A molekuláris kimutatási módszerek képesek nagy mennyiségű nukleinsav előállítására a mintákban található nyomnyi mennyiségek amplifikációjával.Bár ez előnyös az érzékeny észlelés lehetővé tétele szempontjából, egyúttal a szennyeződés lehetőségét is bevezeti az amplifikációs aeroszolok laboratóriumi környezetben való szétterjedése révén.Kísérletek végzése során intézkedéseket lehet tenni a reagensek, a laboratóriumi berendezések és a munkapadi tér szennyeződésének elkerülésére, mivel az ilyen szennyeződés hamis pozitív (vagy hamis negatív) eredményeket generálhat.

A fertőzés valószínűségének csökkentése érdekében mindig be kell tartani a helyes laboratóriumi gyakorlatot.Konkrétan a következő pontokkal kapcsolatban kell óvintézkedéseket tenni:

1. Reagensek kezelése
2. Munkaterület és felszerelés szervezése
3. Használati és tisztítási tanácsok a kijelölt molekulatérhez
4. Általános molekuláris biológiai tanácsok
5. Belső ellenőrzések
6. Bibliográfia

1. Reagensek kezelése

Felnyitás előtt röviden centrifugálja a reagenscsöveket, hogy elkerülje az aeroszolok képződését.A reagenseket aliquot részekre osztva elkerülje a többszöri fagyasztást és felolvasztást és a törzskészletek szennyeződését.Minden reagens- és reakciócsövet egyértelműen címkézzen és keltezzen, és vezessen naplót az összes kísérletben használt reagens tételekről és tételszámokról.Pipettázza az összes reagenst és mintát szűrőhegyekkel.Vásárlás előtt tanácsos a gyártóval egyeztetni, hogy a szűrőhegyek megfelelnek-e a használni kívánt pipetta márkájának.

2. Munkaterület és felszerelés szervezése

A munkaterületet úgy kell megszervezni, hogy a munka egy irányba történjen, a tiszta területektől (PCR előtt) a piszkos területekig (PCR után).A következő általános óvintézkedések segítenek csökkenteni a szennyeződés esélyét.Rendelkezzen külön kijelölt helyiségekkel, vagy legalább fizikailag különálló területekkel a következőkhöz: mastermix elkészítése, nukleinsav extrakció és DNS templát hozzáadása, amplifikáció és amplifikált termék kezelése, valamint termékelemzés, pl. gélelektroforézis.

Bizonyos körülmények között nehéz 4 külön szobát kialakítani.Egy lehetséges, de kevésbé kívánatos lehetőség az, hogy a mastermix előkészítését elzárt területen, pl. lamináris áramlási szekrényben végezzük.Nested PCR amplifikáció esetén a mastermix előkészítését a második kör reakciójához a mastermix elkészítéséhez szükséges „tiszta” területen kell elkészíteni, de az elsődleges PCR termékkel történő beoltást az amplifikációs helyiségben kell elvégezni, és lehetőség szerint. erre a célra kialakított elszigetelési területen (pl. lamináris áramlási szekrényben).

Minden helyiséghez/területhez külön egyértelműen felcímkézett pipetták, szűrőhegyek, csőtartók, örvények, centrifugák (ha szükséges), tollak, általános laboratóriumi reagensek, laborköpenyek és kesztyűs dobozok szükségesek, amelyek a megfelelő munkaállomásokon maradnak.A kijelölt helyek közötti mozgás során kezet kell mosni, kesztyűt és laborköpenyt kell cserélni.A reagenseket és a berendezéseket nem szabad piszkos területről tiszta helyre vinni.Ha olyan extrém eset állna elő, amikor egy reagenst vagy berendezést hátrafelé kell mozgatni, először 10%-os nátrium-hipoklorittal fertőtleníteni kell, majd steril vízzel le kell törölni.

jegyzet

A 10%-os nátrium-hipoklorit oldatot naponta frissen kell pótolni.Ha fertőtlenítésre használják, legalább 10 perces érintkezési időt kell betartani.
Alternatív megoldásként a kereskedelemben kapható, DNS-romboló felületi fertőtlenítőszerként validált termékek használhatók, ha a helyi biztonsági ajánlások nem teszik lehetővé a nátrium-hipoklorit használatát, vagy ha a nátrium-hipoklorit nem alkalmas a berendezés fémrészeinek dekontaminálására.

Ideális esetben a személyzetnek be kell tartania az egyirányú munkafolyamat ethoszát, és nem kell ugyanazon a napon visszamennie a piszkos területekről (PCR után) a tiszta területekre (PCR előtt).Előfordulhat azonban, hogy ez elkerülhetetlen.Amikor ilyen alkalom adódik, a személyzetnek gondoskodnia kell arról, hogy alaposan mosson kezet, cseréljen kesztyűt, viselje a kijelölt laborköpenyt, és ne helyezzen be olyan felszerelést, amelyet újra ki szeretne vinni a helyiségből, például laboratóriumi könyveket.Az ilyen ellenőrzési intézkedéseket hangsúlyozni kell a személyzet molekuláris módszerekkel kapcsolatos képzésében.

Használat után a munkapad tereit 10%-os nátrium-hipoklorittal (majd steril vízzel a maradék fehérítő eltávolítására), 70%-os etanollal vagy a kereskedelemben kapható, DNS-romboló fertőtlenítőszerrel kell megtisztítani.Ideális esetben ultraibolya (UV) lámpákat kell felszerelni a besugárzással történő fertőtlenítés érdekében.Az UV-lámpák használatát azonban zárt munkaterületekre, pl. biztonsági szekrényekre kell korlátozni, hogy korlátozzuk a laboratóriumi személyzet UV-sugárzását.Kérjük, tartsa be a gyártó utasításait az UV-lámpák ápolására, szellőztetésére és tisztítására vonatkozóan, hogy a lámpák hatékonyak maradjanak.

Ha nátrium-hipoklorit helyett 70%-os etanolt használ, akkor a dekontamináció befejezéséhez UV-fénnyel történő besugárzásra lesz szükség.
Ne tisztítsa az örvényt és a centrifugálást nátrium-hipoklorittal;ehelyett törölje le 70%-os etanollal, és tegye ki UV fénynek, vagy használjon kereskedelmi forgalomban kapható DNS-romboló fertőtlenítőszert.Kiömlések esetén forduljon a gyártóhoz további tisztítási tanácsokért.Ha a gyártó utasításai lehetővé teszik, a pipettákat rutinszerűen sterilizálni kell autoklávban.Ha a pipettákat nem lehet autoklávozni, elegendő megtisztítani őket 10%-os nátrium-hipoklorittal (amit steril vízzel alaposan le kell törölni) vagy a kereskedelemben kapható DNS-romboló dekontaminálószerrel, majd UV-sugárzással.

A nagy százalékos nátrium-hipoklorittal végzett tisztítás végül károsíthatja a pipetta műanyagait és fémeit, ha rendszeresen végzik.először ellenőrizze a gyártó ajánlásait.Minden berendezést rendszeresen kalibrálni kell a gyártó által javasolt ütemterv szerint.Egy kijelölt személynek kell gondoskodnia a kalibrálási ütemterv betartásáról, a részletes naplók vezetéséről, és a szervizcímkék egyértelmű feltüntetéséről a berendezésen.

3. Használati és tisztítási tanácsok a kijelölt molekulatérhez

Pre-PCR: Reagens aliquot kiosztása / Mastermix előkészítése: Ez legyen a legtisztább a molekuláris kísérletek elkészítéséhez használt helyek közül, és ideális esetben egy kijelölt lamináris áramlási szekrénynek kell lennie UV fénnyel.Minták, extrahált nukleinsavak és amplifikált PCR-termékek nem kezelhetők ezen a területen.Az amplifikációs reagenseket fagyasztóban (vagy hűtőszekrényben, a gyártó ajánlása szerint) kell tárolni, ugyanabban a kijelölt helyen, ideális esetben a lamináris áramlási szekrény vagy a PCR előtti terület mellett.A kesztyűt minden alkalommal cserélni kell, amikor belép a PCR előtti területre vagy a lamináris áramlási szekrénybe.

A PCR előtti területet vagy a lamináris áramlási szekrényt használat előtt és után meg kell tisztítani az alábbiak szerint: Töröljön le minden elemet a szekrényben, pl. pipettákat, hegyes dobozokat, vortex-et, centrifugát, tubustartókat, tollakat stb. 70%-os etanollal vagy kereskedelmi forgalomban lévő DNS-romboló dekontaminálószert, és hagyjuk megszáradni.Zárt munkaterület, pl. lamináris áramlású szekrény esetén a páraelszívót 30 percig tegyük ki UV fénynek.

jegyzet

Ne tegye ki a reagenseket UV fénynek;csak akkor helyezze be őket a szekrénybe, ha az már tiszta.Ha reverz transzkripciós PCR-t végez, az is hasznos lehet, ha a felületeket és a berendezéseket olyan oldattal töröljük le, amely érintkezéskor lebontja az RNázokat.Ez segíthet elkerülni az RNS enzimes lebontásából származó hamis negatív eredményeket.A fertőtlenítés után és a mastermix elkészítése előtt a kesztyűt még egyszer le kell cserélni, majd a szekrény használatra kész.

Pre-PCR: Nukleinsav extrakció/templát hozzáadása:

A nukleinsavat egy másik kijelölt területen kell kivonni és kezelni, külön pipettakészlet, szűrőhegyek, tubustartók, friss kesztyűk, laborköpenyek és egyéb felszerelések használatával. Ez a terület sablonok, vezérlőelemek és trendvonalak hozzáadására is szolgál. mastermix csövek vagy lemezek.Az elemzés alatt álló extrahált nukleinsavminták szennyeződésének elkerülése érdekében ajánlott kesztyűt cserélni a pozitív kontrollok vagy standardok kezelése előtt, és külön pipettakészletet használni.A PCR-reagenseket és az amplifikált termékeket ezen a területen nem szabad pipettázni.A mintákat a kijelölt hűtőszekrényekben vagy fagyasztókban kell tárolni ugyanazon a helyen.A minta munkaterületet ugyanúgy kell megtisztítani, mint a mastermix teret.

Post-PCR: Az amplifikált termék amplifikációja és kezelése

Ez a kijelölt tér az utólagos amplifikációhoz való, és fizikailag el kell különülnie a PCR előtti területektől.Általában termociklereket és valós idejű platformokat tartalmaz, és ideális esetben lamináris áramlási szekrényt kell tartalmaznia az 1. körös PCR termék hozzáadásához a 2. forduló reakciójához, ha egymásba ágyazott PCR-t hajtanak végre.A PCR-reagenseket és az extrahált nukleinsavat nem szabad ezen a területen kezelni, mivel nagy a szennyeződés kockázata.Ezen a területen kell lennie egy külön kesztyűkészletnek, laboratóriumi köpenynek, tányér- és tubustartóknak, pipettáknak, szűrőhegyeknek, tartályoknak és egyéb felszereléseknek.A csöveket felnyitás előtt centrifugálni kell.A minta munkaterületet ugyanúgy kell megtisztítani, mint a mastermix teret.

Post-PCR: Termékelemzés

Ez a helyiség termékfelderítő berendezések, pl. gélelektroforézis tartályok, tápegységek, UV átvilágító és géldokumentációs rendszer elhelyezésére szolgál.Ezen a területen külön kesztyűkészlettel, laborköpennyel, tányér- és tubustartókkal, pipettákkal, szűrőhegyekkel, tartályokkal és egyéb felszerelésekkel kell rendelkeznie.Más reagensek nem vihetők be erre a területre, kivéve a töltőfestéket, a molekuláris markert és az agarózgélt, valamint a pufferkomponenseket.A minta munkaterületet ugyanúgy kell megtisztítani, mint a mastermix teret.

Fontos jegyzet

Ideális esetben a PCR előtti helyiségekbe nem szabad ugyanazon a napon belépni, ha a PCR utáni helyiségekben már végeztek munkát.Ha ez teljesen elkerülhetetlen, először alaposan mosson kezet, és speciális laborköpenyt viseljen a helyiségekben.Laboratóriumi könyveket és papírmunkát nem szabad bevinni a PCR előtti helyiségekbe, ha azokat a PCR utáni helyiségekben használták;ha szükséges, készítsen másolatot a protokollokról/mintaazonosítókról stb.

4. Általános molekuláris biológiai tanácsok

Az assay gátlásának elkerülése érdekében használjon púdermentes kesztyűt.A helyes pipettázási technika kulcsfontosságú a szennyeződés csökkentésében.A nem megfelelő pipettázás folyadékok kifröccsenését és aeroszolok képződését okozhatja.A helyes pipettázás bevált gyakorlatai a következő linkeken találhatók: Gilson pipettázási útmutató, Anachem pipettázási technikával kapcsolatos videók, Centrifuga csöveket kinyitás előtt, és óvatosan nyissa ki, hogy elkerülje a fröccsenést.Használat után azonnal zárja le a csöveket, hogy elkerülje a szennyeződések bejutását.

Több reakció végrehajtásakor készítsen egy általános reagenseket (pl. víz, dNTP-k, puffer, primerek és enzim) tartalmazó mastermixet, hogy minimalizálja a reagenstranszferek számát és csökkentse a szennyeződés veszélyét.Javasoljuk, hogy a mastermixet jégre vagy hideg tömbre állítsa fel.A Hot Start enzim használata csökkentheti a nem specifikus termékek termelését.A fluoreszcens szondákat tartalmazó reagenseket óvja a fénytől a lebomlás elkerülése érdekében.

5. Belső ellenőrzések

Tartalmazzon jól jellemzett, megerősített pozitív és negatív kontrollokat, valamint egy templát nélküli kontrollt minden reakcióban, és egy többpontos titrált trendvonalat a kvantitatív reakciókhoz.A pozitív kontroll nem lehet olyan erős, hogy szennyeződési kockázatot jelentsen.A nukleinsav-extrakció végrehajtásakor vegye figyelembe a pozitív és negatív extrakciós kontrollokat.

Javasoljuk, hogy minden területen világos utasításokat helyezzenek el, hogy a felhasználók tisztában legyenek a magatartási szabályokkal.A klinikai mintákban nagyon alacsony DNS- vagy RNS-szintet észlelő diagnosztikai laboratóriumok esetleg azt a további biztonsági intézkedést kívánnak alkalmazni, hogy külön légkezelő rendszereket helyezzenek el, amelyek a PCR előtti helyiségekben enyhén pozitív, a PCR utáni helyiségekben pedig enyhén negatív légnyomásúak.

Végül hasznos a minőségbiztosítási (QA) terv kidolgozása.Egy ilyen tervnek tartalmaznia kell a reagens törzskészletek és a munkakészletek listáját, a készletek és reagensek tárolására vonatkozó szabályokat, az ellenőrzési eredmények jelentését, a személyzet képzési programjait, a hibaelhárítási algoritmusokat és szükség esetén a javító intézkedéseket.

6. Bibliográfia

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. 3. fejezet: A qPCR laboratórium felállítása.Útmutató a rekreációs vizek teszteléséhez az USEPA qPCR 1611 módszerrel. Lansing-Michigan State University.

Public Health England, NHS.Az Egyesült Királyság mikrobiológiai vizsgálatok szabványai: Jó laboratóriumi gyakorlat molekuláris amplifikációs vizsgálatok végzésekor).Minőségi útmutató.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. PCR laboratórium felállítása.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Centrifugák rutin karbantartása: centrifugák, rotorok és adapterek tisztítása, karbantartása és fertőtlenítése (14. sz. fehér könyv).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana lakóautó, Wallis CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) a diagnosztikai laboratóriumokban használt molekuláris alapú vizsgálatokhoz, In: Akyar I, szerkesztő.A minőség-ellenőrzés széles spektruma.Rijeka, Horvátország: Intech;2011: 29–52.