Metòd deteksyon molekilè gen kapasite pou pwodwi yon gwo volim asid nikleyik atravè anplifikasyon kantite tras yo te jwenn nan echantiyon yo.Pandan ke sa a se benefisye pou pèmèt deteksyon sansib, li tou entwodui posibilite pou kontaminasyon atravè gaye ayewosol anplifikasyon nan anviwònman an laboratwa.Lè w ap fè eksperyans, yo ka pran mezi pou evite kontaminasyon reyaktif, ekipman laboratwa ak espas ban, paske kontaminasyon sa a ka jenere rezilta fo-pozitif (oswa fo-negatif).

Pou ede diminye chans pou kontaminasyon, yo ta dwe egzèse Bon Pratik laboratwa tout tan.Espesyalman, yo ta dwe pran prekosyon konsènan pwen sa yo:

1. Manyen reyaktif
2. Òganizasyon espas travay ak ekipman
3. Sèvi ak ak netwayaj konsèy pou espas molekilè deziyen an
4. Konsèy jeneral byoloji molekilè
5. Kontwòl entèn yo
6. Bibliyografi

1. Manyen reyaktif

Yon ti tan santrifije tib reyaktif anvan ouvèti pou evite jenerasyon aerosol.Reyaktif aliquot pou evite plizyè friz-dekonjle ak kontaminasyon estòk mèt.Etikèt klèman ak dat tout reyaktif ak tib reyaksyon yo epi kenbe mòso bwa reyaktif yo ak nimewo pakèt yo itilize nan tout eksperyans.Pipete tout reyaktif ak echantiyon yo sèvi ak pwent filtre.Anvan ou achte, li rekòmande pou konfime ak manifakti a ke pwent yo filtre anfòm mak la nan pipèt yo dwe itilize.

2. Òganizasyon espas travay ak ekipman

Espas travay yo ta dwe òganize pou asire ke koule nan travay fèt nan yon direksyon, soti nan zòn pwòp (pre-PCR) nan zòn sal (post-PCR).Prekosyon jeneral sa yo ap ede diminye chans pou kontaminasyon.Gen chanm ki deziyen separe, oswa omwen zòn fizikman separe, pou: preparasyon mastermix, ekstraksyon asid nikleyik ak adisyon modèl ADN, anplifikasyon ak manyen pwodwi anplifye, ak analiz pwodwi, pa egzanp, elektwoforèz jèl.

Nan kèk anviwònman, gen 4 chanm separe difisil.Yon opsyon posib men mwens dezirab se fè preparasyon mastermix la nan yon zòn ki genyen ladan l, pa egzanp yon kabinè koule laminar.Nan ka anplifikasyon PCR nich, preparasyon mastermix la pou reyaksyon dezyèm tou yo ta dwe prepare nan zòn 'pwòp' pou preparasyon mastermix, men inokulasyon an ak pwodwi PCR prensipal la ta dwe fèt nan chanm anplifikasyon, e si sa posib. nan yon zòn devwe pou kenbe (pa egzanp, yon kabinè koule laminar).

Chak chanm/zòn bezwen yon seri separe pipèt ki make byen klè, pwent filtre, etajè tib, toubiyon, santrifujeur (si sa nesesè), plim, reyaktif laboratwa jenerik, rad laboratwa ak bwat gan ki pral rete nan estasyon travay respektif yo.Yo dwe lave men yo epi chanje gan ak rad laboratwa lè w ap deplase ant zòn yo deziyen yo.Reyaktif ak ekipman pa ta dwe deplase soti nan yon zòn sal nan yon zòn pwòp.Si yon ka ekstrèm rive kote yon reyaktif oswa yon moso nan ekipman bezwen deplase bak, li dwe premye dekontamine ak 10% ipoklorit sodyòm, ki te swiv pa yon siye desann ak dlo esteril.

Remak

Solisyon ipoklorit sodyòm 10% la dwe prepare fre chak jou.Lè yo itilize pou dekontaminasyon, yo ta dwe respekte yon tan kontak minimòm de 10 minit.
Altènativman, pwodwi komèsyal ki disponib ki valide kòm dekontaminan sifas ki detwi ADN yo ka itilize si rekòmandasyon sekirite lokal yo pa pèmèt itilizasyon ipoklorit sodyòm oswa si ipoklorit sodyòm pa apwopriye pou dekontamine pati metalik ekipman yo.

Idealman, anplwaye yo ta dwe respekte ethos travay inidiresyonèl la epi yo pa ale nan zòn sal (post-PCR) tounen nan zòn pwòp (pre-PCR) nan menm jou a.Sepandan, ka gen okazyon lè sa a se inevitab.Lè okazyon sa a rive, pèsonèl yo dwe pran swen pou byen lave men yo, chanje gan, sèvi ak rad laboratwa yo deziyen an epi yo pa prezante okenn ekipman yo pral vle retire nan chanm nan ankò, tankou liv laboratwa.Mezi kontwòl sa yo ta dwe mete aksan sou nan fòmasyon anplwaye sou metòd molekilè.

Apre w fin itilize yo, yo ta dwe netwaye espas ban yo ak 10% ipoklorit sodyòm (apre ak dlo esteril pou retire rezidyèl klowòks), 70% etanòl, oswa yon dekontaminan ki valide ki disponib nan komès ki detwi ADN.Idealman, lanp iltra-vyolèt (UV) yo ta dwe ekipe pou pèmèt dekontaminasyon pa iradyasyon.Sepandan, itilizasyon lanp UV yo ta dwe limite nan zòn k ap travay ki fèmen, tankou kabinèt sekirite, yo nan lòd yo limite ekspoze UV ​​anplwaye laboratwa a.Tanpri respekte enstriksyon manifakti a pou swen, vantilasyon ak netwayaj lanp UV pou asire ke lanp rete efikas.

Si w ap itilize 70% etanòl olye pou yo ipoklorit sodyòm, yo pral bezwen iradyasyon ak limyè UV pou konplete dekontaminasyon an.
Pa netwaye toubiyon an ak santrifuje ak ipoklorit sodyòm;olye de sa, siye ak etanòl 70% epi ekspoze a limyè UV, oswa itilize yon dekontaminan komèsyal ki detwi ADN.Pou devèsman, tcheke avèk manifakti a pou plis konsèy netwayaj.Si enstriksyon manifakti yo pèmèt li, pipèt yo ta dwe regilyèman esterilize pa otoklav.Si pipèt pa ka otoklav, li ta dwe sifi pou netwaye yo ak 10% ipoklorit sodyòm (apre pa yon bon siye ak dlo esteril) oswa ak yon dekontaminan komèsyal ki detwi ADN ki te swiv pa ekspoze UV.

Netwayaj ak ipoklorit sodyòm ki gen gwo pousantaj ka evantyèlman domaje plastik pipèt ak metal si li fè sou yon baz regilye;tcheke rekòmandasyon manifakti a an premye.Tout ekipman yo dwe kalibre regilyèman dapre orè manifakti-rekòmandasyon an.Yon moun ki deziyen ta dwe responsab pou asire ke yo respekte orè kalibrasyon an, yo kenbe mòso detaye yo, ak etikèt sèvis yo byen klè sou ekipman yo.

3. Sèvi ak ak netwayaj konsèy pou espas molekilè deziyen an

Pre-PCR: Reyaktif aliquoting / preparasyon mastermix: Sa a ta dwe pi pwòp nan tout espas yo itilize pou preparasyon an nan eksperyans molekilè epi yo ta dwe depreferans yon kabinè deziyen koule laminè ekipe ak yon limyè UV.Echantiyon, asid nikleyik ekstrè ak pwodwi PCR anplifye pa dwe okipe nan zòn sa a.Reyaktif anplifikasyon yo ta dwe kenbe nan yon frizè (oswa frijidè, dapre rekòmandasyon manifakti) nan menm espas deziyen an, depreferans akote kabinè a koule laminar oswa zòn pre-PCR.Gan yo ta dwe chanje chak fwa lè w ap antre nan zòn pre-PCR la oswa kabinè koule laminar.

Zòn pre-PCR la oswa kabinè koule laminè a ta dwe netwaye anvan ak apre w fin itilize jan sa a: Siye tout atik ki nan kabinè a, tankou pipèt, bwat pwent, toubiyon, santrifijeur, etajè tib, plim, elatriye ak 70% etanòl oswa yon dekontaminan komèsyal ki detwi ADN, epi kite seche.Nan ka yon zòn k ap travay fèmen, tankou yon kabinè koule laminar, ekspoze kapo a nan limyè UV pou 30 minit.

Remak

Pa ekspoze reyaktif nan limyè UV;sèlman deplase yo nan kabinè a yon fwa li pwòp.Si w ap fè PCR transcription ranvèse, li ka itil tou pou siye sifas ak ekipman ak yon solisyon ki kraze RNases sou kontak.Sa a ka ede evite rezilta fo-negatif nan degradasyon anzim nan RNA.Apre dekontaminasyon ak anvan prepare mastermix la, gan yo ta dwe chanje yon fwa ankò, ak Lè sa a, kabinè a pare pou itilize.

Pre-PCR: Ekstraksyon asid nikleik / adisyon modèl:

Asid nikleik dwe ekstrè ak okipe nan yon dezyèm zòn ki deziyen, lè l sèvi avèk yon seri separe nan pipèt, konsèy filtre, etajè tib, gan fre, rad laboratwa ak lòt ekipman. Zòn sa a se tou pou adisyon a nan modèl, kontwòl ak tandans nan la. tib mastermix oswa plak.Pou evite kontaminasyon echantiyon asid nikleyik yo analize yo, li rekòmande pou chanje gan anvan ou manyen kontwòl pozitif oswa estanda epi sèvi ak yon seri pipèt separe.Reyaktif PCR ak pwodwi anplifye pa dwe pipete nan zòn sa a.Echantiyon yo ta dwe estoke nan frijidè deziyen oswa frizè nan menm zòn nan.Espas travay echantiyon an ta dwe netwaye menm jan ak espas mastermix la.

Post-PCR: Anplifikasyon ak manyen pwodwi anplifye a

Espas sa a deziyen se pou pwosesis apre anplifikasyon e li ta dwe fizikman separe ak zòn pre-PCR yo.Li anjeneral gen thermocyclers ak platfòm an tan reyèl, e depreferans ta dwe gen yon kabinè koule laminar pou ajoute pwodwi PCR wonn 1 nan reyaksyon an wonn 2, si PCR enbrike yo te fèt.Reyaktif PCR ak asid nikleyik ekstrè pa dwe okipe nan zòn sa a paske risk pou kontaminasyon an wo.Zòn sa a ta dwe gen yon seri gan separe, rad laboratwa, etajè plak ak tib, pipèt, pwent filtre, posode ak lòt ekipman.Tib yo dwe santrifuje anvan ouvèti.Espas travay echantiyon an ta dwe netwaye menm jan ak espas mastermix la.

Post-PCR: Analiz pwodwi

Sal sa a se pou ekipman deteksyon pwodwi, pa egzanp tank elèktroforèz jèl, pake pouvwa, UV transilluminator ak sistèm dokimantasyon jèl la.Zòn sa a ta dwe gen seri separe gan, rad laboratwa, etajè plak ak tib, pipèt, pwent filtre, posode ak lòt ekipman.Pa gen okenn lòt reyaktif yo ka pote nan zòn sa a, eksepte loading lank, makè molekilè ak jèl agarose, ak konpozan tanpon.Espas travay echantiyon an ta dwe netwaye menm jan ak espas mastermix la.

Nòt enpòtan

Idealman, yo pa ta dwe antre nan chanm pre-PCR yo nan menm jou a si travay yo te deja fèt nan chanm apre-PCR yo.Si sa a se konplètman inevitab, asire ke men yo premye lave byen epi ke rad laboratwa espesifik yo mete nan chanm yo.Liv laboratwa ak dokiman yo pa dwe antre nan chanm pre-PCR yo si yo te itilize yo nan chanm apre PCR yo;si sa nesesè, pran kopi enprime pwotokòl / echantiyon ID, elatriye.

4. Konsèy jeneral byoloji molekilè

Sèvi ak gan san poud pou evite anpèchman tès.Teknik pipèt kòrèk se esansyèl pou diminye kontaminasyon.Pipèt kòrèk ka lakòz pwojeksyon lè yo bay likid ak kreyasyon ayewosòl.Ou ka jwenn bon pratik pou pipètaj kòrèk sou lyen sa yo: Gilson gid pou pipette, videyo teknik pipèt Anachem, Tib santrifijye anvan ou louvri, epi ouvri yo ak anpil atansyon pou evite pwojeksyon.Fèmen tib imedyatman apre yo fin itilize pou evite entwodiksyon kontaminan yo.

Lè w ap fè plizyè reyaksyon, prepare yon sèl mastermix ki gen reyaktif komen (pa egzanp dlo, dNTP, tanpon, primè ak anzim) pou minimize kantite transfè reyaktif yo epi redwi menas kontaminasyon an.Li rekòmande yo mete mastermix la sou glas oswa yon blòk frèt.Sèvi ak yon anzim Hot Start ka ede diminye pwodiksyon pwodwi ki pa espesifik.Pwoteje reyaktif ki gen sond fliyoresan soti nan limyè pou evite degradasyon.

5. Kontwòl entèn yo

Mete kontwòl ki byen karakterize, ki konfime pozitif ak negatif, ansanm ak yon kontwòl san modèl nan tout reyaksyon, ak yon liy tandans milti-pwen pou reyaksyon quantitative.Kontwòl pozitif la pa ta dwe tèlman fò ke li poze yon risk kontaminasyon.Mete kontwòl ekstraksyon pozitif ak negatif lè w ap fè ekstraksyon asid nikleyik.

Li rekòmande pou yo afiche enstriksyon klè nan chak zòn yo pou itilizatè yo konnen règ konduit yo.Laboratwa dyagnostik ki detekte nivo ki ba anpil ADN oswa RNA nan echantiyon klinik yo ka vle adopte mezi sekirite adisyonèl pou gen sistèm separe lè manyen ak presyon lè yon ti kras pozitif nan chanm yo pre-PCR ak presyon lè yon ti kras negatif nan chanm yo apre PCR.

Anfen, devlope yon plan asirans kalite (QA) itil.Yon plan konsa ta dwe gen ladan lis aksyon mèt reyaktif ak aksyon k ap travay, règ pou estoke twous ak reyaktif, rapò rezilta kontwòl, pwogram fòmasyon anplwaye yo, algoritm depanaj, ak aksyon ratrapaj lè sa nesesè.

6. Bibliyografi

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Chapit 3: Mete kanpe yon laboratwa qPCR.Yon dokiman gid pou teste dlo lwazi lè l sèvi avèk USEPA qPCR metòd 1611. Lansing-Michigan State University.

Sante Piblik Angletè, NHS.Estanda UK pou envestigasyon mikrobyoloji: Bon Pratik laboratwa lè w ap fè tès anplifikasyon molekilè).Oryantasyon Kalite.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Mete kanpe yon laboratwa PCR.Fwad Spring Harb Pwotok.2007;7.

Schroeder S 2013. Antretyen woutin nan santrifujeur: netwayaj, antretyen ak dezenfeksyon nan santrifujeur, rotor ak adaptè (Blann papye No 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Bon Pratik laboratwa klinik (GCLP) pou tès ki baze sou molekilè yo itilize nan laboratwa dyagnostik, Nan: Akyar I, editè.Wide spectre nan kontwòl kalite.Rijeka, Kwoasi: Intech;2011: 29–52.