Մոլեկուլային հայտնաբերման մեթոդները հնարավորություն ունեն մեծ ծավալով նուկլեինաթթու արտադրել նմուշներում հայտնաբերված հետքային քանակությունների ուժեղացման միջոցով:Թեև սա օգտակար է զգայուն հայտնաբերումը հնարավոր դարձնելու համար, այն նաև ներկայացնում է աղտոտման հնարավորությունը լաբորատոր միջավայրում ուժեղացնող աերոզոլների տարածման միջոցով:Փորձարկումներ կատարելիս կարող են միջոցներ ձեռնարկվել ռեակտիվների, լաբորատոր սարքավորումների և նստարանի տարածքի աղտոտումից խուսափելու համար, քանի որ նման աղտոտումը կարող է առաջացնել կեղծ դրական (կամ կեղծ բացասական) արդյունքներ:

Աղտոտման հավանականությունը նվազեցնելու համար պետք է մշտապես կիրառել Լավ լաբորատոր պրակտիկա:Մասնավորապես, նախազգուշական միջոցներ պետք է ձեռնարկվեն հետևյալ կետերի վերաբերյալ.

1. Ռեակտիվների բեռնաթափում
2. Աշխատանքային տարածքի և սարքավորումների կազմակերպում
3. Օգտագործեք և մաքրելու խորհուրդներ նշանակված մոլեկուլային տարածության համար
4. Ընդհանուր մոլեկուլային կենսաբանության խորհուրդներ
5. Ներքին հսկողություն
6. Մատենագիտություն

1. Ռեակտիվների բեռնաթափում

Հակիրճ ցենտրիֆուգեք ռեագենտի խողովակները բացելուց առաջ՝ աերոզոլների առաջացումից խուսափելու համար:Aliquot ռեակտիվներ՝ բազմաթիվ սառցակալումներից և հիմնական պաշարների աղտոտումից խուսափելու համար:Հստակ պիտակավորեք և թվագրեք ռեակտիվների և ռեակցիայի բոլոր խողովակները և պահպանեք ռեակտիվների խմբաքանակի և խմբաքանակի համարների մատյանները, որոնք օգտագործվում են բոլոր փորձերում:Բոլոր ռեակտիվները և նմուշները պիպետտացրեք՝ օգտագործելով ֆիլտրի ծայրերը:Նախքան գնելը, խորհուրդ է տրվում արտադրողի հետ հաստատել, որ ֆիլտրի ծայրերը համապատասխանում են օգտագործվող պիպետտի ապրանքանիշին:

2. Աշխատանքային տարածքի և սարքավորումների կազմակերպում

Աշխատանքային տարածքը պետք է կազմակերպվի այնպես, որ աշխատանքի հոսքը տեղի ունենա մեկ ուղղությամբ՝ մաքուր տարածքներից (նախա-PCR) մինչև կեղտոտ տարածքներ (հետ-PCR):Հետևյալ ընդհանուր նախազգուշական միջոցները կօգնեն նվազեցնել աղտոտման հավանականությունը.Առանձին նշանակված սենյակներ կամ նվազագույնը ֆիզիկապես առանձնացված տարածքներ ունենան՝ մաստերմիքս պատրաստելու, նուկլեինաթթվի արդյունահանման և ԴՆԹ ձևանմուշի ավելացման, ուժեղացված արտադրանքի ամպլիֆիկացման և մշակման և արտադրանքի վերլուծության համար, օրինակ՝ գելային էլեկտրոֆորեզ:

Որոշ պարամետրերում 4 առանձին սենյակ ունենալը դժվար է:Հնարավոր, բայց ոչ այնքան ցանկալի տարբերակն է մաստերմիքսի պատրաստումը զսպման տարածքում, օրինակ՝ շերտավոր հոսքի պահարանում:Ներդրված ՊՇՌ ամպլիֆիկացիայի դեպքում, երկրորդ փուլի ռեակցիայի համար մաստերմիքսի պատրաստումը պետք է պատրաստվի «մաքուր» տարածքում՝ մաստերմիքս պատրաստելու համար, բայց առաջնային PCR արտադրանքի հետ պատվաստումը պետք է կատարվի ուժեղացման սենյակում, և եթե հնարավոր է. հատուկ զսպման տարածքում (օրինակ՝ շերտավոր հոսքի պահարան):

Յուրաքանչյուր սենյակ/տարածք պետք է հստակ պիտակավորված պիպետների, ֆիլտրերի ծայրերի, խողովակների դարակաշարերի, պտույտների, ցենտրիֆուգների (անհրաժեշտության դեպքում), գրիչների, ընդհանուր լաբորատոր ռեակտիվների, լաբորատոր վերարկուների և ձեռնոցների առանձին փաթեթի, որոնք կմնան իրենց համապատասխան աշխատատեղերում:Նշանակված տարածքների միջև շարժվելիս ձեռքերը պետք է լվացվեն, իսկ ձեռնոցներն ու լաբորատոր վերարկուները փոխվեն:Ռեակտիվները և սարքավորումները չպետք է տեղափոխվեն կեղտոտ տարածքից մաքուր տարածք:Եթե ​​ծայրահեղ դեպք առաջանա, երբ ռեագենտը կամ սարքավորումը պետք է ետ տեղափոխվի, այն նախ պետք է ախտահանվի 10% նատրիումի հիպոքլորիտով, որից հետո մաքրվի ստերիլ ջրով:

Նշում

Նատրիումի հիպոքլորիտի 10% լուծույթը պետք է ամեն օր թարմացվի:Երբ օգտագործվում է վարակազերծման համար, պետք է պահպանել նվազագույնը 10 րոպե շփման ժամանակը:
Որպես այլընտրանք, առևտրային հասանելի արտադրանքները, որոնք վավերացված են որպես ԴՆԹ-քանդող մակերևութային ախտահանիչներ, կարող են օգտագործվել, եթե տեղական անվտանգության առաջարկությունները թույլ չեն տալիս օգտագործել նատրիումի հիպոքլորիտը կամ եթե նատրիումի հիպոքլորիտը հարմար չէ սարքավորումների մետաղական մասերը ախտահանելու համար:

Իդեալում, անձնակազմը պետք է պահպանի միակողմանի աշխատանքային հոսքի էթոսը և չգնա կեղտոտ տարածքներից (հետ-PCR) նույն օրը մաքուր տարածքներ (նախա-PCR):Այնուամենայնիվ, կարող են լինել դեպքեր, երբ դա անխուսափելի է:Երբ նման դեպք է առաջանում, անձնակազմը պետք է հոգ տանի, որ մանրակրկիտ լվացի ձեռքերը, փոխի ձեռնոցները, օգտագործի նշանակված լաբորատոր վերարկուն և չներդնի որևէ սարքավորում, որը կցանկանա նորից դուրս բերել սենյակից, օրինակ՝ լաբորատոր գրքեր:Նման հսկողության միջոցառումները պետք է ընդգծվեն մոլեկուլային մեթոդների վերաբերյալ անձնակազմի վերապատրաստման ժամանակ:

Օգտագործելուց հետո նստարանների տարածքները պետք է մաքրվեն 10% նատրիումի հիպոքլորիտով (այնուհետև ստերիլ ջրով՝ մնացորդային սպիտակեցումը հեռացնելու համար), 70% էթանոլով կամ ԴՆԹ-ն ոչնչացնող առևտրային հասանելի վավերացված ախտահանիչով:Իդեալում, ուլտրամանուշակագույն (ուլտրամանուշակագույն) լամպերը պետք է տեղադրվեն, որպեսզի հնարավոր լինի վնասազերծել ճառագայթման միջոցով:Այնուամենայնիվ, ուլտրամանուշակագույն լամպերի օգտագործումը պետք է սահմանափակվի փակ աշխատանքային տարածքներով, օրինակ՝ անվտանգության պահարաններով, որպեսզի սահմանափակվի լաբորատոր անձնակազմի ուլտրամանուշակագույն ճառագայթումը:Խնդրում ենք պահպանել ուլտրամանուշակագույն լամպերի խնամքի, օդափոխության և մաքրման արտադրողի ցուցումները՝ ապահովելու համար, որ լամպերը մնան արդյունավետ:

Եթե ​​նատրիումի հիպոքլորիտի փոխարեն օգտագործվում է 70% էթանոլ, ապա աղտոտումն ավարտելու համար անհրաժեշտ կլինի ուլտրամանուշակագույն ճառագայթում:
Մի մաքրեք հորձանուտը և ցենտրիֆուգը նատրիումի հիպոքլորիտով;փոխարենը սրբել 70% էթանոլով և ենթարկել ուլտրամանուշակագույն լույսի ազդեցությանը կամ օգտագործել ԴՆԹ-ն ոչնչացնող կոմերցիոն ախտահանիչ:Արտահոսքի դեպքում դիմեք արտադրողի հետ մաքրման վերաբերյալ լրացուցիչ խորհուրդների համար:Եթե ​​արտադրողի հրահանգները դա թույլ են տալիս, պիպետները պետք է կանոնավոր կերպով ստերիլիզացվեն ավտոկլավով:Եթե ​​պիպետները չեն կարող ավտոկլավացվել, բավական է դրանք մաքրել 10% նատրիումի հիպոքլորիտով (որին հաջորդում է մանրակրկիտ մաքրումը ստերիլ ջրով) կամ առևտրային ԴՆԹ-ն ոչնչացնող ախտահանիչով, որին հաջորդում է ուլտրամանուշակագույն ճառագայթումը:

Նատրիումի հիպոքլորիտով բարձր տոկոսով մաքրումը կարող է ի վերջո վնասել պիպետների պլաստմասսաները և մետաղները, եթե կանոնավոր կերպով կատարվի:նախ ստուգեք արտադրողի առաջարկությունները:Բոլոր սարքավորումները պետք է կանոնավոր չափորոշվեն՝ ըստ արտադրողի առաջարկած ժամանակացույցի:Նշանակված անձը պետք է պատասխանատու լինի ստուգաչափման ժամանակացույցի պահպանմանը, մանրամասն գրանցամատյանների պահպանմանը և սարքավորումների վրա հստակ ցուցադրելու սպասարկման պիտակներին:

3. Օգտագործեք և մաքրելու խորհուրդներ նշանակված մոլեկուլային տարածության համար

Pre-PCR. Ռեագենտի մասնատում/մաստերի խառնուրդի պատրաստում. սա պետք է լինի ամենամաքուրը մոլեկուլային փորձերի պատրաստման համար օգտագործվող բոլոր տարածքներից և իդեալականորեն պետք է լինի նշանակված շերտավոր հոսքի պահարան՝ հագեցած ուլտրամանուշակագույն լույսով:Նմուշները, արդյունահանված նուկլեինաթթուները և ուժեղացված PCR արտադրանքները չպետք է մշակվեն այս տարածքում:Ուժեղացման ռեակտիվները պետք է պահվեն սառցարանում (կամ սառնարանում, ըստ արտադրողի առաջարկությունների) նույն նշանակված տարածքում, իդեալականորեն լամինար հոսքի պահարանի կամ նախնական PCR տարածքի կողքին:Ձեռնոցները պետք է փոխվեն ամեն անգամ, երբ մուտք գործեք նախնական PCR տարածք կամ շերտավոր հոսքի պահարան:

Pre-PCR տարածքը կամ շերտավոր հոսքի պահարանը պետք է մաքրվի օգտագործելուց առաջ և հետո հետևյալ կերպ. Սրբեք պահարանի բոլոր իրերը, օրինակ՝ պիպետները, ծայրային տուփերը, պտտահողմը, ցենտրիֆուգը, խողովակների դարակները, գրիչները և այլն 70% էթանոլով կամ Առևտրային ԴՆԹ-քանդող ախտահանիչ և թույլ տվեք չորացնել:Փակ աշխատանքային տարածքի դեպքում, օրինակ՝ շերտավոր հոսքի պահարան, գլխարկը 30 րոպե ցուցադրեք ուլտրամանուշակագույն լույսի ներքո:

Նշում

Մի ենթարկեք ռեակտիվները ուլտրամանուշակագույն լույսի ներքո;միայն տեղափոխեք դրանք պահարան, երբ այն մաքուր է:Հակադարձ տրանսկրիպցիոն PCR-ն իրականացնելու դեպքում կարող է նաև օգտակար լինել մակերեսները և սարքավորումները մաքրել այնպիսի լուծույթով, որը շփվելիս քայքայում է RNase-ները:Սա կարող է օգնել խուսափել ՌՆԹ-ի ֆերմենտների քայքայման կեղծ բացասական արդյունքներից:Վնասազերծումից և մաստերմիքս պատրաստելուց առաջ ձեռնոցները պետք է ևս մեկ անգամ փոխել, այնուհետև պահարանը պատրաստ է օգտագործման:

Pre-PCR՝ նուկլեինաթթվի արդյունահանում/կաղապարի ավելացում.

Նուկլեինաթթուն պետք է արդյունահանվի և մշակվի երկրորդ նշանակված տարածքում՝ օգտագործելով պիպետների, ֆիլտրերի ծայրերի, խողովակների դարակաշարերի, թարմ ձեռնոցների, լաբորատոր վերարկուների և այլ սարքավորումների առանձին հավաքածու: mastermix խողովակներ կամ թիթեղներ:Անալիզի ենթարկվող արդյունահանված նուկլեինաթթվի նմուշների աղտոտումից խուսափելու համար խորհուրդ է տրվում փոխել ձեռնոցները՝ նախքան դրական հսկողության կամ ստանդարտների հետ աշխատելը և օգտագործել պիպետների առանձին հավաքածու:PCR ռեակտիվները և ուժեղացված արտադրանքները չպետք է պիպետտացվեն այս հատվածում:Նմուշները պետք է պահվեն նույն տարածքում նախատեսված սառնարաններում կամ սառցարաններում:Նմուշի աշխատանքային տարածքը պետք է մաքրվի այնպես, ինչպես վարպետի խառնուրդի տարածքը:

Հետ-PCR. ուժեղացված արտադրանքի ուժեղացում և մշակում

Այս նշանակված տարածքը նախատեսված է հետուժեղացման գործընթացների համար և պետք է ֆիզիկապես առանձնացված լինի PCR-ից առաջ:Այն սովորաբար պարունակում է թերմոցիկլերներ և իրական ժամանակի հարթակներ, և իդեալականորեն պետք է ունենա լամինար հոսքի պահարան՝ կլոր 1 PCR արտադրանքը 2-րդ փուլի ռեակցիային ավելացնելու համար, եթե իրականացվում է nested PCR:PCR ռեակտիվները և արդյունահանվող նուկլեինաթթուն չպետք է օգտագործվեն այս տարածքում, քանի որ աղտոտման վտանգը մեծ է:Այս տարածքը պետք է ունենա ձեռնոցների, լաբորատոր վերարկուների, թիթեղների և խողովակների դարակաշարերի, պիպետների, ֆիլտրի ծայրերի, աղբամանների և այլ սարքավորումների առանձին հավաքածու:Խողովակները բացելուց առաջ պետք է ցենտրիֆուգվեն:Նմուշի աշխատանքային տարածքը պետք է մաքրվի այնպես, ինչպես վարպետի խառնուրդի տարածքը:

Հետ-PCR. Ապրանքի վերլուծություն

Այս սենյակը նախատեսված է արտադրանքի հայտնաբերման սարքավորումների համար, օրինակ՝ գելային էլեկտրոֆորեզի տանկերի, սնուցման տուփերի, ուլտրամանուշակագույն տրանսլյումինատորի և գելային փաստաթղթերի համակարգի համար:Այս տարածքը պետք է ունենա ձեռնոցների առանձին հավաքածուներ, լաբորատոր վերարկուներ, ափսեների և խողովակների դարակներ, պիպետներ, ֆիլտրերի ծայրեր, աղբամաններ և այլ սարքավորումներ:Այլ ռեակտիվներ չեն կարող ներմուծվել այս տարածք, բացառությամբ բեռնման ներկի, մոլեկուլային մարկերի և ագարոզայի գելի և բուֆերային բաղադրիչների:Նմուշի աշխատանքային տարածքը պետք է մաքրվի այնպես, ինչպես վարպետի խառնուրդի տարածքը:

Կարևոր նշում

Իդեալում, նախնական ՊՇՌ սենյակները չպետք է մուտքագրվեն նույն օրը, եթե աշխատանքն արդեն կատարվել է հետՊՇՌ սենյակներում:Եթե ​​դա բացարձակապես անխուսափելի է, համոզվեք, որ նախ ձեռքերը մանրակրկիտ լվացվեն, և որ սենյակներում հատուկ լաբորատոր վերարկուներ կրեն:Լաբորատոր գրքերը և փաստաթղթերը չպետք է տեղափոխվեն նախնական ՊՇՌ սենյակներ, եթե դրանք օգտագործվել են հետՊՇՌ սենյակներում.անհրաժեշտության դեպքում, պատճենեք արձանագրությունների/նմուշների նույնականացման պատճենները և այլն:

4. Ընդհանուր մոլեկուլային կենսաբանության խորհուրդներ

Օգտագործեք առանց փոշի ձեռնոցներ՝ վերլուծության արգելակումից խուսափելու համար:Պիպերտավորման ճիշտ տեխնիկան առաջնային է աղտոտվածությունը նվազեցնելու համար:Սխալ խողովակաշարը կարող է հանգեցնել հեղուկներ բաժանելիս շաղ տալ և աերոզոլներ ստեղծել:Պիպերտավորման ճիշտ պրակտիկան կարելի է գտնել հետևյալ հղումներում. Gilson-ի ուղեցույց՝ պիպերտավորման համար, Anachem pipetting տեխնիկայի տեսանյութեր, Ցենտրիֆուգեք խողովակները բացելուց առաջ և զգուշորեն բացեք դրանք՝ խուսափելու համար շփվելուց:Օգտագործելուց անմիջապես հետո փակեք խողովակները՝ աղտոտող նյութերի ներմուծումից խուսափելու համար:

Բազմաթիվ ռեակցիաներ կատարելիս պատրաստեք ընդհանուր ռեակտիվներ (օրինակ՝ ջուր, dNTPs, բուֆեր, պրայմերներ և ֆերմենտներ) պարունակող մեկ հիմնական խառնուրդ՝ ռեագենտների տեղափոխման քանակը նվազագույնի հասցնելու և աղտոտման վտանգը նվազեցնելու համար:Խորհուրդ է տրվում տեղադրել մաստերմիքս սառույցի կամ սառը բլոկի վրա:Hot Start ֆերմենտի օգտագործումը կարող է օգնել նվազեցնել ոչ հատուկ արտադրանքի արտադրությունը:Պաշտպանեք լյումինեսցենտային զոնդերը պարունակող ռեակտիվները լույսից՝ քայքայվելուց խուսափելու համար:

5. Ներքին հսկողություն

Ներառեք լավ բնութագրված, հաստատված դրական և բացասական հսկիչները, ինչպես նաև առանց կաղապարի հսկողություն բոլոր ռեակցիաներում, և քանակական ռեակցիաների համար բազմաբնույթ տիտրացված միտում:Դրական վերահսկողությունը չպետք է լինի այնքան ուժեղ, որ աղտոտման վտանգ ներկայացնի:Ներառեք դրական և բացասական արդյունահանման հսկիչները նուկլեինաթթվի արդյունահանման ժամանակ:

Առաջարկվում է հստակ հրահանգներ տեղադրել յուրաքանչյուր բնագավառում, որպեսզի օգտվողները տեղյակ լինեն վարքագծի կանոններին:Կլինիկական նմուշներում ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի շատ ցածր մակարդակ հայտնաբերող ախտորոշիչ լաբորատորիաները կարող են ընդունել անվտանգության լրացուցիչ միջոց՝ ունենալով առանձին օդափոխման համակարգեր՝ մի փոքր դրական օդի ճնշմամբ նախաՊՇՌ սենյակներում և մի փոքր բացասական օդի ճնշմամբ՝ հետՊՇՌ սենյակներում:

Վերջապես, որակի ապահովման (ՈԱ) պլանի մշակումը օգտակար է:Նման պլանը պետք է ներառի ռեագենտների հիմնական պաշարների և աշխատանքային պաշարների ցուցակները, փաթեթների և ռեագենտների պահպանման կանոնները, հսկողության արդյունքների մասին հաշվետվությունը, անձնակազմի վերապատրաստման ծրագրերը, անսարքությունների վերացման ալգորիթմները և անհրաժեշտության դեպքում ուղղիչ գործողություններ:

6. Մատենագիտություն

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Գլուխ 3. qPCR լաբորատորիայի ստեղծում:Ուղեցույց փաստաթուղթ հանգստի ջրերի փորձարկման համար USEPA qPCR մեթոդով 1611. Lansing-Michigan State University.

Հանրային առողջապահություն Անգլիա, NHS.Մեծ Բրիտանիայի ստանդարտներ մանրէաբանական հետազոտությունների համար. Լավ լաբորատոր պրակտիկա մոլեկուլային ուժեղացման փորձարկումներ կատարելիս):Որակի ուղեցույց:2013; 4 (4): 1–15.

Mifflin T. PCR լաբորատորիայի ստեղծում:Cold Spring Harb Protoc.2007; 7.

Schroeder S 2013. Ցենտրիֆուգների սովորական սպասարկում. ցենտրիֆուգների, ռոտորների և ադապտերների մաքրում, սպասարկում և ախտահանում (Սպիտակ թուղթ No 14):Համբուրգ՝ Էպենդորֆ;2013 թ.

Viana RV, Wallis CL.Լավ կլինիկական լաբորատոր պրակտիկա (GCLP) ախտորոշիչ լաբորատորիաներում օգտագործվող մոլեկուլային թեստերի համար, In: Akyar I, խմբագիր:Որակի վերահսկման լայն սպեկտր:Ռիեկա, Խորվաթիա. Intech;2011: 29–52.