap hari.Ketika digunakan untuk dekontaminasi, waktu kontak minimal 10 menit harus dipatuhi.
Sebagai alternatif, produk yang tersedia secara komersial yang divalidasi sebagai dekontaminan permukaan penghancur DNA dapat digunakan jika rekomendasi keselamatan setempat tidak mengizinkan penggunaan natrium hipoklorit atau jika natrium hipoklorit tidak cocok untuk mendekontaminasi bagian logam peralatan.

Idealnya, staf harus mematuhi etos alur kerja searah dan tidak beralih dari area kotor (pasca-PCR) kembali ke area bersih (pra-PCR) pada hari yang sama.Namun, mungkin ada saat-saat ketika hal ini tidak dapat dihindari.Ketika kesempatan seperti itu muncul, personel harus berhati-hati untuk mencuci tangan secara menyeluruh, mengganti sarung tangan, menggunakan jas lab yang ditunjuk dan tidak memasukkan peralatan apa pun yang ingin mereka bawa keluar ruangan lagi, seperti buku lab.Langkah-langkah pengendalian tersebut harus ditekankan dalam pelatihan staf tentang metode molekuler.

Setelah digunakan, ruang bangku harus dibersihkan dengan natrium hipoklorit 10% (diikuti dengan air steril untuk menghilangkan sisa pemutih), etanol 70%, atau dekontaminan penghancur DNA tervalidasi yang tersedia secara komersial.Idealnya, lampu ultra-violet (UV) harus dipasang untuk memungkinkan dekontaminasi dengan penyinaran.Namun, penggunaan lampu UV harus dibatasi pada area kerja tertutup, misalnya lemari pengaman, untuk membatasi paparan sinar UV staf laboratorium.Patuhi petunjuk produsen untuk perawatan, ventilasi, dan pembersihan lampu UV untuk memastikan lampu tetap efektif.

Jika menggunakan etanol 70% sebagai pengganti natrium hipoklorit, diperlukan penyinaran dengan sinar UV untuk menyelesaikan dekontaminasi.
Jangan bersihkan vortex dan centrifuge dengan sodium hipoklorit;sebagai gantinya, bersihkan dengan etanol 70% dan paparkan ke sinar UV, atau gunakan dekontaminan penghancur DNA komersial.Untuk tumpahan, hubungi produsen untuk saran pembersihan lebih lanjut.Jika instruksi pabrik mengizinkannya, pipet harus disterilkan secara rutin dengan autoklaf.Jika pipet tidak dapat diautoklaf, cukup dibersihkan dengan natrium hipoklorit 10% (diikuti dengan pembersihan menyeluruh dengan air steril) atau dengan dekontaminan penghancur DNA komersial diikuti dengan paparan sinar UV.

Membersihkan dengan natrium hipoklorit persentase tinggi pada akhirnya dapat merusak plastik dan logam pipet jika dilakukan secara teratur;periksa rekomendasi dari pabrikan terlebih dahulu.Semua peralatan perlu dikalibrasi secara teratur sesuai dengan jadwal yang direkomendasikan pabrikan.Seseorang yang ditunjuk harus bertanggung jawab untuk memastikan bahwa jadwal kalibrasi dipatuhi, log terperinci dipelihara, dan label servis ditampilkan dengan jelas pada peralatan.

3. Saran penggunaan dan pembersihan untuk ruang molekul yang ditentukan

Pra-PCR: Reagen aliquoting / persiapan mastermix: Ini harus menjadi yang terbersih dari semua ruang yang digunakan untuk persiapan eksperimen molekuler dan idealnya harus berupa kabinet aliran laminar yang dilengkapi dengan lampu UV.Sampel, asam nukleat yang diekstraksi, dan produk PCR yang diamplifikasi tidak boleh ditangani di area ini.Reagen amplifikasi harus disimpan dalam freezer (atau kulkas, sesuai rekomendasi pabrikan) di tempat yang sama, idealnya di sebelah kabinet aliran laminar atau area pra-PCR.Sarung tangan harus diganti setiap kali memasuki area pra-PCR atau kabinet aliran laminar.

Area pra-PCR atau kabinet aliran laminar harus dibersihkan sebelum dan sesudah digunakan sebagai berikut: Lap semua barang di kabinet, misalnya pipet, kotak ujung, pusaran, sentrifugal, rak tabung, pena, dll. dengan etanol 70% atau dekontaminan perusak DNA komersial, dan biarkan mengering.Jika area kerja tertutup, misalnya kabinet aliran laminar, paparkan tudung ke sinar UV selama 30 menit.

Catatan

Jangan memaparkan reagen ke sinar UV;hanya pindahkan ke dalam kabinet setelah bersih.Jika melakukan PCR transkripsi balik, menyeka permukaan dan peralatan mungkin juga berguna dengan larutan yang memecah RNases saat bersentuhan.Ini dapat membantu menghindari hasil negatif palsu dari degradasi enzim RNA.Setelah dekontaminasi dan sebelum menyiapkan mastermix, sarung tangan harus diganti sekali lagi, dan kabinet siap digunakan.

Pra-PCR: Ekstraksi asam nukleat/penambahan templat:

Asam nukleat harus diekstraksi dan ditangani di area kedua yang ditentukan, menggunakan seperangkat pipet, ujung filter, rak tabung, sarung tangan baru, jas lab, dan peralatan lain yang terpisah. Area ini juga untuk penambahan templat, kontrol, dan garis tren ke tabung atau piring mastermix.Untuk menghindari kontaminasi sampel asam nukleat yang diekstrak yang sedang dianalisis, disarankan untuk mengganti sarung tangan sebelum menangani kontrol atau standar positif dan menggunakan satu set pipet terpisah.Reagen PCR dan produk amplifikasi tidak boleh dipipet di area ini.Sampel harus disimpan di lemari es atau freezer yang ditunjuk di area yang sama.Ruang kerja sampel harus dibersihkan dengan cara yang sama seperti ruang mastermix.

Post-PCR: Amplifikasi dan penanganan produk yang diamplifikasi

Ruang yang ditunjuk ini untuk proses pasca-amplifikasi dan harus terpisah secara fisik dari area pra-PCR.Biasanya berisi thermocyclers dan platform real-time, dan idealnya harus memiliki kabinet aliran laminar untuk menambahkan produk PCR putaran 1 ke reaksi putaran 2, jika PCR bersarang sedang dilakukan.Reagen PCR dan asam nukleat yang diekstraksi tidak boleh ditangani di area ini karena risiko kontaminasi tinggi.Area ini harus memiliki seperangkat sarung tangan, jas lab, rak piring dan tabung, pipet, ujung filter, tempat sampah dan peralatan lainnya yang terpisah.Tabung harus disentrifugasi sebelum dibuka.Ruang kerja sampel harus dibersihkan dengan cara yang sama seperti ruang mastermix.

Post-PCR: Analisis produk

Ruangan ini untuk peralatan deteksi produk, misalnya tangki elektroforesis gel, paket daya, transiluminator UV, dan sistem dokumentasi gel.Area ini harus memiliki set sarung tangan, jas lab, rak piring dan tabung yang terpisah, pipet, ujung filter, tempat sampah dan peralatan lainnya.Tidak ada reagen lain yang dapat dibawa ke area ini, kecuali loading dye, penanda molekuler dan gel agarosa, serta komponen penyangga.Ruang kerja sampel harus dibersihkan dengan cara yang sama seperti ruang mastermix.

Catatan penting

Idealnya, ruang pra-PCR tidak boleh dimasuki pada hari yang sama jika pekerjaan sudah dilakukan di ruang pasca-PCR.Jika hal ini benar-benar tidak dapat dihindari, pastikan tangan dicuci bersih terlebih dahulu dan jas lab khusus dipakai di kamar.Buku dan dokumen lab tidak boleh dibawa ke ruang pra-PCR jika telah digunakan di ruang pasca-PCR;jika perlu, ambil duplikat cetakan protokol/ID sampel, dll.

4. Saran biologi molekuler umum

Gunakan sarung tangan bebas bedak untuk menghindari penghambatan pengujian.Teknik pemipetan yang benar sangat penting untuk mengurangi kontaminasi.Pemipetan yang salah dapat mengakibatkan percikan saat mengeluarkan cairan dan terbentuknya aerosol.Praktik yang baik untuk pemipetan yang benar dapat ditemukan di tautan berikut: Panduan Gilson untuk pemipetan, video teknik pemipetan Anachem, Tabung centrifuge sebelum dibuka, dan buka dengan hati-hati untuk menghindari percikan.Tutup tabung segera setelah digunakan untuk menghindari masuknya kontaminan.

Saat melakukan beberapa reaksi, siapkan satu mastermix yang berisi reagen umum (misalnya air, dNTP, buffer, primer, dan enzim) untuk meminimalkan jumlah transfer reagen dan mengurangi ancaman kontaminasi.Direkomendasikan untuk menyiapkan mastermix di atas es atau balok dingin.Penggunaan enzim Hot Start dapat membantu mengurangi produksi produk non-spesifik.Lindungi reagen yang mengandung probe fluoresen dari cahaya untuk menghindari degradasi.

5. Pengendalian internal

Sertakan kontrol positif dan negatif yang ditandai dengan baik, dikonfirmasi, bersama dengan kontrol tanpa templat di semua reaksi, dan garis tren titrasi multi-titik untuk reaksi kuantitatif.Kontrol positif tidak boleh terlalu kuat sehingga menimbulkan risiko kontaminasi.Sertakan kontrol ekstraksi positif dan negatif saat melakukan ekstraksi asam nukleat.

Direkomendasikan agar instruksi yang jelas dipasang di setiap area sehingga pengguna mengetahui aturan perilaku.Laboratorium diagnostik yang mendeteksi tingkat DNA atau RNA yang sangat rendah dalam sampel klinis mungkin ingin menerapkan langkah keamanan tambahan dengan memiliki sistem penanganan udara terpisah dengan tekanan udara sedikit positif di ruang pra-PCR dan tekanan udara sedikit negatif di ruang pasca-PCR.

Terakhir, mengembangkan rencana jaminan kualitas (QA) sangat membantu.Rencana tersebut harus mencakup daftar stok induk reagen dan stok kerja, aturan untuk menyimpan kit dan reagen, pelaporan hasil kontrol, program pelatihan staf, algoritme pemecahan masalah, dan tindakan perbaikan bila diperlukan.

6. Daftar Pustaka

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Bab 3: Menyiapkan laboratorium qPCR.Dokumen panduan untuk menguji perairan rekreasional menggunakan metode USEPA qPCR 1611. Lansing-Michigan State University.

Kesehatan Masyarakat Inggris, NHS.Standar Inggris untuk penyelidikan mikrobiologi: Praktik Laboratorium yang Baik saat melakukan pengujian amplifikasi molekuler).Bimbingan Kualitas.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Menyiapkan laboratorium PCR.Protokol Cold Spring Harb.2007;7.

Schroeder S 2013. Perawatan rutin sentrifugal: pembersihan, perawatan, dan desinfeksi sentrifugal, rotor, dan adaptor (Buku putih No. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) untuk uji berbasis molekuler yang digunakan di laboratorium diagnostik, Dalam: Akyar I, editor.Spektrum kontrol kualitas yang luas.Rijeka, Kroasia: Intech;2011: 29–52.