Molekularne detekcijske metode imaju sposobnost proizvesti veliki volumen nukleinske kiseline putem amplifikacije tragova količina pronađenih u uzorcima.Iako je to korisno za omogućavanje osjetljive detekcije, također uvodi mogućnost kontaminacije putem širenja aerosola za pojačavanje u laboratorijskom okruženju.Prilikom izvođenja pokusa mogu se poduzeti mjere kako bi se izbjegla kontaminacija reagensa, laboratorijske opreme i prostora stolova, budući da takva kontaminacija može generirati lažno pozitivne (ili lažno negativne) rezultate.

Kako bi se smanjila vjerojatnost kontaminacije, uvijek se treba pridržavati dobre laboratorijske prakse.Konkretno, potrebno je poduzeti mjere opreza u vezi sa sljedećim točkama:

1. Rukovanje reagensima
2. Organizacija radnog prostora i opreme
3. Savjeti za korištenje i čišćenje za naznačeni molekularni prostor
4. Opći savjeti iz molekularne biologije
5. Interne kontrole
6. Bibliografija

1. Rukovanje reagensima

Nakratko centrifugirajte epruvete s reagensima prije otvaranja kako biste izbjegli stvaranje aerosola.Alikvotni reagensi kako bi se izbjeglo višestruko zamrzavanje-odmrzavanje i kontaminacija matičnih zaliha.Jasno označite i datirajte sve epruvete s reagensima i reakcijama i vodite zapisnike serija reagensa i brojeva serija korištenih u svim eksperimentima.Pipetirajte sve reagense i uzorke pomoću vrhova filtera.Prije kupnje, preporučljivo je provjeriti kod proizvođača odgovaraju li vrhovi filtera marki pipete koja će se koristiti.

2. Organizacija radnog prostora i opreme

Radni prostor treba organizirati tako da se tijek rada odvija u jednom smjeru, od čistih područja (pre-PCR) do prljavih područja (post-PCR).Sljedeće opće mjere opreza pomoći će smanjiti mogućnost kontaminacije.Imajte odvojene određene prostorije ili barem fizički odvojena područja za: pripremu glavne mješavine, ekstrakciju nukleinske kiseline i dodavanje šablone DNK, umnožavanje i rukovanje umnoženim proizvodom i analizu proizvoda, npr. elektroforezu u gelu.

U nekim je okruženjima teško imati 4 odvojene sobe.Moguća, ali manje poželjna opcija je priprema glavne mješavine u zatvorenom prostoru, npr. u komori s laminarnim protokom.U slučaju ugniježđene PCR amplifikacije, pripremu glavne mješavine za drugu rundu reakcije treba pripremiti u 'čistom' prostoru za pripremu glavne mješavine, ali inokulaciju s primarnim PCR produktom treba obaviti u prostoriji za amplificiranje, i ako je moguće u namjenskom prostoru za zadržavanje (npr. kabinet s laminarnim protokom).

Svaka prostorija/područje treba zaseban set jasno označenih pipeta, vrhova filtera, nosača epruveta, vorteksa, centrifuga (ako je relevantno), olovaka, generičkih laboratorijskih reagensa, laboratorijskih kuta i kutija s rukavicama koje će ostati na njihovim radnim stanicama.Ruke se moraju prati, a rukavice i laboratorijske kute mijenjati kada se krećete između označenih područja.Reagensi i oprema ne smiju se premještati iz prljavog područja u čisto područje.Ako dođe do ekstremnog slučaja kada reagens ili dio opreme treba pomaknuti unatrag, prvo se mora dekontaminirati s 10% natrijevim hipokloritom, nakon čega slijedi brisanje sterilnom vodom.

Bilješka

10% otopina natrijevog hipoklorita mora se svakodnevno pripremati svježom.Kada se koristi za dekontaminaciju, treba se pridržavati minimalnog vremena kontakta od 10 minuta.
Alternativno, mogu se koristiti komercijalno dostupni proizvodi koji su validirani kao površinski dekontaminanti koji uništavaju DNK ako lokalne sigurnosne preporuke ne dopuštaju upotrebu natrijevog hipoklorita ili ako natrijev hipoklorit nije prikladan za dekontaminaciju metalnih dijelova opreme.

U idealnom slučaju, osoblje bi se trebalo pridržavati etosa jednosmjernog tijeka rada i ne vraćati se iz prljavih područja (nakon PCR-a) u čista područja (prije PCR-a) istog dana.Međutim, mogu postojati prilike kada je to neizbježno.Kada se pojavi takva prilika, osoblje mora paziti da temeljito opere ruke, promijeni rukavice, koristi za to predviđenu laboratorijsku kutu i ne smije ponovno unositi nikakvu opremu koju će htjeti iznijeti iz sobe, poput laboratorijskih knjiga.Takve mjere kontrole treba naglasiti u obuci osoblja o molekularnim metodama.

Nakon upotrebe, prostore na klupama treba očistiti s 10%-tnim natrijevim hipokloritom (a zatim sterilnom vodom za uklanjanje ostataka izbjeljivača), 70%-tnim etanolom ili validiranim komercijalno dostupnim dekontaminantom koji uništava DNK.Idealno bi bilo da se ugrade ultraljubičaste (UV) svjetiljke kako bi se omogućila dekontaminacija zračenjem.Međutim, korištenje UV lampi trebalo bi ograničiti na zatvorene radne prostore, npr. sigurnosne ormare, kako bi se ograničilo izlaganje laboratorijskog osoblja UV zračenju.Pridržavajte se uputa proizvođača za njegu, ventilaciju i čišćenje UV lampe kako biste osigurali učinkovitost lampe.

Ako koristite 70% etanol umjesto natrijevog hipoklorita, bit će potrebno zračenje UV svjetlom kako bi se dovršila dekontaminacija.
Nemojte čistiti vorteks i centrifugu natrijevim hipokloritom;umjesto toga, obrišite 70% etanolom i izložite UV svjetlu ili upotrijebite komercijalno sredstvo za dekontaminaciju koje uništava DNK.U slučaju prolijevanja, obratite se proizvođaču za dodatne savjete o čišćenju.Ako upute proizvođača to dopuštaju, pipete treba rutinski sterilizirati u autoklavu.Ako se pipete ne mogu sterilizirati u autoklavu, trebalo bi biti dovoljno očistiti ih 10%-tnim natrijevim hipokloritom (nakon čega slijedi temeljito brisanje sterilnom vodom) ili komercijalnim sredstvom za dekontaminaciju koje uništava DNK nakon čega slijedi UV izlaganje.

Čišćenje natrijevim hipokloritom s visokim postotkom može eventualno oštetiti plastiku i metale pipete ako se provodi redovito;prvo provjerite preporuke proizvođača.Svu opremu potrebno je redovito kalibrirati prema rasporedu koji preporučuje proizvođač.Određena osoba trebala bi biti zadužena za osiguranje pridržavanja rasporeda kalibracije, vođenje detaljnih zapisa i jasno prikazane servisne oznake na opremi.

3. Savjeti za korištenje i čišćenje za naznačeni molekularni prostor

Prije PCR-a: alikvotiranje reagensa/priprema glavne mješavine: ovo bi trebao biti najčišći od svih prostora koji se koriste za pripremu molekularnih eksperimenata i idealno bi trebao biti određeni ormar s laminarnim protokom opremljen UV svjetlom.Uzorcima, ekstrahiranom nukleinskom kiselinom i umnoženim PCR proizvodima ne smije se rukovati u ovom području.Reagense za pojačanje treba držati u zamrzivaču (ili hladnjaku, prema preporukama proizvođača) u istom određenom prostoru, idealno pored ormara s laminarnim protokom ili područja prije PCR-a.Rukavice treba promijeniti svaki put kada se uđe u pred-PCR područje ili u kabinet laminarnog protoka.

Područje prije PCR-a ili ormar s laminarnim protokom treba očistiti prije i nakon upotrebe na sljedeći način: Obrišite sve predmete u ormariću, npr. pipete, kutije za savjete, vortex, centrifuge, stalak za epruvete, olovke itd. sa 70% etanolom ili komercijalno sredstvo za dekontaminaciju koje uništava DNK i ostavite da se osuši.U slučaju zatvorenog radnog prostora, npr. kabineta s laminarnim protokom, izložite napu UV svjetlu 30 minuta.

Bilješka

Nemojte izlagati reagense UV svjetlu;premjestite ih u ormarić tek kada je čist.Ako provodite PCR reverznom transkripcijom, također može biti od pomoći obrisati površine i opremu otopinom koja razgrađuje RNaze pri kontaktu.To može pomoći u izbjegavanju lažno negativnih rezultata enzimske razgradnje RNK.Nakon dekontaminacije, a prije pripreme mastermixa potrebno je još jednom promijeniti rukavice i tada je kabinet spreman za korištenje.

Pre-PCR: ekstrakcija nukleinske kiseline/dodavanje šablona:

Nukleinska kiselina mora se ekstrahirati i rukovati njome u drugom određenom području, korištenjem zasebnog seta pipeta, vrhova filtera, nosača epruveta, svježih rukavica, laboratorijskih kuta i druge opreme. Ovo područje je također za dodavanje predloška, ​​kontrola i linija trenda mastermix cijevi ili ploče.Kako bi se izbjegla kontaminacija ekstrahiranih uzoraka nukleinske kiseline koji se analiziraju, preporuča se promijeniti rukavice prije rukovanja pozitivnim kontrolama ili standardima i koristiti zaseban set pipeta.PCR reagensi i amplificirani proizvodi ne smiju se pipetirati u ovom području.Uzorke treba čuvati u za to predviđenim hladnjacima ili zamrzivačima u istom prostoru.Radni prostor za uzorke treba očistiti na isti način kao i prostor za mastermix.

Post-PCR: Umnožavanje i rukovanje umnoženim proizvodom

Ovaj određeni prostor služi za procese nakon amplifikacije i trebao bi biti fizički odvojen od područja prije PCR-a.Obično sadrži termociklere i platforme u stvarnom vremenu, a idealno bi trebalo imati kabinet s laminarnim protokom za dodavanje produkta PCR kruga 1 u reakciju kruga 2, ako se provodi ugniježđeni PCR.PCR reagensima i ekstrahiranom nukleinskom kiselinom ne smije se rukovati u ovom području jer je rizik od kontaminacije visok.Ovo područje treba imati zaseban set rukavica, laboratorijskih kuta, stalka za pločice i epruvete, pipeta, vrhova filtera, spremnika i druge opreme.Epruvete se moraju centrifugirati prije otvaranja.Radni prostor za uzorke treba očistiti na isti način kao i prostor za mastermix.

Post-PCR: Analiza proizvoda

Ova prostorija je za opremu za detekciju proizvoda, npr. spremnike za elektroforezu gela, agregate, UV transiluminator i sustav dokumentiranja gela.Ovo područje treba imati odvojene setove rukavica, laboratorijske kute, police za ploče i epruvete, pipete, vrhove filtera, spremnike i drugu opremu.Nikakvi drugi reagensi ne mogu se unijeti u ovo područje, osim boje za punjenje, molekularnog markera i agaroznog gela te komponenti pufera.Radni prostor za uzorke treba očistiti na isti način kao i prostor za mastermix.

Važna nota

U idealnom slučaju, u prostorije za prije PCR ne bi trebalo ulaziti isti dan ako je rad već obavljen u sobama za post-PCR.Ako je to potpuno neizbježno, pobrinite se da se prvo temeljito operu ruke i da se u sobama nose posebne laboratorijske kute.Laboratorijske knjige i papirologija ne smiju se unositi u prostorije prije PCR-a ako su korišteni u prostorijama nakon PCR-a;ako je potrebno, uzmite dvostruke ispise protokola/ID uzoraka itd.

4. Opći savjeti iz molekularne biologije

Koristite rukavice bez pudera kako biste izbjegli inhibiciju analize.Ispravna tehnika pipetiranja najvažnija je za smanjenje kontaminacije.Neispravno pipetiranje može rezultirati prskanjem prilikom ispuštanja tekućina i stvaranjem aerosola.Dobru praksu za ispravno pipetiranje možete pronaći na sljedećim poveznicama: Gilson vodič za pipetiranje, video zapisi tehnike pipetiranja Anachem, Epruvete za centrifugiranje prije otvaranja i pažljivo ih otvorite kako biste izbjegli prskanje.Zatvorite epruvete odmah nakon upotrebe kako biste izbjegli unošenje kontaminanata.

Prilikom izvođenja višestrukih reakcija, pripremite jednu glavnu mješavinu koja sadrži uobičajene reagense (npr. vodu, dNTP, pufer, početnice i enzime) kako biste smanjili broj prijenosa reagensa i smanjili opasnost od kontaminacije.Preporuča se postaviti mastermix na led ili hladni blok.Korištenje enzima Hot Start može pomoći u smanjenju proizvodnje nespecifičnih proizvoda.Zaštitite reagense koji sadrže fluorescentne sonde od svjetlosti kako biste izbjegli razgradnju.

5. Interne kontrole

Uključite dobro karakterizirane, potvrđene pozitivne i negativne kontrole, zajedno s kontrolom bez predloška u svim reakcijama i titriranom linijom trenda u više točaka za kvantitativne reakcije.Pozitivna kontrola ne smije biti toliko jaka da predstavlja rizik od kontaminacije.Uključite pozitivne i negativne kontrole ekstrakcije kada izvodite ekstrakciju nukleinske kiseline.

Preporuča se postaviti jasne upute u svakom od područja kako bi korisnici bili upoznati s pravilima ponašanja.Dijagnostički laboratoriji koji otkrivaju vrlo niske razine DNA ili RNA u kliničkim uzorcima možda će htjeti usvojiti dodatnu sigurnosnu mjeru posjedovanja zasebnih sustava za rukovanje zrakom s blago pozitivnim tlakom zraka u prostorijama prije PCR-a i blago negativnim tlakom zraka u prostorijama nakon PCR-a.

Na kraju, od pomoći je razvijanje plana osiguranja kvalitete (QA).Takav plan trebao bi uključivati ​​popise glavnih zaliha reagensa i radnih zaliha, pravila za pohranjivanje kompleta i reagensa, izvješćivanje o rezultatima kontrole, programe obuke osoblja, algoritme za rješavanje problema i korektivne radnje po potrebi.

6. Bibliografija

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Poglavlje 3: Postavljanje qPCR laboratorija.Dokument sa smjernicama za testiranje rekreacijskih voda korištenjem USEPA qPCR metode 1611. Lansing-Michigan State University.

Javno zdravstvo Engleske, NHS.UK standardi za mikrobiološka ispitivanja: Dobra laboratorijska praksa pri izvođenju testova molekularne amplifikacije).Smjernice za kvalitetu.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Postavljanje PCR laboratorija.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Redovno održavanje centrifuga: čišćenje, održavanje i dezinfekcija centrifuga, rotora i adaptera (Bijela knjiga br. 14).Hamburg: Eppendorf;2013.

Viana RV, Wallis CL.Dobra klinička laboratorijska praksa (GCLP) za molekularne testove koji se koriste u dijagnostičkim laboratorijima, U: Akyar I, urednik.Široki spektar kontrole kvalitete.Rijeka, Hrvatska: Intech;2011: 29–52.